CC BY
7УДК 615.917'26
В.А.Суханов, А.Н.Саприн, Е.В.Калинина, Т.Ю.Федорова, Л.А.Пирузян
ВЛИЯНИЕ ФЕНОТИПА МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ОКИСЛЕНИЯ У НЕЛИНЕЙНЫХ ЖИВОТНЫХ НА ИХ ВОСПРИИМЧИВОСТЬ К ТОКСИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ
Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва
Показано, что популяция нелинейных крыс может быть разделена на несколько фенотипов по результатам анализа метаболизма карбамазепина (Кбз). Биотрансформация Кбз проходит, в основном, по эпоксид-диольно-му пути, как и полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) типа бенз(а)пирена (БП), то есть Кбз может являться маркером токсического и канцерогенного действия ПАУ. По результатам фенотипирования нелинейные крысы были разделены на 3 группы: «слабых, средних и активных метаболизаторов». Группа «активных метаболи-заторов» была наиболее устойчивой к воздействию БП, как по острой токсичности, так и в отдаленные сроки (6,5 мес.).
Ключевые слова: фенотипирование, генотипирование, токсикология, полициклические ароматические углеводороды.
Введение. Одной из проблем современной фармакологии является индивидуальная чувствительность к действию лекарственных средств, определяющая их терапевтическую эффективность и развитие нежелательных побочных явлений. Широкая вариабельность действия хи-миотерапевтических препаратов зависит от фе-но- или генотипа конкретного индивидуума, и связана, прежде всего, с особенностями и состоянием системы ферментов метаболизма и детоксикации ксенобиотиков (ФМДК) [1-12]. Определение фено- (гено) типа особенно важно проводить в случае использования высокотоксичных химиотерапевтических средств, например, цитостатиков, широко применяемых при лечении различных онкологических заболеваний. Кроме того, высокая загрязненность окружающей среды полютантами, требует проведения оценки их опасности для человека с учетом индивидуальной чувствительности к их токсическому, мутагенному и канцерогенному действию. Поэтому разработка современных методов прогнозирования развития различных заболеваний, в том числе онкологических, является необходимой и важной задачей. Ранее было показано, что эпоксид-диольный путь метаболических превращений проканцерогенов — полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) является наиболее опасным звеном, определяющим их токсичность и канце-рогенность [1, 3-5, 13]. Наши исследования показали, что при этом важно оценивать соотношение эпоксид-синтетазной активности цито-хрома Р-450 (ЭС) и активности эпоксидгидра-тазы (ЭГ), а также учитывать гидроксилазную активность цитохрома Р-450 и суммарную ак-
тивность микросомальных изоформ глутатион-8-трансферазы. На основании этих данных, по активностям ферментов, нами был предложен так называемый «условный критерий метаболического статуса организма» (УКМСО) [4, 5]. Была продемонстрирована эффективность применения УКМСО в качестве прогностического критерия оценки риска развития различных патологий и важность близости значений УК-МСО между донором и реципиентом в трансплантологии при пересадке полнослойных лоскутов кожи [14, 15]. Недостатком данного подхода является необходимость в заборе биопсий-ного материала. Более перспективными методами фено- и генотипирования могут быть прижизненные методы, основанные на измерении фармакокинетических параметров метаболизма специальных маркеров-зондов и изучении полиморфизма ФМДК методом ПЦР с использованием праймеров на полиморфные участки ФМДК. Известно, что в процессах метаболического окисления — гидроксилирования принимают участие такие наиболее распространенные изоформы цитохрома Р-450 (CYP) как CYP1A1, CYP1A2, CYP3A4 и некоторые другие, с более выраженной субстратной специфичностью [16—19]. Однако изоформы цитохрома, участвующие в процессах эпоксидирования, фактически не изучены. В данной работе проведена оценка применимости метода метаболического зондирования для прогностических целей и показана его эффективность при моделировании связи генотипа метаболического окисления с устойчивостью к токсическому и мутагенному воздействию ПАУ на фенотипирован-ных нелинейных животных.
Материалы и методы исследования. Эксперименты проводили на половозрелых самцах нелинейных белых крыс массой 80—100 г. Животные находились в стандартных условиях вивария и на стандартном корме.
Фенотипирование проводили на 60 животных путем перорального введения 0,2 г карба-мазепина (Кбз). Животных помещали в обменные клетки, в которых собиралась моча на сроки 6, 12 и 24 ч. Замерялся объем выделенной мочи, отбирали по 0,5 мл из каждого объема, добавляли 0,5 мл 0,1 М ^-ацетатного буфера, рН 4,5 и по 50 мкл (или иное количество — в зависимости от активности) готовой смеси ферментов — глю-куронидазы и арилсульфатазы («Серва», Германия), для разрушения соответствующих конъю-гатов. Разделение и анализ метаболитов проводили методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии с использованием Линома-та и Сканера («Камаг», Швейцария), интегратора 8Р 4100 («НР», США) и высокоэффективных хроматографических пластинок без флюоресцентного индикатора («Мерк», Германия), как это описано ранее [20, 21]. Определяли количество выделившихся к определенному времени Кбз-10,11-эпоксида, Кбз-10,11-диола и свободного Кбз. Оценивали сумму образовавшихся метаболитов по отношению к исходному Кбз.
Фенотипированным животным, спустя 7 дней, вводили в/бр бенза(а)пирен в подострой дозе 50 мг/кг или иной — как это описано в следующем разделе статьи. Животные находились под наблюдением до 6,5 месяцев, в течение ко-
торых фиксировали их смертность, проводили патолого-анатомическое вскрытие и морфологическое изучение органов и тканей. Оставшихся в живых к этому сроку крыс забивали, в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» МЗ РФ.
Результаты и обсуждение. В качестве метаболического зонда нами был выбран разрешенный к применению в медицине антиконвуль-сант — карбамазепин (Кбз), метаболизм которого у млекопитающих проходит, в основном, по эпоксид-диольному пути. Известно, что при биотрансформации Кбз наиболее активными метаболитами являются арен-оксиды и хи-ноны [21, 22]. Недавно, косвенно, по ингбиро-ванию изоформ CYP, было показано, что формы СУР2С11, CYP3A, СУР1А1/2, CYP2B1/2 в микросомах печени крыс, а также изоформы CYP2D6, СУР2С8, CYP2C9 и CYP3A4 в микросомах печени человека, фактически не участвуют в метаболизме Кбз. Наиболее реакционно-способные метаболиты Кбз образуются на изо-формах CYP2D у крыс и CYP1A2 — у человека [23, 24]. Видимо, эти же изоформы CYP являются основными, принимающими участие в образовании эпоксидов. С целью выявления возможных индивидуальных различий по образованию и метаболизму эпоксидов и диолов Кбз, мы провели фенотипирование 60 нелинейных белых крыс. Результаты фенотипирования представлены на рис. 1. Из представленных на гистограмме данных видно, что нелинейные белые крысы об-
Кол-во животных
—I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I г 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 I
мкг/12 ч
Рис. 1. Гистограмма распределения белых, нелинейных крыс по их способности экскретировать метаболиты карба-мазепина (сумма эпоксидов и диолов за 12 ч). Подробности в тексте статьи
Время, мес.
-о- Слабые метаболизаторы -•- Активные метаболизаторы
Рис. 2. Динамика устойчивости к бенз(а)пирену фено-типированных крыс - «слабых» и «активных метаболи-заторов»
ладают разной индивидуальной метаболической активностью, с образованием от 10 до 62 мкг эпоксидов и диолов Кбз в сумме на 12 ч от времени введения Кбз. В зависимости от этой метаболической активности животные были разделены на 3 группы: «слабые метаболизаторы» — с активностью менее 32 мкг/12 ч, «средние метаболизаторы» — с активостью от 36 до 44 мкг/12 ч, и «активные метаболизаторы» — экскретирую-щие более 48 мкг/12 ч. На группе «средних мета-болизаторов» была определена приблизительная летальная доза (DL50) для бенза(а)пирена (БП) при внутрибрюшинном введении, которая была выше 50 мг/кг (50 мг/кг — 0/6, 100 мг/кг — 3/6, 150 мг/кг — 5/6 погибших животных на 14 день). Оставшимся животным (группы «слабых» и «активных метаболизаторов») был в/бр введен БП в дозе 50 мг/кг на 7 день после фенотипирования. Животные находились под наблюдением в течение 6,5 месяцев. Динамика устойчивости к БП представлена на рис. 2. Эти данные показывают, что группа «активных метаболизаторов» более устойчива к действию БП как по острой токсичности (на 14 дней), так и на отдаленные сроки. В первые 2 недели погибло 33% «слабых ме-таболизаторов», в то время как среди «активных метаболизаторов» гибели животных не наблюдалось. Спустя 6,5 мес. в группе «активных метабо-лизаторов» осталось 66% выживших животных. В группе «слабых метаболизаторов» через 6,5 мес. осталось всего 17% выживших особей. Па-толого-анатомический анализ погибших животных выявил изменения селезенки и почек, увеличение печени, гипертрофию мочевого пузыря — на ранние сроки, гипертрофию селезенки,
опухоль тимуса, точечные образования печени и брызжейки, опухоли лимфоузлов — на более отдаленные сроки. Среди выживших к 6,5 мес. животных эти изменения в группе «активных метаболизаторов» были выражены значительно слабее, а у 3 особей вообще не наблюдалось каких-либо изменений.
Заключение. Полученные данные показывают, что индивидуальные особенности метаболических процессов окисления ПАУ определяют их токсичность и канцерогенность — чем выше метаболическая активность индивидуума, тем меньше вероятность развития токсических и канцерогенных эффектов. Индивидуальное, прижизненное фенотипирование с помощью безопасных «метаболических зондов» позволяет прогнозировать риск развития нежелательных последствий, в том числе проявления побочного действия лекарственных средств. По результатам метаболического зондирования любая популяция животных, в том числе нелинейная, может быть разделена и отнесена к тем или иным фенотипам, определяющим их устойчивость по отношению к различным ксенобиотикам.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ по гранту № 05-04-49799 и Программы научных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине».
Список литературы
1. Pharmacogenomics. The Search for Individualized Therapies (Licinio J., WongM, eds.). Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany; 2002. - 559 с.
2. Пирузян Л.А. О фармакологической метрологии //Изв. АН СССР. Сер. биол., 1990. - № 2. - С. 302-304.
3. Пирузян Л.А., Суханов В.А., Саприн А.Н. Прогностический фактор риска разития патологических процессов, основанный на полиморфизме ферментов метаболизма ксенобиотиков // Физи-ол. чел., 2000. - T. 26. -№ 2. - C. 115-123.
4. Пирузян Л.А., Суханов В.А., Калинина Е.В. и др. Медико-биологические аспекты метаболического портретирования //ДАН, 2001. - T. 377. -C. 129-131.
5. Пирузян Л.А., Суханов В.А., Калинина Е.В. и др. Ферментная система метаболизма и детокси-кации ксенобиотиков как основа метаболического портретирования при прогнозировании риска развития патологических процессов // Изв. АН. Сер. биол., 2002. - № 2. - С. 149-154.
6. Пирузян Л.А., Михайловский Е.М. Метаболическое организменное популяционное конструирование онкологической патологии при генетической предрасположенности индивидуумов. Сообщение I// Физиол. чел., 2001. - T. 27. - № 3. -
С.113—121.
7. Пирузян Л.А., Михайловский Е.М. Метаболическое организменное популяционное конструирование онкологической патологии при генетической предрасположенности индивидуумов. Сообщение II // Там же, 2002. — Т. 28. — № 1. — С. 101-115.
8. Пирузян Л.А., Михайловский Е.М. Метаболическое организменное популяционное конструирование онкологической патологии при генетической предрасположенности индивидуумов. Сообщение III // Там же, 2002. — Т. 28. — № 5. — С.103-111.
9. Пирузян Л.А., Михайловский Е.М. Метаболическое организменное популяционное конструирование онкологической патологии при генетической предрасположенности индивидуумов. Сооб-щениеIV//Там же, 2003. — Т. 29. — № 2. -С. 118— 126.
10. Пирузян Л.А., Радкевич Л.А., Морозова Н.В. Метаболическое этническое портретирование в стратегии подбора фармакотерапии на примере И-ацетилирования и хронических патологий печени //ДАН, 2003. — Т. 388. — С. 842—844.
11. Пирузян Л.А. Метаболический паспорт человека — основа новой стратегии в фармакологии // Вестник РАН, 2004. — Т. 74. — № 7. — С. 610618.
12. Суханов В.А., Саприн А.Н., Пирузян Л.А. Фармакогенетические проблемы противоопухолевой терапии // Хим. Фарм. журнал, 2004. — Т. 38.
— № 7. — С. 3-9.
13. Суханов В.А., Саприн А.Н., Калинина Е.В. и др. Роль метаболического статуса организма в восприимчивости к токсическому и мутагенному воздействию полициклических ароматических углеводородов // Токсикологический вестник, 2006.
— № 1. — С. 6-11.
14. Шумаков В.И., Василенко В.Т., Гасанов Э.К. и др. О роли метаболического статуса донора и реципиента в процессах приживления полнослой-ного кожного лоскута //ДАН, 2003. — Т. 388. — № 5. — С. 708-710.
15. Шумаков В.И., Василенко В.Т., Гасанов Э.К. и др. Значимость метаболического статуса донора и реципиента в процессах приживления полнослойного кожного лоскута по данным гистологического анализа// Физиол. чел., 2004. — Т. 30. — № 4. — С. 69-74.
16. Zhang W., Purchio A., Coffee R. Differential regulation of the human CYP3A4promoter in transgenic mice and rats // Drug metabol. Dispos., 2003. — V. 32. — P. 163-171.
17. Shimada T., Inoue K., Suzuki Y. et al. Arylhy-drocarbon receptor-dependent induction of liver and lung cytochroms P450 1A1, 1A2, and 1B1 by PAH // Carcinogenesis, 2002. — V. 23. — P. 1199-1207.
18. Stiborova M., Martinek V., Rydlova H. et al. Sudan I is a potential carcinogen for humans // Cancer Res., 2002. — V. 62. — P. 5678-5684.
19. Stresser D., Turner S., Blanchard A. et al. Cytochrome P450 fluorometric substrates: Identification of isoform-selective probes for rat CYP2D2 and human CYP3A4//Drug Metabol. Dispos., 2002. — V 30. — P. 845-852.
20. Pfeifer S., Borchert H. Pharmakokinetik und Biotransformation // Berlin: Verlag Volk und Gesundheit, 1980.
21. Kitteringham N., Davis C., Howard N. et al. Interindividual and interspecies variation in hepatic microsomal epoxide hydrolase activity // J. Pharmacol. Exp. Therap, 1996. — V 278. — P. 1018-1027.
22. Lillibridge J., Amore B., Slattery J. et al. Protein-reactive metabolites of carbamazepine in mouse liver microsomes // Drug Metab. Dispos., 1996. — V. 24. — P. 509-514.
23. Masubuchi Y., Nakano T., Ose A. et al. Differential selectivity in carbamazepine-induced inactiva-tion of cytochrome P450 enzymes in rat and human liver //Arch. Toxicol., 2001. — V 75. — P. 538-543.
24. Hung S., Chung W., Jee S. et al. Genetic susceptibility to carbamazepine-induced cutaneous adverse drug reactions // Pharmacogenet. Genomics, 2006. — V 16. — P. 297-306.
Материал поступил в редакцию 14.02.07.
V.A.Sukhanov, A.N.Saprin, Ye.V.Kalinina, T.Yu.Fedorova, L.A.Piruzyan
EFFECT OF THE METABOLIC OXIDATION PHENOTYPE IN NON-INBRED ANIMALS ON THEIR SUSCEPTIBILITY TO TOXIC ACTION OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS
Center for theoretical problems of physico-chemical pharmacology, Russian Academy of Sciences, Moscow
It is shown that the population of non-inbred rats could be referred to several phenotypes basing on the results of metabolism analysis of carbamazepin. Biotransformation of carbamazepin mainly proceeds according to epoxide-diol pattern as in case of poly-cyclic aromatic hydrocarbons of benz(a) pyrene type, that means that carbamazepin could serve a marker of toxic and carcinogenic effect produced by polycyclic aromatic hydrocarbons. Basing on the results of phenotyping, non-inbred rats could by subdivided into three groups according to the activity degree of metabolizers- mild, medium and active. The group of «active metabolizers» proved to be the most stable to the effect of benz(a)pyrene both as to acute toxicity and distant periods of time (6 or 5 months).
