CC BY
28
УДК 615.37
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2020-22-11-8-12
ON THE ISSUE OF STANDARDIZATION OF SYMBIOTICS
Neschislyaev V. A., Belova I.V., Kylosova I.A., Mokin P.A., Orlova E.V.
Perm state pharmaceutical academy, Perm, Russian Federation
К ВОПРОСУ СТАНДАРТИЗАЦИИ СИМБИОТИКОВ
Несчисляев В.А., Белова И.В., Кылосова И.А., Мокин П.А., Орлова Е.В.
ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия», г. Пермь, Российская Федерация
Аннотация. Поликомпонентные пробиотики являются эффективным средством для коррекции дисбио-тических состояний человека и применяются в комплексной терапии различных заболеваний. При разработке симбиотиков необходимо уделять внимание как совместимости используемых бактериальных культур, так и обеспечению необходимого уровня стандартизации данных препаратов. Применение методов контроля, позволяющих дифференцированно определять количество жизнеспособных клеток каждого штамма в дозе препарата, является необходимым инструментом стандартизации симбиотиков. Реализация такого подхода продемонстрирована на примере препарата «Бифилакт-БИЛС», содержащего лакто- и бифидобактерии, раздельный подсчёт которых обусловлен использованием межштаммовых различий культуральных свойств, включая активность сквашивания молока, антибиотикочувствительность, аэробные условия. Разработанная методика контроля для данного препарата является альтернативой дорогостоящего варианта на основе полимеразной цепной реакции. Ключевые слова: симбиотик, стандартизация, лакто-бактерии, бифидобактерии, культуральные свойства. Abstract. A multicomponent probiotic is an effective remedy for correction the disbioticheskikh of conditions of the person and is applied in complex therapy of various diseases. When developing simbiotik it is necessary to pay attention both compatibility of the used bacterial cultures, and to ensuring necessary level of standardization of these medicines. Application of the control methods allowing to define differentially quantity of viable cages of each strain in a medicine dose is the necessary instrument of standardization of simbiotik. Realization of such approach is shown on the example of the medicine "Bifilakt-BILS" containing lakto-and bifidobacteria which separate calculation is caused by use the mezhshtammovykh of distinctions of cultural properties, including activity of souring of milk, an an-tibiotikochuvstvitelnost, aerobic conditions. The developed control technique for this medicine is an alternative of expensive option on the basis of polymerase chain reaction. Keywords: symbiotic, standardization, lactobacilli, bifidobac-teria, cultural properties.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК [1] В.М. Бондаренко, О.В. Рыбальченко. Анализ профилактического и лечебного действия пробиоти-ческих препаратов с позиций новых научных технологий //Журнал микробиол. - 2015. - № 2. - С. 90-104. [2] Молокеев А.В., Зыкова Н.А., Ильяина Р.М., Моло-кеева Н.В., Соколова Т.В. Аспекты создания многокомпонентных БАД-симбиотиков //Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2019. - №2. - С. 31. [3] И.И. Вайншток, И.Ю. Щит, В.М. Бондаренко, И.Б. Бродский. Использование мультиплексной ПЦР для анализа поликомпонентных пробиотических REFERENCES [1] V.M. Bondarenko, O.V. Rybalchenko. The analysis of preventive and medical effect of pro-biotic medicines from positions of new scientific tech-nologies//the Magazine mhkpo6ho^. 2015. No. 2. P.90-104. [2] Molokeev A.V., Zykova N.A., Ilyaina R.M., Mo-lokeeva N.V., Sokolova T.V. Aspects of creation multicomponent BUD-simbiotikov//Gastroenter-ology of St. Petersburg. 2019. No. 2. P.31. [3] I.I. Weinstock, I.Yu. Shchit, V.M. Bondarenko, I.B. Brodsky. Use of multiplex PTsR for the analysis of multicomponent pro-biotic medicines//the Magazine mhkpo6ho^. 2013. No. 5. P.92-96.
препаратов //Журнал микробиол. - 2013. - № 5. -С. 92-96.
Contribution of authors. Neschislyaev V.A., Belova I. V. - the review of literature, writing of the text. Kylosova I.A.,
Mokin P.A. - statistical data processing, Neschislyaev V. A., Rlova E.V. - the concept and design of a research.
Statement for the conflict of interests.Authors declare no conflict of interest.
Neschislyaev V.A. - SPIN ID: 2469-6644; ORCID ID: 0000-0002-8163-0674
Kylosova I.A. - SPIN ID: 2546-0973; ORCID ID: 0000-0002-8874-7445
Mokin P.A. - SPIN ID: 9083-2415; ORCID ID: 0000-0001-9801-2883
Orlova E.V. - SPIN ID: 8093-5260
Вклад авторов. Несчисляев В.А., Белова И.В. - обзор литературы, написание текста. Кылосова И.А., Мокин
П.А. - статистическая обработка данных, Несчисляев В.А., Орлова Е.В. - концепция и дизайн исследования.
Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Несчисляев В.А. - SPIN ID: 2469-6644; ORCID ID: 0000-0002-8163-0674
Кылосова И.А. - SPIN ID: 2546-0973; ORCID ID: 0000-0002-8874-7445
Мокин П.А. - SPIN ID: 9083-2415; ORCID ID: 0000-0001-9801-2883
Орлова Е.В. - SPIN ID: 8093-5260
Введение. Успехи современной микробиото-логии, связанные с качественным изменением нашим представлений о составе, функциях и влиянии микробиома на все сферы жизнедеятельности макроорганизма, находят своё отражение в биофармацевтике и реализуются в виде разработок новых препаратов для коррекции дисбиотических состояний, играющих существенную роль в патогенезе абсолютного большинства заболеваний человека различной этиологии [1].
В настоящее время на фармацевтическом рынке в сегменте средств пробиотиче-ского действия доминируют поликомпонентные препараты-симбиотики, эффективность которых обусловлена совокупной биологической активностью применяемых бактериальных культур. К проблемным аспектам конструирования и производства мультипробио-тиков относятся вопросы биологической и технологической совместимости штаммов, а также обеспечение стандартности выпускаемых препаратов [2]. В данной работе на модели завершающего этапа разработки препарата «Бифилакт-БИЛС» демонстрируется методический подход к решению задачи стандартизации симбиотика. Цель работы: использование отличий куль-туральных свойств лакто- и бифидобактерий для дифференцированного учёта жизнеспособных клеток каждого штамма в дозе сим-биотика «Бифилакт-БИЛС».
Материалы и методы. В работе использовали пробиотические штаммы: Lactobacillus plantarum 8P-A3, L. acidophilus К3Ш24, Bifidobacterium bifidum 1, составляющие композицию симбиотика «Бифилакт-БИЛС» (НПО «Микроген», Россия), содержащего 107 - 108 КОЕ каждой бактериальной культуры в 1 дозе.
Для культивирования клеток и визуального контроля морфологии колоний применяли следующие питательные субстраты: обезжиренное молоко, плотную среду МРС-4, модифицированную среду Блаурокка (НПО «Микроген»), среду Блаурокка с добавлением канамицина (НИЦФ, Санкт-Петербург).
Для определения количества клеток (КОЕ/доза) штамма L. plantarum 8P-A3 из исходной регидратированной культуры сим-биотика готовили ряд десятикратных разведений с высевом последних на чашки Петри со средой МРС-4, инкубации при температуре (37±1) оС в течение 48 ч и подсчётом колоний.
Для определения количества ацидофильных лактобактерий готовили из исходной культуры разведения в пробирках с молоком от 10-1 до 10-9. Посевы выдерживали в термостате при (37±1) оС в течение 3-4 суток. При подсчёте количества ацидофильных бактерий пользовались таблицей Мак-Креди в соответствии с ОФС.1.7.2.0009.15.
При определении активности сквашивания у всех штаммов из исходных монокультур, содержащих 108 КОЕ/мл, готовили ряд десятикратных разведений в молоке. После инкубации посевов при (37± 1) оС в течение 76-96 ч отмечали разведения, где образовался сгусток.
Для определения количества бифидобакте-рий делали десятикратные разведения исходной культуры в среде Блаурокка. После инкубирования посевов в течение 96 ч при температуре (38±1) оС отмечали разведения, в которых наблюдался рост бифидобактерий. Результаты и обсуждение. При создании симбиотика «Бифилакт-БИЛС» были использованы результаты предварительного сравнительного исследования биологических свойств большого пула производственных
штаммов лакто- и бифидобактерий. Для стандартизации препарата, после отработки технологических аспектов производства, была предложена комплексная методика контроля его специфической активности, включающая раздельный учёт количества жизнеспособных клеток каждого штамма в дозе данного сим-биотика. Разработанная методика базируется на визуализации культуральных различий штаммов, входящих в состав препарата.
Сквашивание молока является характеристикой ферментативной активности бактериальных культур и, соответственно, потенциальным дифференциальным признаком. Наличие сквашивания в десятикратных разведениях штаммов определяли по появлению молочного сгустка (табл.1).
Таблица 1
Сквашивание молока лакто- и бифидобактериями
Штаммы Разведение дозы инокулята (108 КОЕ)
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
L. acidophilus К3Ш24 + + + + + + + +
L. plantarum 8P-A3 + + + ± - - - -
B. bifidum 1 ± - - - - - - -
Примечание: "+ " - разведения, где образуется сгусток
Table 1
Souring of milk lakto-and bifidobacteria
Strains Cultivation of a dose of the inokulyat (108, CFU)
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
L. acidophilus К3Ш24 + + + + + + + +
L. plantarum 8P-A3 + + + ± - - - -
B. bifidum 1 ± - - - - - - -
Note: "+" - cultivations where the clot is formed
Полученные результаты свидетельствуют, что штамм L. plantarum 8P-A3 существенно, на 3-4 порядка, уступает культуре L. acidophilus К3Ш24 по своей сквашивающей активности, а бифидобактерии молоко практически не сквашивают. Данный признак был использован в качестве отличительного для количественного определения лактобактерий
Селективные свс
штамма L. acidophillus К3Ш24 в ассоциации с другими компонентами симбиотика.
Для селективного роста штамма B. bi-fidum 1 была подобрана концентрация антибиотика канамицина, подавляющая лактобак-терии и не влияющая на скорость роста, количество и морфологию колоний бифидобакте-рий (табл.2).
Таблица 2
:тва канамицина
Концентрация Выживаемость бифидобактерий, CFU/мл Форма колоний Время появления колоний, ч Присутствие в среде Примечание
канами- колоний лак-
цина, тобактерий
мкг/мл 106 107
Кон- 27,60±3,39 3,60±0,93 'гвоздики' 72 - Типичная морфо-
троль* логия колоний
50 - - 'тяжи' - + Частичное инги-
75 23,67±1,67 1,33±0,33 'гвоздики' 72 + бирование роста лактобактерий
90 23,50±0,50 2,50±0,50 'гвоздики' 72 - Типичная морфо-
100 22,00±2,47 2,00±0,55 'гвоздики' 72 - логия колоний
110 24,40±3,68 1,83±0,31 'гвоздики' 72 -
120 29,60±1,54 2,20±0,37 'гвоздики' 72 - Колонии в 1,5-2
130 24,50±1,19 2,00±0,00 'гвоздики' 72 - раза меньше, чем
150 25,33±2,19 2,00±0,58 'вытянутые гвоздики' 72 - в контроле
Примечание: "*" - монокультура бифидобактерий.
Table 2
Selective properties of a kanamitsin
Concentration of a kanamitsin, mkg/ml Survival of bifidobacteria, CFU/ml Form of colonies Time of emergence of colonies, h Presence at the environment of colonies of lac-tobacilli Note
106 107
Control * 27,60±3,39 3,60±0,93 'carnations' 72 - Typical morphology of colonies
50 - - 'tyazh' - + Partial inhibition of growth lactobacilli
75 23,67±1,67 1,33±0,33 'carnations' 72 +
90 23,50±0,50 2,50±0,50 'carnations' 72 - Typical morphology of colonies
100 22,00±2,47 2,00±0,55 'carnations' 72 -
110 24,40±3,68 1,83±0,31 'carnations' 72 -
120 29,60±1,54 2,20±0,37 'carnations' 72 - The colony is 1.5-2 times less, than in control
130 24,50±1,19 2,00±0,00 'carnations' 72 -
150 25,33±2,19 2,00±0,58 'the extended carnations' 72
Note: "*" - a monoculture of bifidobacteria.
Содержание (100±10) мкг/мл канами-цина в среде Блаурокка было признано оптимальной концентрацией антибиотика, не влияющей на культуральные свойства бифидобактерий и позволяющей ингибировать рост штаммов-ассоциантов. Включенный в комплексную методику тест с использованием антибиотикосодержащей питательной среды позволяет адекватно оценить содержание би-фидобактерий в дозе симбиотика.
Для селективного роста клеток штамма L. plantarum 8P-A3 была использована плотная среда МРС-4 и аэробные условия культивирования. Для облигатно-анаэ-робных ацидофильных лактобактерий и би-фидобактерий такие условия непригодны,
поэтому эти штаммы не влияют на величину показателя КОЕ для L. plantarum 8P-A3 в дозе препарата.
Представленный методический подход позволяет исключить при стандартизации малокомпонентных (2-4 бактериальные культуры) симбиотиков более дорогостоящие и высокотехнологические способы, в частности, вариант на основе полимеразной цепной реакции, которые в настоящее время адаптируются для контроля многокомпонентных пробиотиков, композиции которых содержат близкие по таксономической принадлежности и культуральным свойствам штаммы, а сама продукция позиционируется как лекарственный препарат [3].
Заключение. Стандартизация является одним из главных преимуществ лекарственных препаратов-симбиотиков по сравнению с БАД. Разработчики и производители симбио-тиков для обеспечения качества выпускаемой продукции должны обращать необходимое внимание на стабильность количественных параметров и соотношения бактериальных культур в данных лекарственных препаратах.
Объективно фиксируемые различия в культу-ральных свойствах штаммов-ассоциантов, позволяющие дифференцированно оценить количество жизнеспособных клеток в дозе симбиотика, являются рациональной основой создания комплексной методики контроля качества препарата и, соответственно, обеспечения его стандартности.
Ответственный за переписку: Кылосова Инна Александровна — доцент кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии, ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия», г. Пермь, Российская Федерация, е-mail: inna_kylosova@mail.ru
Corresponding Author: Kylosova Inna Alexandrovna - associate professor of Chair of industrial technology of drugs with a biotechnology course, Perm state pharmaceutical Academy, Perm, Russian Federation, e-mail: inna_kylosova@mail.ru
