CC BY
1632. Papper E.M. The pharmacokinetics of inhalation anaesthetic: clinical applications // Brit. J. Ana-esth, 1964. - V. 36. - № 3. - P.124.
33. Teisinger J. et al. Chemical methods for the evaluation of biological material in industrial toxicology. - Prague: SZN, 1956. - P 1-128.
34. TLVs and BEIs. Based on the Documentations for Threshold Limit Values for Chemical Substances and Physical Agents Biological Exposure Indices. ACGIH WORLDWIDE, 1999. - 184p.
Материал поступил в редакцию 09.11.05.
G.I.Sidorin, A.D.Frolova, L.V.Lukovnikova
THEORETICAL BASIS OF MODERN BIOMONITORING IN WORKS BY LAZAREV AND OF HIS SCHOOL
(in commemoration of his 110th anniversary)
North-western Scientific Center of Hygiene and Public Health, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-being,St.-Petersburg
Are presented fundamental trends of theoretical studies carried out by Prof. N.V.Lazarev, outstanding scientist, and which laid down the foundation for the development of the contemporary biomonitoring of chemicals.
УДК 612.015.3.06:547.31
В.А.Суханов1, А.Н.Саприн1, Е.В.Калинина1, С.К.Абилев2, Л.А.Пирузян1
РОЛЬ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА В ВОСПРИИМЧИВОСТИ К ТОКСИЧЕСКОМУ И МУТАГЕННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ (исследования на инбредных линиях мышей)
1Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН 2Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, Москва
Показано, что мыши линий DBA/2 и С57В1аск/6 обладают разной восприимчивостью к токсическому и мутагенному воздействию бенз(а)антрацена и ингибитора эпоксидгидратазы — 2,2-дибромо-1-(4-нитрофенил)-этанона, а также к их комбинации. Разная восприимчивость мышей может быть связана с метаболическим статусом, прежде всего, с уровнями эпоксидсинтетазной активности цитохрома Р-450 и эпоксидгидратазы.
Ключевые слова: токсикология, фармакогенетика, детоксикация ксенобиотиков, линейные мыши, DBA/2, С57В1аск/6.
Введение. Исследования последних 30 лет, в том числе полная расшифровка генома, показали, что метаболизм биотиков и ксенобиотиков в организмах млекопитающих находится в зависимости от их гено- и фенотипических особенностей, выражающихся в полиморфизме белков, в первую очередь ферментов метаболизма и детоксикации ксенобиотиков (ФМДК), других защитных белков и кодирующих их синтез генов [1-12]. Главной функцией суперсемейства ФМДК, представленного множественными изоформами цитохрома Р-450 (I фаза метаболизма), эпоксидгидратаз (ЭГ), глутатион 8-трансфераз (Г8Т), УДФ-глюкуронозил-тран-сфераз, сульфотрансфераз и других (II фаза метаболизма), является детоксикация ксенобиотиков, некоторых эндогенных метаболитов и поддержание клеточного и органного гомеоста-
за. Нарушение в результате полиморфизма ФМДК сбалансированности либо всей системы детоксикации, либо ее отдельных звеньев является причиной повышенной предрасположенности к развитию различных заболеваний, особенно в экологически неблагоприятных регионах. Известно, что полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), широко представленные в окружающей среде, являются про-канцерогенами и их метаболизм у млекопитающих проходит через стадии образования чрезвычайно активных интермедиатов типа эпокси-дов и диолов ПАУ, которые могут вызывать токсичные, мутагенные и канцерогенные эффекты. Работы по оценке потенциальной опасности ПАУ в зависимости от активности системы ФМДК были начаты еще в 1970 г. Однако сложности с определением эпоксидсинтетазной ак-
тивности цитохрома Р-450 не позволяли проводить точное прогнозирование развития тех или иных патологий. Разработанная нами методика определения активности эпоксидсинтетазы [13—15], с учетом активностей ПАУ-гидрокси-лазы, ЭГ и Г8Т, была положена в основу определения так называемого условного критерия метаболического статуса организма (УКМСО) [4,5]. Важность близких значений УКМСО для донора и реципиента была нами показана при пересадке лоскутов кожи [16, 17]. В данной работе исследована связь метаболического статуса организма с риском проявления токсичности и мутагенности ПАУ в модельных опытах на генетически различающихся инбредных линиях мышей.
Материалы и методы исследования. Эксперименты проводили на половозрелых самцах двух линий мышей — C57Black/6JRap (В6) и DBA/2JRap ^2), различающихся по значениям УКМСО (В6 > D2) [4]. При этом у мышей В6 активность ферментов II фазы метаболизма была выше, а I фазы — ниже, чем у мышей линии D2. Активность ферментов в микросомальных и цитозольных фракциях печени определяли по методикам, опубликованным ранее [4, 13-15]. Животных содержали в стандартных условиях вивария и стандартном корме. Испытуемые вещества — бенз(а)антрацен и неконкурентный
ингибитор микросомальной ЭГ — 2,2-дибромо-1-(4-нитрофенил)этанон (Элдридж, США) [18], а также их смесь (1:1), вводились в/бр., в виде масляных растворов, в дозах, вызывающих хроническую и подострую токсичность. В каждой группе использовали по 10 животных — в случае введения индивидуальных веществ и по 20 особей — для смеси веществ при дозах 1, 6 и 11 мг/кг. При дозе 3 мг/кг было использовано 90 особей каждой линии мышей. Животные находились под наблюдением до 12-17 мес., в течение которых фиксировали смертность и проводили патолого-анатомическое вскрытие и морфологическое изучение органов и тканей животных. Оставшихся в живых к этому сроку мышей забивали в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» МЗ РФ.
Мутагенность веществ и их смесей оценивали с помощью теста Эймса на индикаторном штамме Salmonella typhimurium TA 1538 без активации и с активацией микросомами печени мышей, как это описано ранее [19, 20].
Результаты и обсуждение. Исследование ко-мутагенного действия химических соединений представляет интерес с практической точки зрения, поскольку человек подвергается воздействию преимущественно комбинации веществ. Известно, что мутагенный эффект ПАУ
Таблица
Мутагенная активность бенз(а)антрацена, 2,2-дибромо-1 -(4-нитрофенил)этанона и их комбинации
на индикаторном штамме S. typhimurium TA 1538
Препарат Доза, мкг/чашку Мутагенность*
без активации с активацией микросомами
1 9 125
10 11 176
Бенз(а)антрацен 50 10 1262
100 12 595
1 14 15
10 24 16
2,2-Дибромо-1 -(4-нитрофенил)-этанон 50 325 58
100 549 230
1 + 1 923 86
10+10 55 663
Смесь бенз(а)антрацена и 2,2-дибромо-1-(4-нитрофенил)-этанона (1:1, вес.) 50 + 50 8 2856
100 +100 10 1412
Контроль Диметилсульфоксид 3 -Метилхолантрен 0,1 мл 100 11 65 15 266
зависит от их метаболической активации в микросомах печени. Индукция или ингибирова-ние отдельных ферментов, участвующих в метаболизме ПАУ, может усиливать или ослаблять их мутагенные и канцерогенные свойства. В сравнительном, межвидовом эксперименте, с использованием микросом печени нелинейных мышей и крыс, в тесте Эймса было показано, что крысы обладают более эффективной антимутагенной системой защиты ФМДК, чем мыши. Добавление ингибитора ЭГ — трихлорпро-пен оксида, приводило к усилению мутагенного эффекта бенз(а)пирена [21]. В наших опытах, ингибирование ЭГ 2,2-дибромо-1-(4-нитрофе-нил)этаноном также приводило к увеличению мутагенного эффекта бенз(а)антрацена (табл.).
Как следует из табл., бенз(а)антрацен проявляет мутагенную активность только в результате метаболической активации, и в дозе 50 мкг/чашку увеличивает число мутантных колоний более чем в 80 раз по сравнению с контролем. 2,2-дибромо-1-(4-нитрофенил)этанон индуцирует мутации у бактерий и без метаболической активации, однако, его мутагенная активность снижается в присутствии микросом. При одновременном использовании бенз(а)антраце-на и 2,2-дибромо-1-(4-нитрофенил)этанона для обработки индикаторных бактерий в присутствии микросом происходит увеличение их мутагенного эффекта. Так, смесь этих веществ (50+50 мкг/чашку) приводит к увеличению числа мутантных колоний почти в 200 раз по сравнению с контролем. Это является убедитель-
ным доказательством того, что ингибирование ЭГ вызывает резкое увеличение мутагенной активности бенз(а)антрацена.
В экспериментах на животных in vivo нами были получены данные, подтверждающие связь между генетически детерминированным метаболическим статусом линейных мышей и их устойчивостью к токсическому действию про-канцерогенов. На рис. 1 приведены результаты изучения токсичности бенз(а)антрацена у мышей линий B6 и D2.
Приведенные данные свидетельствуют о более высокой чувствительности к ПАУ линии мышей В6 по сравнению с линией D2. Для линии В6 наблюдали острую токсичность со 100% летальным исходом на 14-й день при дозах бенз(а)антрацена 50 и 30 мг/кг, тогда как для линии D2 гибели животных не наблюдалось. При этих дозах мыши линии D2 погибали лишь на 3-й мес. от начала эксперимента. При более низких дозах (10, 5 и 1 мг/кг) для линии В6 гибель наблюдали до 9-ти мес. К 12 мес. количество выживших животных линии В6 составляло лишь около 25% при дозе 1 мг/кг. При других дозах ПАУ выживших животных не было, в то время как для линии D2 на 6-12 мес. количество выживших животных составляло 50% при дозе бенз(а)антрацена 10 мг/ кг, 60% — при дозе 5 мг/кг и 70% — при дозе 1 мг/кг.
Совершенно противоположный эффект был получен при ингибировании активности ЭГ неконкурентным ингибитором этого фермента — 2,2-ди бром о -1 -(4-нитрофенил)этаноном
*
а 2 х ь о ш S
X о
5
3
ш S
X 2 са
О 0,25 0,5 1 2 2,4 2,6 3 4 5 6 7 7,5 8 9 10 11 12
Месяцы
Рис. 1. Динамика устойчивости мышей линий DBA/2JRap ф2) и C57Black/6JRap ^6) к токсическому и мутагенному воздействию бенз(а)антрацена
100
£ ®
2 х ь О в s
X ф
s Э п
S
*
2 ш
0,07 0,25 0,5 1
9 10 11 12 14 17
Линия мышек
и доза (мг/кг
—♦— В 6-20
-■- D2-20
--D2-10
—X— В6-10
-Ж-В6-5
—•— В6-1
—I— D2-5
-D2-1
Рис. 2. Вариабельность токсичности 2,2-дибромо-1-(4-нитрофенил)-этанона для мышей линий D2 и В6
(рис.2). Из приведенных данных следует, что это вещество проявляет острую токсичность при дозах 20 и 10 мг/кг для линии D2 и 20 мг/кг для В6 со 100% летальным исходом. Все мыши линии D2 погибли к 7 мес. при дозах 5 и 1 мг/кг, в то время как гибель мышей линии В6 прекращалась к 5 мес. и на 17 мес. количество выживших животных составляло 60% при дозе 10 мг/кг, 70% при дозе 5 мг/кг и 75% при дозе 1 мг/кг.
Ещё более значительные различия были получены при комбинированном введении ПАУ — бенз(а)антрацена и ингибитора активности ЭГ — 2,2-дибромо-1-(4-нитрофенил)этанона (смесь 1:1, весовых) (рис. 3). Смесь вводилась в дозах 1, 3, 6 и 11 мг/кг. Острая токсичность при этих дозах наблюдалась, в основном, для мышей линии D2. Все мыши линии D2 погибли к 3 мес. при дозах 11, 6 и 3 мг/кг. Количество выживших животных линии D2 к 14 мес. наблюдений состави-
#
ф 2 х ь о п S
к ф
S
Э а
л
СО
0 0,5 1
Рис.3. Селективность действия смеси бенз(а)антрацена и 2,2-дибромо-1-(4-нитрофенил)этанона (1:1, весовых) на мышей линий D2 и В6
ло всего 15% при дозе 1 мг/кг, тогда как среди мышей линии В6 при этой дозе и на протяжении этого срока гибели не наблюдалось и количество выживших животных составляло 100%. Гибель мышей линии В6 при дозах 3 и 6 мг/кг прекращалась к 2 мес., и количество выживших животных к 14 мес. составляло 75% при дозе 6 мг/кг, и 80% при дозе 3 мг/кг.
Результаты патолого-анатомического вскрытия павших животных от введения смеси ПАУ с ингибитором ЭГ показали, что во всех группах мышей линии D2, получивших разные дозы и исследованные в разные сроки, обращает на себя внимание общая для них картина поражения элементов крови и кроветворной ткани: гемолиз эритроцитов, наблюдаемый в сосудах легких, печени и почек, часто с наличием гиалиновых тромбов в просвете, очаги экстрамодулярного кроветворения в печени, изменения в селезенке в виде гиперплазии лимфоидно-ретикулярной ткани с наличием очень большого количества мегакариоцитов. Все эти изменения свидетельствуют о нарушении процессов костно-мозгово-го кроветворения. Общая картина морфологических изменений в органах у животных линии В6, хотя и выраженная не столь значительно, сходна с изменениями, наблюдаемыми в органах мышей линии D2, и интерпретация их аналогична. Однако картина изменений в селезенке, сходная в отношении количества мегакариоцитов, резко отличается по выраженности гиперпластических процессов лимфоидно-рети-кулярных элементов — у мышей линии В6 значительно выражена их редукция.
Патолого-анатомический анализ выживших животных на 14-17 мес. показал следующее: 2,2-дибромо-1-(4-нитрофенил)этанон в дозе 1 мг/кг не вызывал каких-либо видимых изменений во внутренних органах мышей линии В6, а при дозах 5 и 10 мг/кг у 30% животных была выявлена атрофия селезенки, увеличенная печень, изменения почек, гипертрофированный мочевой пузырь. Бенз(а)антрацен в дозе 1 мг/кг не вызывал каких-либо изменений внутренних органов мышей линии D2, за исключением 1 особи, у которой была обнаружена гепатома. При дозах 5 и 10 мг/кг у всех выживших животных выявлена патология, в том числе гипертрофия селезенки, опухоль тимуса, точечные образования печени и брыжейки. В группе животных, которым вводилась смесь бенз(а)антрацена с 2,2-дибромо-1-(4-нитрофенил)-этаноном в дозах 1 и 3 мг/кг, у мышей линии В6 органы — без видимых изменений, за исключением 1 мыши, у которой обнаружена внутрибрюшинная опухоль. У всех переживших к этому времени мышей линии D2, наоборот, наблюдали многочисленные опухоли лимфоузлов и печени.
Таким образом, полученные результаты ука-
зывают на связь внутривидовых генетических особенностей линейных животных с их чув-стви тель но стью к ток сич ным ве ще ствам. При этом состояние системы ФМДК может определять эту чувствительность. Известно, что мыши ли нии В6 чув стви тель ны к ток си че ско му дей -ствию диметилбенз(а)антрацена при перораль-ном введении и к изъязвлению кожи при накожной аппликации, в отличие от мышей линии D2 [22, 23]. Полученные нами данные при в/бр. введении бенз(а)антрацена выявили высокую чувствительность мышей линии В 6 к этому ПАУ, по сравнению с линией D2 (рис. 1). Это может быть связано с тем, что линия мышей В6 обладает почти в 2 раза более высокой активностью ЭГ, чем линия D2. Образующиеся из эпо-ксидов ПАУ дигидродиолы могут снова эпокси-дироваться на цитохроме Р-450, что приводит к накоплению чрезвычайно токсичных, мутагенных и канцерогенных дигидродиол-эпоксидов ПАУ, которые уже не являются субстратами ЭГ [24]. Пониженная активность ЭГ, как в случае с мышами линии D2, может быть ингибирована значительно меньшими количествами ингибитора, что также приводит к накоплению реакционно-опасных метаболитов (рис. 2 и 3).
Заключение. Полученные данные подтверждают существование связи между генетически детерминированными индивидуальными особен но стя ми ме та бо ли че ских про цес сов и чув -ствительностью к токсическому и мутагенному действию полициклических ароматических углеводородов. В этих процессах важную роль играет активность и полиморфизм системы ферментов метаболизма и детоксикации ксенобиотиков. При оценке потенциальной опасности веществ необходимо учитывать их возможное влияние (индукция или ингибирование) на активность ферментов, участвующих в их метаболизме, в том числе лекарственных препаратов.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ по гранту №05-04-49799 и Программы научных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине».
Список литературы
1. Pharmacogenomics. The Search for Individualized Therapies (Licinio J., Wong M, eds.). Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany; 2002. - 559 с.
2. Пирузян Л.А. О фармакологической метрологии // Изв. АН СССР. Сер. биол, 1990. - № 2. -С. 302-304.
3. Пирузян Л.А., Суханов В.А., Саприн А.Н. Прогностический фактор риска развития патологических процессов, основанный на полиморфизме ферментов метаболизма ксенобиотиков // Физиол. чел, 2000. - T. 26. - № 2. - C. 115-123.
4. Пирузян Л.А., Суханов В.А., Калинина Е.В. и др. Медико-биологические аспекты метаболического портретирования //ДАН, 2001. - T. 377. -
С. 129-131.
5. Пирузян Л.А., Суханов В.А., Калинина Е.В. и др. Ферментная система метаболизма и деток-сикации ксенобиотиков как основа метаболического портретирования при прогнозировании риска развития патологических процессов // Изв. АН. Сер. биол., 2002. - № 2. - С. 149-154.
6. Пирузян Л.А, Михайловский Е.М. Метаболическое организменное популяционное конструирование онкологической патологии при генетической предрасположенности индивидуумов. Сообщение I// Физиол. чел., 2001. - Т. 27. - № 3. - С. 113-121.
7. Пирузян Л.А, Михайловский Е.М. Метаболическое организменное популяционное конструирование онкологической патологии при генетической предрасположенности индивидуумов. Сообщение II // Там же, 2002. -Т. 28. - № 1. - С. 101-115.
8. Пирузян Л.А, Михайловский Е.М. Метаболическое организменное популяционное конструирование онкологической патологии при генетической предрасположенности индивидуумов. Сообщение III // Там же, 2002. -Т. 28. - № 5. - С. 103-111.
9. Пирузян Л.А, Михайловский Е.М. Метаболическое организменное популяционное конструирование онкологической патологии при генетической предрасположенности индивидуумов. Сообщение IV // Там же, 2003. -Т. 29. - № 2. -С. 118-126.
10. Пирузян Л.А., Радкевич Л.А., Морозова Н.В. Метаболическое этническое портретирова-ние в стратегии подбора фармакотерапии на примере N-ацетилирования и хронических патологий печени//ДАН, 2003. -Т. 388. - С. 842-844.
11. Пирузян Л.А. Метаболический паспорт человека - основа новой стратегии в фармакологии // Вестник РАН, 2004. - Т. 74. - № 7. - С. 610-618.
12. Суханов В.А., Саприн А.Н., Пирузян Л.А. Фармакогенетические проблемы противоопухолевой терапии //Хим. Фарм. журнал, 2004. - Т. 38. - № 7. - С. 3-9.
13. Сотниченко А.И., Суханов В.А, Саприн А.Н. Микросомальный метаболизм 3,4-бензпирена. 1. Ускоренное хроматографическое разделение и идентификация метаболитов в потоке // Хим. Фарм. журнал, 1985. - Т. 19. - № 12. - С. 1435-1441.
14. Сотниченко А.И., Суханов В.А., Саприн А.Н. Микросомальный метаболизм 3,4-бензпире-на. 2. Количественное определение преканцероген-
ного 7,8-диокси-7,8-дигидробензпирена // Хим. Фарм. журнал, 1986. - Т. 19. - № 1. - С. 28-31.
15. Сотниченко А.И., Cердюк О.А., Старовой-тов М.А. и др. Хроматографический метод определения активности мембранной эпоксидгидрола-зы // Антибиотики и мед. биотехнология, 1985. — № 7. - С. 535-539.
16. Шумаков В.И., Василенко В.Т., Гасанов Э.К. и др. О роли метаболического статуса донора и реципиента в процессах приживления полно-слойного кожного лоскута //ДАН, 2003. - Т. 388.
- № 5. - С. 708-710.
17. Шумаков В.И., Василенко В.Т., Гасанов Э.К. и др. Значимость метаболического статуса донора и реципиента в процессах приживления полнослойного кожного лоскута по данным гистологического анализа // Физиол. человека, 2004. -Т. 30. - № 4. - С. 69-74.
18. Dietze E. C. Inhibition of Epoxide Hydrolases from human, monkey, bovine, rabbit and murine liver // Comp. Biochem. Phisiol. [B], 1993. - V. 104. - № 2. - P. 309-314.
19. Ames B.N. Simple test for carcinogenesis: combination microsomes with Salm. Typhimurium // PNAS USAi, 1973. - V. 70. - P. 2281-2283.
20. Любимова И.К., Абилев С.К., Гальберстам Н.М. и др. Компьютерное предсказание мутагенной активности замещенных полициклических соединений //Известия АН, сер. биол., 2001. - № 2.
- С. 180-186.
21. Oesch F. Antimutagenesis by shift in monoox-ygenase isoenzymes and induction of epoxide hydrolase //Mutation Res., 1988. - V. 202. - P. 335-342.
22. Schmid F.A., Dickey P.A., Stanco J.A. et al. Toxicity of intraperitonial injections of DMBA and other agents in inbred mice // Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 1966. - V. 7. - P. 62-65.
23. Festing M. Inbred strains ofmice// Mouse Genome Informatics. The Jackson Lab., 1998. Leicester, UK.
24. Guenthner T.M., Oesch F. Microsomal Epoxide hydrolase and its role in poly cyclic aromatic hydrocarbon biotransformation // Polycyclic hydrocarbons and cancer, 1981. (Ed. Gelboin H., Tso P.). Acad. Press - V. 3. - P. 183-211.
Материал поступил в редакцию 21.09.05.
V.ASukhanov1, AN.Saprin1, Ye.V.Kalinina1, S.K.Abilev2, L.A.Piruzyan1
ROLE OF THE ORGANISM METABOLIC STATUS IN SUSCEPTIBILITY TO TOXIC AND MUTAGENIC EFFECTS POSED BY POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS (investigations on inbred strains of mice)
Center for theoretical problems of physical and chemical pharmacology, Russian Academy of Sciences 2N.I.Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow
It is shown that mice strains DBA/2 and C57/Black/6 have a different susceptibility to toxic and mutagenic effects posed by benz(a)anthracene and epoxyhydratase inhibitor — 2,2 dibromo-1-(4-nitrophenyl)-ethanone and their combinations. The different susceptibility of mice may be linked to the metabolic status and first of all to levels of epoxidesyntetase activity of cytochrome P-450 and epoxidehydratase.
