CC BY
115
ПРЕПАРАТЫ
s ¡5 Е
U Q)
•Q
ï Ç
ce ï
G
S
Разработка и исследование
v v я
капсулированнои лекарственной формы пробиотика на основе иммобилизованных бифидобактерий
Несчисляев В.А., Столбова М.Г., Мокин П.А., Бондарев В.П.
Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Пермь «Пермское НПО «Биомед»
Development of probiotic capsule dosage form with immobilized bifidobacteria
Neschislyaev V.A., Stolbova M.G., Mokin P.A., Bondarev V.P.
Perm branch of the Federal State Unitary Enterprise «Scientific Production Association «Microgen» of the Ministry of Health of Russia - "Perm Scientific Production Association «Biomed»
Исследован процесс иммобилизации бифидобактерий с использованием сорбента на основе бурых водорослей. Показан защитный эффект носителя при воздействии желудочного сока на иммобилизованные клетки. На основе иммобилизованных бифидобактерий разработана капсулированная лекарственная форма пробиотика, подобран оптимальный состав препарата, типоразмер капсул и упаковка. Экспериментальные образцы пробиотика сохраняли необходимый уровень основных показателей в течение 21 месяца. Ключевые слова: бифидобактерии, иммобилизация, бурые водоросли.
Библиографическое описание: Несчисляев В.А., Столбова М.Г., Мокин П.А. Разработка и исследование капсулированной лекарственной формы пробиотика на основе иммобилизованных бифидобактерий // Биопрепараты. 2013. № 2. С. 35-38.
The article investigates the immobilization of bifidobacteria using sorbent based on brown algae. The research demonstrates protective effect of the carrier under the action of gastric acid on immobilized cells. Capsulate dosage form for probiotic with immobilized bifidobacteria was developed, along with the determination of the drug optimal composition, capsule size and packaging. The experimental samples of the probiotic retained the required level of the main quality attributes during 21 months.
Keywords: Bifidobacteria, immobilization, brown algae.
Bibliographic description: Neschislyaev V.A., Stolbova M.G., Mokin P.A., Bondarev V.P. Development of probiotic capsule dosage form with immobilized bifidobacteria // Biopreparation (Biopharmaceuticals). 2013. № 2. P. 35-38.
Для корреспонденции:
Несчисляев В.А. - начальник отделения препаратов бактериотерапии Филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Пермское НПО «Биомед». Адрес: 614089, г Пермь, ул. Братская, д. 177 e-mail: [email protected]
Статья поступила 05.04.2013 г, принята к печати 22.05.2013 г
Пробиотики представляют собой живые клетки и (или) метаболиты специально подобранных штаммов микроорганизмов, способных в условиях желудочно-кишечного тракта восстанавливать индигенную микрофлору. Бифидобактерии, как важнейшие представители симбиотического микробиоценоза организма человека, широко используются в составе препаратов для коррекции дисбиозов кишечного биотопа, но отли-
чаются низкой устойчивостью к действию желудочного сока, что приводит к значительной потере жизнеспособности культуры на момент попадания в кишечник. Соответственно, большое значение при разработке эффективных пробиотических препаратов имеет защита бифидобактерий от бактерицидного действия желудочного сока. Иммобилизация является одним из способов повышения устойчивости клеток, входящих в
g
- Июнь 2013
состав пробиотических лекарственных средств и БАД. При этом важную роль играют природа и технологические свойства потенциального сорбента [1-4, 6, 9].
Кроме того, улучшение потребительских характеристик отечественных препаратов связано с переходом на выпуск капсулированных лекарственных форм взамен лиофилизатов во флаконах, что значительно повысит их конкурентоспособность на нашем фармацевтическом рынке.
Цель работы: разработка капсулированной лекарственной формы пробиотика на основе иммобилизованных бифидобактерий.
Материалы и методы
В работе использовали производственный штамм Bifidobacterium bifidum 1.
Для культивирования бифидобактерий и контроля их биологических показателей применяли казеино-во-дрожжевую питательную среду, модифицированную печеночную среду Блаурокка, питательный агар с глюкозой, среду для выращивания аэробных бактерий (№ 1), плотную среду Сабуро (№ 2) производства НПО «Биомед».
В качестве сорбента использовали гомогенат бурых водорослей (фукус, ламинария, ООО «Биополимеры», г Партизанск). Добавление сорбента к взвеси бифидобактерий проводилось после окончания процесса культивирования. Для наиболее полного связывания клеток раствор сорбента смешивали с бактериальной взвесью при постоянном перемешивании в течение 30 мин. Полноту связывания бифидобактерий определяли путем подсчета жизнеспособных клеток в надосадоч-ной жидкости. Уровень сорбции считали приемлемым при связывании не менее 90% клеток. После добавления защитной сахарозо-желатино-молочной среды готовую суспензию разливали в металлические кассеты и подвергали лиофильному высушиванию в сублиматоре ТГ-50 (Германия) в течение (50±6) ч с предварительным замораживанием при температуре минус (50±10) С. Сухую биомассу извлекали из кассет, протирали через сито с ячейками на 0,25 мм и на ее основе готовили порошковые смеси со вспомогательными веществами (лактоза, каолин) для наполнения твердых желатиновых капсул (ТЖК) (Capsugel, Бельгия).
Образцы порошков фасовали в капсулы по 0,25 г при помощи ручной машины МС-1,2 (Италия), эсперимен-тально-производные серии капсулированного препарата получали на автоматической капсулонаполняю-щей машине Zanasi 40F (IMA). Капсулы упаковывали в полимерные банки с винтовой горловиной из полиэтилена высокой плотности, с крышками с силикагелевой вставкой и контролем первого вскрытия (Nolato Cerbo, Швеция).
Для контроля технологических параметров порошка (сыпучесть, насыпная плотность, гигроскопичность, остаточная влажность) использовали общепринятые методики [3, 7, 10]. Определение распадаемости и средней массы капсул проводили по ГФ XI, вып. 2. По-
IT)
терю в массе при высушивании определяли по МУК 4.1/4.2.588.
Определение рН проводили потенциометрическим методом по ГФ XII, ч. 1, с. 89. Контроль количества живых бифидобактерий (КОЕ) в 1 г порошка проводили по МУК 4.2.577-96. Определение активности кислото-образования препарата проводили титриметрическим методом.
При моделировании условий пищеварения применяли искусственный желудочный сок следующего состава: пепсина - 3 г кислоты хлороводородной концентрированной - 6 мл, воды очищенной до - 1 л. Влияние желудочного сока на выживаемость бифидобактерий определяли по изменению количества КОЕ после совместной 30-минутной инкубации при температуре 37оС [5, 8].
Результаты и обсуждение
При конструировании лекарственных форм пробиотических препаратов важное значение имеет определение чувствительности живых микроорганизмов производственного штамма к неблагоприятным условиям желудочно-кишечного тракта человека. С этой целью была изучена устойчивость бифидобактерий к действию искусственного желудочного сока. Установлено, что количество жизнеспособных клеток в контрольных образцах без добавления желудочного сока составляло не менее 108 КОЕ/г После инкубации в желудочном соке отмечено снижение показателя КОЕ/г на 2 порядка в образцах иммобилизованных бифидобактерий. Значительное изменение активности наблюдалось в образцах с неиммобилизованными клетками - показатель КОЕ/г снизился на 4 порядка. Таким образом, результаты экспериментов подтверждают, что бифидобакте-рии, иммобилизованные с помощью гомогената бурых водорослей, обладают более высокой резистентностью к воздействию желудочного сока, что позволяет сохранить в значительной степени выживаемость клеток при прохождении через желудочно-кишечный тракт и создавать более эффективные препараты на их основе.
Для получения порошковых смесей с необходимыми технологическими параметрами требуется применение вспомогательных веществ, введение которых позволяет снизить гигроскопичность исходной биомассы, улучшить сыпучесть и оптимизировать насыпную плотность порошка для капсулирования. Данные показатели весьма значимы для адекватного заполнения всего полезного объема и точного дозирования капсул.
В качестве вспомогательных веществ в работе апробировали лактозу и каолин в количестве 10, 20, 30% от массы лиофилизата. Данные вспомогательные вещества, не изменяя существенно показатель гигроскопичности, значительно влияли на стабильность физического состояния биомассы. Образцы с лактозой имели наименьшее значение гигроскопичности при относительной влажности 77 и 100%, однако при их экспозиции происходила потеря исходных свойств (сыпучесть, цвет) уже в течение часа, тогда как составы, в которых в качестве вспомогательного вещества применялся каолин, сохраняли свои свойства даже через 24 ч. Поэтому
.ПРЕПАРАТЫ
Показатели экспериментальных серий капсул при хранении
Серия Срок хранения, мес. Распадаемость, мин (не более 20 мин) рН (5,0- 6,5) Потеря в массе при высушивании (не более 5,0%) Активность кислотообразования (не менее 90°Т) КОЕ/г (не менее 1х108) Микробиологическая чистота
1 б Соотв. 5,9б 1,90 127 8,74108 Соотв.
12 Соотв. 5,9б 2,30 132 7,34108 Соотв.
18 Соотв. 5,93 2,б0 122 б,44108 Соотв.
21 Соотв. 5,90 2,70 125 б,04108 Соотв.
2 б Соотв. б,0б 2,00 12б 7,34108 Соотв.
12 Соотв. 5,95 2,10 121 б,84108 Соотв.
18 Соотв. 5,9б 2,70 132 б,44108 Соотв.
21 Соотв. 5,89 2,75 127 б,14108 Соотв.
3 б Соотв. б,08 2,10 125 7,74108 Соотв.
12 Соотв. 5,9б 2,40 12б 7,14108 Соотв.
18 Соотв. 5,99 2,70 138 б,84108 Соотв.
21 Соотв. 5,91 2,80 131 б,24108 Соотв.
4 б Соотв. б,08 2,10 121 7,б4108 Соотв.
12 Соотв. б,04 2,30 12б 7,14108 Соотв.
18 Соотв. 5,9б 2,80 135 б,84108 Соотв.
21 Соотв. 5,94 2,85 129 б,04108 Соотв.
5 б Соотв. 5,89 1,90 148 б,б4108 Соотв.
12 Соотв. 5,8б 2,10 124 5,84108 Соотв.
18 Соотв. 5,97 2,б0 117 5,14108 Соотв.
21 Соотв. 5,93 2,70 120 5,24108 Соотв.
каолин был использован для наработки экспериментальных образцов порошков для наполнения капсул.
На основании изученных показателей (сыпучесть, гигроскопичность, насыпная плотность) образцов порошков с различным содержанием каолина установлено, что варианты с 20% содержанием каолина от массы лиофи-лизата обладали наиболее приемлемыми параметрами, обеспечивающими полноту заполнения капсулы и точность дозирования. Дальнейшее увеличение содержания каолина не способствует снижению гигроскопичности и уменьшает насыпную плотность, что, в свою очередь, приводит к неоправданному увеличению номера капсул.
С учетом необходимых показателей специфической активности и технологических параметров экспериментальных порошков для наполнения были выбраны капсулы № 2 со средней вместимостью 0,37 см3, что сопоставимо с препаратами, представленными на фармацевтическом рынке («Линекс» - размер капсул № 2, «Бифиформ» - № 3, «Бифидумбактерин форте» - № 3). При этом обеспечена возможность наполнения капсул порошком с необходимой дозировкой бифидобакте-рий (КОЕ/г не менее 108 на начало срока годности). С учетом вышеуказанного наработаны 5 эксперимен-
тальных серий капсул с использованием иммобилизованной биомассы бифидобактерий с добавлением каолина.
Введение вспомогательных веществ не гарантирует сохранность содержимого наполненных капсул в течение всего предполагаемого срока годности. Поэтому очень важным является выбор вида упаковки, обеспечивающей защиту препарата от воздействия влажности и кислорода воздуха, и её соответствие современным требованиям, учитывающим потребительские предпочтения и технико-экономические аспекты производства пробиотиков.
Полученные экспериментальные образцы капсул были помещены в герметично закрывающиеся полимерные банки из полиэтилена высокого давления с силикагелевой вставкой и заложены на хранение при температуре от 2 до 8°С в соответствии с СП 3.3.2.124803. В течение 21 месяца экспериментальные образцы контролировали по основным физико-химическим и биологическим показателям: рН, потеря в массе при высушивании, распадаемость, КОЕ/г, активность кис-лотообразования. Подлинность определяли методом микроскопирования и по совокупности показателей
а
£ Апрель - Июнь 2013
специфической активности. Результаты периодического контроля показали, что при хранении в течение указанного срока качество твердых желатиновых капсул соответствовало предъявляемым к данной форме требованиям в соответствии с ОФС «Капсулы», ГФ XII, вып. 2. В процессе наблюдения внешний вид капсул и их содержимое визуально не изменялись. При контроле параметров специфической активности и микробиологической чистоты было установлено, что их необходимый уровень сохранялся в течение срока наблюдения и соответствовал требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01 (количество жизнеспособных бифидобактерий не менее 1х108 КОЕ/г, активность кислотообразования не менее 90 °Т; условно-патогенные и патогенные микроорганизмы в препарате не обнаружены). Результаты исследований представлены в таблице.
Таким образом, результаты проведенной работы позволяют сделать следующие выводы:
1. Сорбенты на основе бурых водорослей перспективны для разработки пробиотических препаратов на основе бифидобактерий, так как защищают клетки от действия желудочного сока.
2. Подобран оптимальный состав препарата на основе иммобилизованных бифидобактерий и определен необходимый номер капсул.
3. Показана целесообразность использования для первичной упаковки капсул полимерных банок с винтовой крышкой, имеющей силикагелевую вставку. Минимальный срок годности (хранения) для капсульной формы препарата на основе иммобилизованных клеток - 18 мес.
4. Обоснована необходимость расширения линейки выпускаемых лекарственных форм пробиотиков на основе бифидобактерий за счет внедрения в производство капсульной формы препарата на основе иммобилизованных клеток.
Литература:
1. Амерханова А.М. Бифидобактерии как основа для создания иммунобиологических препаратов // Новые лекарственные препараты. 2004. № 3. С. 39 -43.
2. Андреева И.В. Доказательства обоснованности профилактического применения пробиотиков // Фарматека. 2006. № 6. С. 62-68.
3. Белоусов В.А., Вальтер М.Б. Основы дозирования и таблетирования лекарственных порошков. М.: Медицина, 1980. 214 с.
4. Бондаренко В.М. О совершенствовании пробиотических препаратов // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2008. № 2-3. С. 24.
5. Государственная фармакопея Российской Федерации X, С. 669.
6. Корочинский А.В., Верниковский В.В., Степанова Э.Ф. Исследование возможности создания иммобилизованных структур на базе пробиотиков // Успехи современного естествознания. 2010. № 5. С. 34-38.
7. Методические указания по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М.: МЗ СССР, 1977. 17 с.
8. МУК 4.2. 2602-10. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. М. 2010. 61 с.
9. Несчисляев В.А. Унификация технологии получения и контроля препаратов для бактериотерапии с использованием питательных сред из непищевого сырья: дис.... канд. мед. наук. Пермь, 1989. 147с.
10. Вальтер М.Б., Тютеньков О.Л., Филиппин Н.А. По-стадийный контроль в производстве таблеток. М.: Медицина, 1982. 208 с.
