CC BY
20© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 О.В.Маркина1, Л.П.Алексеева1, Н.В.Маркин2
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТОВ РАСТЕНИЙ НА ЦИТОТОКСИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕМОЛИЗИНА VIBRIO CHOLERAE
1Ростовский-на-Дону противочумный институт, 2НИИ биологии Южного Федерального университета, Ростов-на-Дону
Цель. Изучение экстрактов растений, обладающих способностью нейтрализовать цитотоксическую активность гемолизина. Материалы и методы. Использованы препараты очищенного и рекомбинантного гемолизина V.cholerae eltor, а также супернатанты штаммов V.cholerae. Определение цитотоксической активности гемолизина и нейтрализующей активности растительных экстрактов проводили с помощью культур клеток СНО-К1 и CaCo2. Результаты. Из 9 водных экстрактов только три — экстракты ревеня, кермека и дуба нейтрализовали гемолизин в культуре клеток СНО-К1 и CaCo2, тогда как остальные экстракты (хмеля, базилика, чистотела, грецкого ореха, тысячелистника и зверобоя) не обладали антицитотоксическим эффектом. Нейтрализующие свойства экстрактов проявляются при их совместном инкубировании с препаратами гемолизинов и супернатантами штаммов V.cholerae уже в течение 10 минут. Заключение. Экстракты растений, обладающие антицитотоксической активностью в отношении гемолизина, перспективны для разработки лечебно-профилактических препаратов.
Журн. микробиол., 2013, № 4, С. 10—16
Ключевые слова: гемолизин, Vibrio cholerae, растительные экстракты, культура клеток O.V.Markina1, L.P.Alekseeva1, N.V.Markin2
EFFECT OF PLANT EXTRACTS ON CYTOTOXIC ACTIVITY OF VIBRIO CHOLERAE HEMOLYSIN
1Rostov-on-Don Institute of Plague Control, 2Research Institute of Biology of Southern Federal University, Rostov-on-Don, Russia
Aim. Study of plant extracts that have the ability to neutralize cytotoxic activity of hemolysin. Materials and methods. Preparations of purified and recombinant V. cholerae eltor hemolysin as well as supernatants of V. cholerae strains were used. Determination of cytotoxic activity of hemolysin and neutralizing activity of plant extracts were carried out by using cell cultures СНО-К1 and CaCo2. Results. Out of 9 water extracts only 3 — extracts of Rhei rhizome, Limonium gmeli-nii and Quercus robur neutralized hemolysin in cell culture CHO-K1 and CaCo2, whereas the other extracts — Humulus lupulus, Ocimum basilicum, Chelidonium majus, Juglans regia, Achillea milefolium and Hypericum perforatum did not have anti-cytotoxic effect. Neutralizing properties of extracts are exhibited during their co-incubation with hemolysin preparations and supernatants of V. cholerae strains already within 10 minutes. Conclusion. Plant extracts that have anti-cytotox-ic activity against hemolysin are perspective for development of therapeutic-prophylaxis preparations.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 4, P. 10—16
Key words: hemolysin, Vibrio cholerae, plant extracts, cell culture
ВВЕДЕНИЕ
Большинство штаммов Vibrio cholerae eltor и V.cholerae nonO1/nonO139 секре-тирует гемолизин, который подобно другим пороформирующим белкам вызывает вакуолизацию и последующую гибель клеток в культуре СНО-К1, HeLa и др.
[4, 15]. Известно, что нейтрализующей активностью в отношении гемолизина холерных вибрионов помимо специфических иммуноглобулинов обладают асиа-лированные гликопротеины, например, асиалофетуин и асиалотиреоглобулин, содержащие в своем составе свободную в1-галактозу, а также холестерол, который снижает цитотоксическую активность цито-/гемолизина за счет ускорения пен-тамеризации его олигомеров, результатом чего является образование продукта функционально не идентичного нативной молекуле токсина [2, 5, 10, 16]. Поиск принципиально новых химически активных соединений, способных инакти-вировать гемолизин, позволил обнаружить растения, богатые различными биологически активными веществами, которые обладают высокой антицито-токсической активностью. В частности, в 1990-е гг. японскими учеными [14] было описано, что галлаты катехина и эпикатехина зеленого чая обладают способностью нейтрализовать как альфа-токсин Staphylococcus aureus, так и гемолизин V.cholerae О1. К сожалению, в последнее время работ в этом направлении практически нет. В то же время, исследования экстрактов растений, обладающих цитотоксиннейтрализующей активностью, представляют практический интерес, так как в перспективе могут быть использованы в лечебно-профилактических мероприятиях на территориях, где гемолитические штаммы вызывают спорадические и групповые случаи заболевания. В связи с этим, целью работы явилось изучение на модели культуры клеток цитотоксиннейтрализующего действия экстрактов растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали препарат очищенного гемолизина V.cholerae eltor 9949. Источником рекомбинантного гемолизина служили клетки штамма Escherichia coli D1210 pES4H с клонированным геном hlyA V.cholerae eltor [1]. В работе использовали также супернатанты 32 штаммов V.cholerae nonO1/nonO139 и 4 штаммов V.cholerae eltor (табл.), которые отбирали после центрифугирования при 6000 об./мин. в течение 30 минут клеток, выращенных на среде AKI по Iwanaga без аэрации, обеззараживали с помощью гентамицина до конечной концентрации 0,5 мг/мл, после чего проверяли на специфическую стерильность.
Определение биологической активности гемолизинсодержащих препаратов проводили в культуре клеток. Для этого изучаемые образцы вносили в 96-луноч-ные панели в объеме 0,05 мл 1% культуральной среды с предварительно внесенными клетками перевиваемых клеточных линий СНО-К1(овариальные клетки китайского хомячка) и CaCo2 (эпителиальные клетки тонкого кишечника человека). Панель инкубировали в течение ночи в СО2-инкубаторе. Учет реакции клеток проводили, сравнивая морфологию опытных и контрольных клеток с помощью инвертированного микроскопа. За цитотоксическую дозу принимали минимальное количество препарата или разведения супернатанта, вызывающего гибель 50% клеток популяции. Специфичность реакции, вызванной действием препаратов гемолизина, подтверждали с помощью антигемолитической сыворотки (АГС), которую получали путем иммунизации мышей BALB/c препаратом рекомбинантного гемолизина.
Водные экстракты (Эк) растений готовили из высушенных листьев дуба че-решчатого (Quercus robur), грецкого ореха Jglans regia), а также цветков и листьев зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum), тысячелистника (Achillea
Характеристика штаммов V.choleгae, использованных в работе
Штаммы Наличие генов Серогруппа Происхож- Число
дение штаммов
У.сЫо1егае поп01/поп0139 ах-, 1ср-, ЫуА+ О67, О53, О76 вода 10
ах-, 1ср-, Ы1уА+ О83 человек 3
Сх+, 1ср+,Ы1уА+ О74, О41, О9, человек 19
О15, О37, О62
У.сЫо1егае еНог ах-, 1ср+, Ы1уА+ 01 человек 2
У.сЫо1егае еНог ах-, 1ср+, Ы1уА+ 01 вода 2
шШе1о1шш), чистотела (СЫеИёопшш шгуш), базилика (Ое1шиш Ъа8Шсиш), корня ревеня (Rhei rhizoшa), корня кермека (Liшoniuш gmelinii), а также шишек хмеля (НйшШш 1ири1и8). Для этого к 1 г высушенного и измельченного растительного сырья добавляли 5 мл дистиллированной воды и экстрагировали течение 16 часов при 4°С [12].
Для определения нейтрализующей активности экстракты и антигемолитическую сыворотку в различных концентрациях смешивали с препаратами гемолизина и инкубировали в течение 30 минут при 37°С, затем смеси титровали и переносили в лунки с клетками СНО-К1. Учет реакции вели через 24 часа.
Фотографирование клеток, не окрашенных и окрашенных 1% раствором ген-цианвиолета, проводили с помощью инвертированного микроскопа и цифрового фотоаппарата. Для этого клетки промывали раствором ФСБ, затем влажный монослой фотографировали через прозрачное дно панели с увеличением 20х15, 40х15.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В культуре клеток СНО-К1 биологическая активность препаратов очищенного гемолизина У.сЫо1егае еког 9949 и рекомбинантного гемолизина, полученного из штамма Е.соИ D1210 pES4H, составила 1 мкг/мл и 10 пг/мл, соответственно. Начальным этапом их цитотоксического действия явилась массовая вакуолизация клеток с последующим их лизисом (рис. 1, В, Г). При этом образование множества мелких вакуолей наблюдали уже в течение 1 — 2 часов воздействия препаратов гемолизинов. Специфичность реакции вакуолизации клеток, вызванной действием препаратов гемолизина, была подтверждена с помощью антигемолитической сыворотки.
Из 32 супернатантов штаммов У.сЫо1егае поп01/поп0139 супернатанты только 5 водных и 6 человеческих штаммов вызывали гибель клеток СНО-К1 в достаточно высоких разведениях (порядка 1:500-1:10000). Активность трех супернатантов У.сЫо1егае еког составляла в среднем 1:500. Все эти супернатанты в течение первых 2 часов воздействия приводили к образованию в клетках СНО-К1 множества мелких вакуолей (рис. 1, В). Для дальнейшей работы были отобраны штаммы, наиболее активно продуцирующие цитотоксин: У.сЫо1егае еког 18507, У.сЫо1егае еког 14863, У.сЫо1егае поп01/037 № 5444, У.сЫо1егае поп01/083 № 18132 и V. сЫо1ега поп01/013 № 18359. Они были гемолитичны в пробе Грейга, и АГС снижала их активность в культуре клеток СНО-К1, свидетельствуя, что цитотоксич-ность супернатантов напрямую связана с присутствием в них гемолизина.
рЁййашЮв^оу ШШШм
ШВш
Рис. 1. Морфологические изменения клеток СНО-К1 (А-Д) и CaCo2 (Е-З).
А — клетки типичной морфологии; Б — вакуолизация и гибель клеток под действием токсинов или группы ферментов супернатантовУЛо1е-гае; В — вакуолизирован-ные клетки под действием гемолизина УЛо-1егае еНог 18507 (hlyА+); Г — гибель клеток под действием гемолизина V.cho1eгae е^ог 18507 (h1yА+); Д — вакуоли, образованные под действием супернатанта УЛо-1егае е^ог 18507 (ЫуА+) + Эк дуба; Е — клетки типичной морфологии; Ж — образование мелких вакуолей в клетках под действием гемолизина; З — гибель клеток под действием гемолизина УЛо1егае еНог 18507(ЫуА+). А — Д — клетки, окрашенные 1% раствором генцианвиолета, Е — З — неокрашенные. А, Б, Г — З (ув. 15х20), В (ув. 15х40).
Остальные супернатанты холерных вибрионов поп01/поп0139 обладали низкой цитотоксичностью в разведениях 1:5 — 1:50, но поскольку реакция гибели клеток не аналогична вышеописанной, то мы предположили, что она вызвана не гемолизином, а действием других токсинов или группой ферментов (рис. 1, Б) [2].
Убедившись предварительно, что вакуолизация и гибель клеток СНО-К1 вызвана действием гемолизина, мы включили в исследование водные Эк растений: корень ревеня, корень кермека, листья дуба, грецкого ореха, цветки и листья чистотела, зверобоя, тысячелистника, базилика и шишек хмеля. Их биологическая активность вначале была изучена в культуре клеток СНО-К1. Установлено, что все растительные Эк в низких разведениях (до 1:10) вызывают гибель клеток. Кроме этого, Эк чистотела приводил к появлению многоядерных клеток с крупной цитоплазмой и неровными краями, что указывает на нарушение их деления и изменение цитоскелета, связанного с потерей ее полярности. Поэтому для дальнейшей работы были подобраны индивидуальные разведения Эк, не влияющие на структуру и функциональную активность клеток СНО-К1. После этого каждый Эк был инкубирован с препаратом рекомбинантного гемолизина в течение 30 минут при 37°С. Оказалось, что из девяти только два (Эк корня кермека и Эк ревеня в разведениях 1:20 — 1:50) нейтрализуют его цитотоксическое действие более чем в 20 раз, так как в этом случае препарат гемолизина вызывал гибель клеток уже в концентрации 200 пг/мл. Эк дуба снижал активность гемолизина только в 2 — 3 раза. В случае нейтрализации гемолизина Эк из корня ревеня в лунках регистрировали клетки типичной морфологии, при использовании же экстрактов из листьев дуба и в меньшей степени из корня кермека в определенных
Рис. 2. Нейтрализующая активность экстрактов ревеня, кермека и дуба в отношении супернатантов V.choleгae с^г и V.choleгae nonO1/nonO139 в культуре клеток CНО-К1.
разведениях в клетках СНО-К1 наблюдали появление гигантских вакуолей (рис. 1, Д). Эк нейтрализовали цитотоксическое действие супернатантов всех испытуемых штаммов У.сЫо1егае еког и У.сЫо1егае поп01/поп0139, при этом Эк ревеня и Эк кермека снизили цитотоксическую активность супернатантов примерно в 20 раз, а Эк дуба — в 2 — 3 раза (рис. 2).
Для того чтобы определить, возможна ли защита клеток от гибели путем предварительного внесения Эк в среду культивирования, Эк ревеня был добавлен в лунки панели с монослоем клеток СНО-К1 за 5 мин до внесения препарата гемолизина. Однако это не предотвратило их лизис, хотя процесс вакуолизации и последующей их гибели во времени был замедлен, в то время как предварительная инкубация Эк ревеня с супернатантами даже в течение 10 минут при 37°С является достаточно эффективной в плане снижения их цитотоксической активности.
Культуры клеток являются альтернативой биологическим методам, и поэтому особый интерес представляют эксперименты, если в них использованы линии клеток человеческого происхождения. В работе были использованы перевиваемые эпителиальные клетки тонкого кишечника человека ааао2. На монослое клеток данной линии были протестированы смеси, включающие гемолизин и Эк ревеня или Эк кермека. Оказалось, что в культуре клеток ааао2 экстракты нейтрализуют действие препаратов гемолизина и вышеуказанных гемолитических супернатантов штаммов У.сЫо1егае еког и У.сЫо1егае поп01/поп0139. Как видно на рис.1, гемолизин, присутствующий в супернатанте У.сЫо1егае еког 18507, в титре 1:500 вызывает вакуолизацию клеток СаСо2, их последующее отделение от пластика и гибель. После инкубации гемолизинсодержащего супернатанта с Эк ревеня или Эк кермека регистрировали защиту эпителиоцитов от порообразующего действия гемолизина, поскольку при разведении супернатанта до 1:50 погибших клеток уже не наблюдали.
ОБСУЖДЕНИЕ
Вакуолизация животных клеток является ответной реакцией на воздействие бактериальных секретируемых поробразующих белков [6, 11]. Эти вакуоли нами были обнаружены как при тестировании очищенных препаратов гемолизина
V.cholerae O1, так и супернатантов V.cholerae O1 и V.cholerae nonO1/nonO139. По размеру, локализации в клетке, их большому числу они заметно отличаются от вакуолей, образуемых под действием других токсинов или ферментов. Подтверждением же специфичности данной реакции явилась ее нейтрализация с помощью полученной нами АГС к рекомбинантному гемолизину. Установив, что гибель клеток в культуре вызвана именно гемолизином, нами были испытаны смеси растительных Эк с препаратами гемолизина. В результате показано, что Эк ревеня, кермека и дуба обладают выраженными нейтрализующими свойствами. Наиболее эффективным оказался Эк, полученный из корня ревеня. Он снизил активность гемолизина более чем в 20 раз. Toda M. et al. [14] показали, что подобным свойством в отношении гемолизина V.cholerae O1 обладают галлаты эпикатехина и эпигаллокатехина, содержащиеся в зеленом чае. Эти же соединения были обнаружены и в корне ревеня [8]. Можно, предположить, что аналогично Эк зеленого чая Эк ревеня ингибирует активность гемолизина благодаря содержащимся в нем галлатам эпикатехина и эпигаллокатехинам. Не исключено, что в этом процессе принимают участие и другие полифенольные соединения, многочисленно представленные в корне ревеня. Так, в корневищах ревеня накапливается до 12% дубильных веществ, представленных дубильными веществами конденсированной группы, таноглюкозидами и продуктами их распада. К ним относятся глюкогаллин (глюкозид галловой кислоты, или моногаллоил-^-D-глюкоза), тетрарин (продуктами его расщепления является глюкоза, альдегид реосмин, галловая и коричная кислоты), ратаннин, процианидины, антраглико-зиды (реохрезины, эмодины), флавонолы (рутин, кверцетин, гиперозид), анто-цианы, фитостерины, пектины, крахмал, глюкоза и др. Из корней некоторых видов ревеня выделены полисахариды, которые являются кислыми гетероглика-нами с мол. м. 110 и 250 KD, соответственно, их основными компонентами являются остатки глюкозы, галактозы, арабинозы, рамнозы, ксилозы, глюкуроновой и галактуроновой кислот [17]. По данным [2, 3] гемолизин содержит лектиновые домены, в связи с этим, одним из путей снижения цитотоксической активности после его инкубирования с Эк ревеня, вполне возможно, является его реакция с каким-либо сахаросодержащим соединением. Ингибирующий эффект Эк дуба мы связываем с содержащимися в нем гидролизуемыми танинами, которые способны образовывать с белками высокомолекулярные комплексы, препятствуя их взаимодействию с клеточными рецепторами. Однако нейтрализующий эффект этого Эк был гораздо слабее, чем Эк ревеня. Испытание Эк корня кермека показало, что он обладает эффективным антицитотоксическим свойством, немногим уступая Эк ревеня. Вполне возможно, что это связано с присутствием в нем наряду с танинами таких биологически активных веществ, как d-катехины, галло-катехины, галлокатехин галлаты, эпигаллокатехин галлаты, флаван-3-олы и др. [7]. Исследование супернатантов гемолитичных холерных вибрионов (HlyA+) показало, что Эк ревеня и кермека нейтрализуют не только гемолизин шатаммов V.cholerae О1, но и гемолизин V.cholerae non01/non0139.
Поскольку холерные вибрионы неО1 серогруппы, hlyA+, являются естественными обитателями водоемов и способны вызывать спорадические и групповые заболевания по типу пищевых токсикоинфекций [9, 13], то дальнейшее изучение антицитотоксической активности растительных Эк несомненно представляет практический интерес. Последующее комплексное исследование антибактери-
альных свойств экстрактов в микробиологических методах и опытах in vivo позволит оценить возможность их применения при разработке лечебно-
профилактических препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Власов В.П., Монахова Е.В., Ушакова И.Е. и др. Гемолизин Vibrio cholerae eltor. Мол. генет., микробиол. вирусол. 1992, 7—8: 14-20.
2. Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М., Подосинникова Л.С. Механизмы реализации гемолитической активности холерных вибрионов. Журн. микробиол. 2007, 4: 85-92.
3. Телесманич Н.Р., Безуглова Е.В., Мишанькин М.Б. и др. Роль лектина (hlyA) в гемолитической и гемагглютинирующей активности Vibrio cholerae. Журн. микробиол. 2004, 5: 12-16.
4. Figueroa-Arredondo P., Heuser J.E., Akopyants N. S. et al. Cell vacuolation caused by Vibrio cholerae hemolysin. Infect. Immun. 2001, 69 (3): 1613-1624.
5. Harris J.R., Palmer M. Cholesterol specificity of some heptameric beta-barrel pore-forming bacterial toxins: structural and functional aspects. Subcell. Biochem. 2010, 51: 579-596.
6. Kloft N., Neukirch C., Bobkiewicz W. et al. Pro-autophagic signal induction by bacterial pore-forming toxins. Med. Microbiol. Immunol. 2010, 199: 299-309.
7. Medini F., Ksouri R., Falleh H. et al. Effects of physiological stage and solvent on polyphenol composition, antioxidadant and antimicrobial activities of Limonium densiflorum. J. Med. Plant Research. 2011, 5 (31): 6719-6730.
8. Morinaga N., Iwamaru Y, Yahiro K. et al. Differential activities of plant polyphenols on the binding and internalization of cholera toxin in Vero cells. J. Biol. Chem. 2005, 280 (24): 2330323309.
9. Norton R., Vucak M., Stalewski H. Vibrio cholerae non-O1 facial cellulitis in a North Queensland, Australian child. Pediatr. Infect. Dis. J. 2001, 20(5): 550-551.
10. Saha N., Banerjee K. K. Carbohydrate-mediated regulation of interaction of Vibrio cholerae hemolysin with erythrocyte and phospholipid vesicle. J. Biol. Chem. 1997, 272 (1): 162-167.
11. Saka H.A., Gutierrez M.G., Bocco J.L. et al. The autophagic pathway a cell survival strategy against the bacterial pore-forming toxin Vibrio cholerae cytolysin. Autophagy. 2007, 3(4): 363-365.
12. Sa'nchez E., GarciaS., Heredia N. Extracts ofedible and medicinal plants damage membranes of Vibrio cholerae. Appl. Environ. Мicrobial. 2010, 76 (20): 6888-6894.
13. Suankratay C., Phantumchinda K., Tachawiboonsak W. et al. Non-serogroup O:1 Vibrio cholerae bacteremia and cerebritis. Clin. Infect. Dis. 2001, 32 (7): 117-119.
14. Toda M., Okubo S., Ikigai H. et al. The protective activity of tea against infection by Vibrio cholerae O1. Appl. Bacteriol. 1991, 70 (2): 109-112.
15. Vidal J.E., Enriquez-Rincon F., Giono-Cerezo S. et al. Culture supernatants from V. chol-erae O1 El Tor strains isolated from different geographic areas induce cell vacuolation and aytotoxicity. Salud. Publica Mex. 2009, 51: 39-47.
16. Yamamoto K., Al-Omani M., Honda T. et al. Non-O1 Vibrio cholerae hemolysin: purification, partial characterization, and immunological relatedness to El Tor hemolysin. Infect. Immun. 1984, 45 (1): 192-196.
17. Zhang S.J., Zhang SY, Wang L. Studies on polysaccharide of Rheum palmatum L. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1993, 18 (11): 679-681.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Маркина Ольга Владимировна, к.б.н.,
344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117, р.т. (863)240-27-03
