Научная статья на тему 'Технологические аспекты производства бифидумбактерина'

Технологические аспекты производства бифидумбактерина Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

1868
260
Поделиться
Ключевые слова
ДИСБАКТЕРИОЗ / бифидумбактерин / технология / КАПСУЛЫ / ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ / dysbacteriosis / bifidumbacterin / technology / Capsules / drug forms

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Демешева М. И., Мезенцева Л. Н., Лимарева Т. Д., Князюк Е. В.

Изучена закономерность развития популяции штамма Bifidobacterium bifidum 1. Разработан состав и способ получения питательной среды, содержащей соевый бульон и дрожжевой аутолизат. Разработан способ получения ацидорезистентной лиофилизированной биомассы бифидобактерий, иммобилизованной на геле алюминия гидроксида, для использования в технологии дозированных порошков. Экспериментально установлено, что оптимальным наполнителем является лактоза, влагорегулятором аэросил, позволяющие получить однородную смесь для наполнения. Результаты проведенных экспериментов использовали при разработке технологических схем производства дозированных порошков бифидумбактерина в пакетах и капсулах.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Демешева М. И., Мезенцева Л. Н., Лимарева Т. Д., Князюк Е. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Mechanism of development of bacteria strain of Bifidobacterium bifidum 1 was investigated. Composition and method to prepare the nutrient medium consisting of soya broth and yeast autolysate as well as method to prepare acid-fast frozen-dried biomass of bifidobacterium immobilized on aluminium hydroxide gel were developed. Optimal stuff was experimentally established to be lactose, humidistat to be aerosil which allow to obtain homogeneous mixture for filling.

Текст научной работы на тему «Технологические аспекты производства бифидумбактерина»

СИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ № 22009 (выпуск 2)

УДК 615.453.42:579.873.13

М.И. Демешева, Л.Н. Мезенцева, Т.Д. Лимарева, Е.В. Князюк

E-mail: dem @virion.tomsknet.ru

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОИЗВОДСТВА БИФИДУМБАКТЕРИНА

Филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ г Томск «НПО «Вирион»

ВВЕДЕНИЕ

Проблема дисбиотических состояний является актуальной для медицины и требует практических решений, связанных с необходимостью организации различных лекарственных форм пробиотиков.

Одним из эффективных средств коррекции дисбактериозов является препарат бифидумбактерин. В настоящее время этот препарат выпускается в виде лиофильно высушенной биомассы во флаконах, что не в полной мере отвечает требованиям фармацевтического рынка.

Для повышения его потребительских свойств необходима организация производства в виде дозированных порошков и капсул, способ получения которых предполагает использование стабильной по биологическим и технологическим параметрам сухой биомассы бифидобактерий.

Исследования, направленные на разработку и усовершенствование технологии указанных лекарственных форм бифидумбактерина, являются актуальными для производства пробиотиков.

Цель настоящего исследования - разработка технологии и стандартизация пероральных дозированных лекарственных форм на основе сухой биомассы бифидобактерий.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использовали производственный штамм Bifidobacterium bifidum №1, который принадлежит к виду Bifidobacterium bifidum, роду Bifidobacterium, семейству Actinomycetaceae.

Для получения маточной культуры бифидобактерий и контроля биологических показателей использовали среду Блаурокка. При глубинном культивировании бифидобактерий в реакторе применяли питательную среду на основе панкреатического гидролизата казеина и дрожжевого аутолизата (КД-5) и новые варианты производственных сред, изготовленных из соевой муки (ТУ № 9293-001-48386138-99) и дрожжевого аутолизата.

Процесс периодического культивирования бифидобактерий проводили в реакторе типа Биор в условиях рН-статирования при температуре (38±1)°С в атмосфере инертного газа.

Оптическую плотность растущей культуры бифидобактерий в процессах периодического культивирования измеряли при помощи фотоэлектроколориметра ФЭК 56М (зеленый светофильтр, кювета 10 мм).

Длительность фаз роста культуры определяли графически. Показатели роста культуры бифидобактерий - удельную скорость роста, удельную активность кислотообразования, время генерации, величину урожая клеток рассчитывали по формулам, рекомендованным С.М. Ждан-Пушкиной [40].

Гигроскопичность образцов биомассы для кап-сулирования (1 г в бюксе) оценивали по их влагопоглощающей способности, которую изучали гравиметрическим методом в эксикаторах с 77- и 100-процентной относительной влажностью воздуха при температуре (20±2)°С. Бюксы взвешивали с точностью до 0,0001 г для проведения расчетов влаго-поглощения образцов биомассы I3I.

Сыпучесть определяли с помощью прибора ВП-12А. Для оценки сыпучести использовали следующие градации: 3,0-6,5 г/с - удовлетворительная, 2,0-3,0 г/с - допустимая, 1,0-2,0 г/с - плохая,

0,3-1,0 г/с - очень плохая. Насыпную плотность рассчитывали как отношение массы порошка к занимаемому объему при свободном насыпании (кг/м3).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На основании изучения показателей роста Bifidobacterium bifidum построена полулогарифмическая кривая изменения оптической плотности, по которой были установлены основные фазы роста культуры бифидобактерий (рис. 1).

В анализируемых процессах лаг-фаза продолжалась четыре часа и характеризовалась незначительными изменениями оптической плотности. Перед наступлением экспоненциальной фазы между 3 и 4 часами наблюдалось уменьшение оптической плотности, что можно объяснить началом деления мик-

1 2 3 -1 5 А 7 4 А 10 11 12 13 И 15 16 17

ареии, чк

о число клеток по стандарту мутности

—ЧОПИЧЙСГРО к№гсн бифиде*актй0ий

Рис. 1. Изменение концентрации бифидобактерий в процессе культивирования

робных клеток. Фаза экспоненциального роста продолжалась 8-9 часов. Затем мы наблюдали переход культуры в стационарную фазу.

При этом происходит увеличение общего количества бифидобактерий до 10 млрд общего числа клеток в 1 мл. Концентрация жизнеспособных клеток к 12-13 ч. процесса достигала максимума и составляла 4-6 х109 КОЕ/мл, далее наблюдалось падение числа жизнеспособных клеток.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

С учетом выявленных закономерностей роста культуры были проведены исследования по выбору оптимального времени прекращения процесса культивирования. С периодичностью в один час с 9-го -по 16-й час культивирования отбирали пробы, которые подвергали лиофилизации. В полученных образцах определяли количество жизнеспособных клеток до и после высушивания, а также в процессе хранения. Анализ полученных данных выявил существенные различия исследуемых образцов по степени отмирания клеток при хранении.

Установлено, что при длительном хранении наибольшие количества (84-85%) живых клеток сохраняются в образцах, взятых на 12, 13, 14 часах культивирования.

С учетом этого была выбрана оптимальная продолжительность периодического культивирования бифидобактерий - 12-14 часов, позволяющая получать стабильную по биологическим свойствам сухую массу бифидобактерий.

Для накопления биомассы в производстве бифи-думбактерина предусмотрено использование казеиново-дрожжевой среды. Применение в составе питательной среды гидролизата казеина не является оптимальным как по длительности приготовления, так и по себестоимости данного полуфабриката.

Для модификации казеиново-дрожжевой среды была изучена возможность замены гидролизата казеина на соевый бульон, приготовленный из соевой муки.

При разработке соево-дрожжевой питательной среды апробированы различные способы ее приготовления. Введение дрожжевого субстрата в питательную среду производилось тремя способами: в виде дрожжевого аутолизата, приготовленного рег-

ламентированным способом, дрожжевой массы без аутолиза и дрожжевого осадка после аутолиза.

При испытании соево-дрожжевых сред в качестве контроля использовали среду КД №5, а также варианты сред, содержащих монооснову: соевой бульон или дрожжевой аутолизат.

В результате проведенных экспериментов установлено, что достаточно высокими ростовыми свойствами для культуры бифидобактерий обладают питательные среды, содержащие в своем составе как монооснову, так и поликомпонентный субстрат.

При сравнении питательных сред, близких по составу, но различных по технологии приготовления, выяснилось, что лучшими ростовыми свойствами обладает соево-дрожжевая среда, приготовленная на основе дрожжевого аутолизата.

Испытание соево-дрожжевой среды в производственных условиях осуществляли в реакторе типа «Биор» с объемом загрузки среды 40 л. Результаты данного этапа эксперимента показали, что соеводрожжевая среда по удельной скорости роста и времени генерации фактически не отличается от казеиново-дрожжевой среды. Значимых различий не имели показатели прироста биомассы и выживаемости бифидобактерий в бактериальной взвеси.

С помощью электронной микроскопии установлено, что культуры бифидобактерий, выращенных на соево-дрожжевой и казеиново-дрожжевых средах, не имеют морфологических различий и представлены в виде типичных слегка изогнутых палочек с булавовидными или шаровидными утолщениями на одном или двух концах.

Таким образом, экспериментально доказано, что разработанная соево-дрожжевая среда не уступает по эффективности регламентированной, более проста в изготовлении и экономична, что подтверждает целесообразность ее использования в производстве бифидумбактерина (табл.).

Исследования по стабилизации бактериальной суспензии с использованием лиофилизации включали модификацию состава регламентированной защитной сахарозо-желатино-молочной среды.

Изменение состава ксеропротектора диктовалось необходимостью исключения или снижения коли-

чества дорогостоящих компонентов (желатин, сахароза), а также улучшения технологических свойств сухой биомассы.

При выпуске пробиотиков в виде дозированных порошков и капсул возникает ряд технологических проблем, связанных с высокой гигроскопичностью и низким показателем сыпучести сухой биомассы бифидобактерий. Для улучшения данных показателей была использована молочно-сахарозная среда со сниженным в 2 раза содержанием сахарозы по сравнению с сахарозо-желатино-молочной средой.

При оценке физико-химических и технологических свойств сухой микробной массы бифидобактерий, приготовленных на основе регламентированной защитной среды - сахарозо-желатино-молочной (СЖМ) и предлагаемой - сахарозо-молочной (СМ) среды. Установили, что исключение желатина не приводит к улучшению технологических свойств сухой микробной массы бифидобактерий.

С учетом способности аэросила и геля алюминия гидроксида образовывать с водными растворами структурированные системы была исследована возможность введения их в состав ксеропротектора.

Для изучения влияния аэросила и геля алюминия гидроксида на биологические и технологические свойства сухой биомассы были апробированы различные варианты защитных сред.

В полученных образцах сухой микробной массы изучали показатели специфической активности -содержание количества КОЕ бифидобактерий и активность кислотообразования, интегральный параметр, который характеризует биохимическую и антагонистическую активность бифидобактерий.

Проведенные исследования показали, что введение в состав защитных сред дополнительных компонентов (аэросила и геля алюминия гидроксида) обеспечивает высокую выживаемость бифидобактерий при лиофильном высушивании. Показатели выживаемости существенно не отличались по отношению к контролю. Аналогичные результаты получены при сравнении показателей активности кислотооб-разования.

Одним из способов, позволяющих снизить неблагоприятное воздействие биологических жидкостей

Таблица

Культивирование бифидобактерий в биореакторе на питательных средах

различного состава

Питательная среда Длительность культиви- рования Параметры роста культуры бифидобактерий (М±m)

Удельная скорость роста, ч-1 Время генерации, ч Прирост биомассы бифидобактерий, % Выживаемость бифидобактерий в бактериальной суспензии, ^ КОЕ/мл

Соево-дрожжевая 14,0±1,0 0,296±0,03# 2,39±0,25# 75,38±2,55# 9,54±0,13#

Казеиново-дрожжевая (контроль) 14,0±1,0 0,287±0,02 2,43±0,20 74,91±2,04 9,52±0,13

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Примечание: # р>0,05 по отношению к казеиново-дрожжевой среде (контроль).

на бифидобактерии, является иммобилизация клеток, в том числе на геле алюминия гидроксида.

Для изучения устойчивости к биологическим жидкостям лиофилизатов бифидобактерий были отобраны образцы, содержащие в своем составе гель алюминия гидроксида.

Результаты исследований свидетельствуют о высокой чувствительности неиммобилизованных бифидобактерий к действию желудочного сока и желчи. Так, после двухчасового контакта с желудочным соком содержание живых бифидобактерий в биомассе закономерно снижалось не менее чем на пять порядков. Снижение выживаемости на три порядка было выявлено при исследовании действия желчи.

При изучении выживаемости бифидобактерий, иммобилизованных на геле алюминия гидроксида, была установлена их выраженная устойчивость к действию желудочного сока и желчи. После двухчасового контакта с желудочным соком и желчью исходное содержание жизнеспособных бактерий в экспериментальных образцах снижалось не более чем на один порядок (рис. 2).

составы

состав 1 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотношении (1:1) с СЖМ ср.; состав 2 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотношении (1:0,5) с СЖМ ср.; состав 3 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотношении (1:0,2) с СЖМ ср.; состав 4 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотношении (1:0,2) с СЖМ ср.

+ 3% аэросила;

состав 5 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотношении (1:0,2) с СМ ср.; состав 6 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотношении (1:0,5) с СМ ср.; контроль - бактериальная взвесь с СЖМ ср.

■ исходное содержание жизнеспособных клеток

■ количество жизнеспособных клеток после экспозиции в желчи

□ количество жизнеспособных клеток после экспозиции в желудочном соке

Рис. 2. Сохранение выживаемости бифидобактерий при воздействии желудочного сока и желчи

Результаты данного этапа исследования показали, что все изученные составы лиофилизатов бифидобактерий с различными составами защитных сред, соответствуют регламентированным требованиям по основным биологическим показателям.

Иммобилизация бактериальных клеток на микроносителе - геле алюминия гидроксида - повышает устойчивость лиофилизатов бифидобактерий к действию желудочного сока и желчи, что свидетельствует о перспективности разработки технологии лекарственных форм на его основе.

Технологические свойства лиофилизатов бифидобактерий изучали по следующим показателям: сыпучести, насыпной плотности, гигроскопичности.

Установлено, что введение в состав СЖМ защитной среды геля алюминия гидроксида и аэросила фактически не улучшает технологических свойств сухой биомассы. Повышение показателей сыпучести и насыпной плотности отмечено для составов с гелем алюминия гидроксида, которые не содержат желатина.

По совокупности результатов исследований для дальнейшего изучения отобраны именно эти варианты сухой биомассы, приготовленной с применением СМ среды и геля алюминия гидроксида.

Производство порошков и капсул связано с выполнением технологических стадий смешивания и объемного дозирования.

Для повышения технологических свойств нами проведен подбор вспомогательных веществ - влаго-регуляторов, обеспечивающих снижение гигроскопичности и улучшение сыпучести сухой биомассы бифидобактерий.

В качестве вспомогательных веществ использовали: лактозу, аэросил, микрокристаллическую целлюлозу, композиции - и магния оксида с крахмалом, и лактозу с аэросилом. Образцом сравнения служила сухая микробная биомасса бифидобактерий, приготовленная с добавлением СМ-среды.

При оценке гигроскопичности установили, что наименьшие показатели прироста соответствуют лактозе, а также композии лактозы с аэросилом.

Для изучения влияния лактозы и аэросила на технологические свойства лиофилизат бифидобактерий смешивали в различных соотношениях с этими веществами до получения однородной порошкообразной массы.

Полученные результаты показывают, что на сыпучесть и влагопоглощение порошков существенно влияет содержание аэросила. Наиболее оптимальным по технологическим свойствам является состав, содержащий аэросила - 3%, соотношение бифидум-бактерина и лактозы (2:1) и состав - аэросила - 1% при соотношении бифидумбактерина и лактозы (1:2) (рис. 3).

Для определения концентрации аэросила, которая бы позволяла бы получать сыпучую, не отсыре-вающуюся и не уплотняющуюся в процессе хранения смесь, было изучено влияние разных концентраций

Содержание аэросила, %

Рис. 3. Зависимость влагопоглощения лиофилизата бифидобактерий с лактозой в соотношении 2:1 от концентрации аэросила

Существующая технология

ТТП-2.3. Приготовление гидролизата

ПР-1. Санитарная подготовка производства

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

ТП-3-2. Приготовление казеиноводрожжевой среды

ТП-2. Приготовление полуфабрикатов для питательных

ТП-3-3. Приготовление сахарозо-желатиново-молочной среды

ТП-3. Приготовление питательных и защитных сред

ТО-5-3. Выращивание производственной культуры бифидобактерий

ТП-4. Получение маточной культуры бифидобактерий

ТО-6-1. Розлив полуфабриката в кассеты

ТО-6-1. Розлив полуфабриката в кассеты

ТО-6-1. Розлив полуфабриката в кассеты

ТП-6. Розлив бифидумбакте-рина во флаконы

ТП-5. Культивирование бифидобактерий и получение

ТП-7. Высушивание бифидум-бактерина во флаконах методом сублимации

ТП-8. Маркировка, упаковка и хранение готового препарата

Разработанная технология

ТП-2.3. Приготовление соевого бульона из соевой муки , 2 ч

ТП-3-2. Приготовление соеводрожжевой среды

ТП-3-3. Приготовление молочно-дрожжевой среды (флаконы)

ТП-3.3. Приготовление сахарозо-молочной среды (пакеты, капсулы)

ТО-5.3. Выращивание производственной культуры бифидобактерий

ТП-6. Получение СБ бифидобактерий

ТП-7. Подготовка и расфасовка порошка бифидобактерий в капсулы

+ ----

ТО-6-1.Розлив полуфабриката в

ТО-6-2. Замораживание

ТО-6.3. Лиофилизация

ТО-6.4. Сбор и хранение СБ бифидобактерий

ТО-7-1. Размельчение СБ бифидобактерий и введение наполнителя

ТО-7-2. Расфасовка в пакеты или капсулы

Рис. 4. Технологическая схема производства препаратов на основе бифидобактерий

аэросила на сыпучесть лиофилизированного порошка бифидумбактерина с лактозой.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

При этом удовлетворительную сыпучесть показал бифидумбактерин с лактозой в соотношении 1:2, содержащий 1% аэросила. При изучении влагосорбционных свойств установлено, что содержание аэросила в количестве 1% способствует снижению вла-гопоглощения. Увеличение содержание аэросила (более 1%) приводит к увеличению гигроскопичности материала.

Таким образом, в результате изучения модельных порошков бифидумбактерина по показателям сыпучести, насыпной плотности и гигроскопичности было установлено, что наиболее оптимальными технологическим характеристиками обладает смесь лиофилизата бифидобактерий и лактозы в соотношении (1:2) c добавлением 1% аэросила от общей массы порошка. Указанный состав был выбран в качестве производственного варианта при получении дозированных порошков и капсул. С учетом специфической активности бифидобактерий доза порошка в 1 пакете (капсуле) составила 0,35 г.

Результаты проведенных экспериментов использовали при разработке технологических схем производства дозированных порошков бифидумбактери-на в пакетах и капсулах. На рисунке 4 представлены схемы производства пероральных дозированных препаратов бифидумбактерина по существующей и предлагаемой технологиям.

Новая технология предусматривает использование в производстве экономичной соево-дрожжевой среды для выращивания бифидобактерий и С-среды

для стабилизации суспензии. Выращивание производственной культуры бифидобактерий в условиях периодического управляемого рН-статируемого культивирования позволяет получать нативную бактериальную взвесь с активностью 4-6х109 КОЕ/мл. 1 литр такой бактериальной взвеси соответствует 625 дозам препарата. Выполнение технологических операций, связанных с получением дозированных порошков в пакетах и капсулах, предусматривает использование представленных в настоящей работе технологических решений.

ВЫВОДЫ

1. На основании изученных закономерностей развития популяции штамма Bifidobacterium bifi-dum 1 определена оптимальная продолжительность (12-14 часов) процесса управляемого рН-статируе-мого периодического культивирования в биореакторе для получения биомассы бифидобактерий с максимальным содержанием жизнеспособных клеток.

2. Разработан состав и способ получения питательной среды, содержащей соевый бульон и дрожжевой аутолизат. Обоснована возможность ее использования для выращивания бифидобактерий в производственных условиях.

3. При изучении влияния природы ксеропротек-торов на биологические и технологические параметры лиофилизированной биомассы бифидобактерий предложен вариант сахарозо-молочной сред для получения пероральных лекарственных форм бифи-думбактерина. Разработан способ получения ацидо-резистентной лиофилизированной биомассы бифи-

добактерий, иммобилизованной на геле алюминия гидроксида, для использования в технологии дозированных порошков.

4. Экспериментально обоснован состав наполнителей для лиофилизата бифидобактерий, позволяющий получать порошок для дозирования в пакеты и капсулы, обладающий низкой гигроскопичностью следующего состава: сухая биомасса бифидобактерий - 0,117 г, лактоза - 0,230 г, аэросил - 0,003 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Семченко А.В. Перспективные направления создания пробиотических препаратов/ А.В. Семченко, Ю.И. Гришина, И.В. Красильников. // Материалы Всеросс. кон-фер. «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов». - Пермь, 2008. - С. 185.

2. Ждан-Пушкина С.М. Основы роста культур микроорганизмов/ С.М. Ждан-Пушкина - Л.: Изд-во Ленинградского университета, 1983. - 187 с.

3. Несчисляев В.А. Изучение устойчивости лакто- и бифидобактерий к биологическим жидкостям / В.А. Несчисляев, И.В. Фадеева, В.Б. Моховикова // Материалы Всеросс. конфер. «Актуальные вопросы разработки, производства и применение иммунобиологических и фармацевтических препаратов». - Томск, 2004. - С. 130.

TECHNOLOGIC ASPECTS OF BIFIDUMBACTERIN PRODUCTION

M.I. Demesheva, L.N. Mezentseva, T.D. Limareva, Ye.V. Knyazyuk

SUMMARY

Mechanism of development of bacteria strain of Bifidobacterium bifidum 1 was investigated. Composition and method to prepare the nutrient medium consisting of soya broth and yeast autolysate as well as method to prepare acid-fast frozen-dried biomass of bifidobacterium immobilized on aluminium hydroxide gel were developed. Optimal stuff was experimentally established to be lactose, humidistat to be aerosil which allow to obtain homogeneous mixture for filling.

Key words: dysbacteriosis, bifidumbacterin, technology, capsules, drug forms.