CC BY
25
УДК 616.932
Е.В.Монахова, Н.К.Михась, Р.В.Писанов, О.И.Сальникова, А.Б.Мазрухо,
I Л.М.Овсова, Б.Л.Мазрухо
ХАРАКТЕРИСТИКА ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ ДИАРЕЕГЕННЫХ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ ХОЛЕРНЫМИ ВИБРИОНАМИ
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Из культуральной жидкости высоковирулентного штамма Vibrio cholerae eltor, лишенного СТХ-элемента, выделены и охарактеризованы по физико-химическим свойствам и биологической активности препараты токсина разной степени очистки. Сравнительный анализ полученных результатов с приведенными в литературе свойствами дополнительных токсинов холерных вибрионов позволяет думать, что выделенный нами новый токсин близок или идентичен новому холерному токсину NCT, описанному Sanyal et al. (1983-1990). Вместе с тем не исключено, что исследуемый штамм одновременно с ним синтезирует цитотоксический фактор RTX [7] и/или цитотонический Cef [8].
На сегодняшний день известны далеко не единичные случаи выделения от больных с холероподобной симптоматикой штаммов холерных вибрионов, лишенных СТХ-элемента. По-видимому, их этиологическая опасность обусловлена рядом дополнительных токсинов, набор которых и уровни экспрессии могут быть неодинаковыми у разных штаммов. Несмотря на то, что заболевания, вызываемые нехолерогенными штаммами, не носят эпидемического характера, они заслуживают более пристального внимания в связи с наносимым ущербом здоровью людей. С другой стороны, поскольку способность к продукции большинства известных дополнительных токсинов выявлена и у холерогенных штаммов, есть все основания предполагать, что эти факторы усиливают тяжесть течения холеры, что может потребовать коррекции подходов к ее лечению и профилактике.
Ранее нами были изучены несколько СТХ-нега-тивных штаммов, выделенных на территории бывшего СССР и способных вызывать эффект, сходный с холерогенным, на модели кроликов-сосунков. Однако развивающийся под их действием комплекс ультраструктурных изменений в тонкой кишке оказался отличным от такового, обусловленного присутствием холерного токсина (СТ) [2]. Продуцируемый ими термолабильный токсин, выявляемый как фактор кожной проницаемости (ФКП) в пробе Крейга, сходен с СТ по биологической активности, а оптимальные условия синтеза обоих токсинов in vitro полностью совпадают [3]. Этот фактор близок NCT (new cholera toxin), описанному в серии работ Sanyal et al. [11-13 и др.]. Однако для выявления его природы и свойств требовались дополнительные исследования.
Целью настоящей работы явилось выделение и характеристика физико-химических свойств и биологического действия диареегенных и цитотоксиче-ских факторов нехолерогенных штаммов холерных вибрионов.
Материалы и методы
В качестве продуцента дополнительного токсина был использован ранее изученный нами ctxAB' zorace"RSrtcpA"toxR+bly+nanH+-mTaMM Vibrio cho-
lerae eltor P-14863 Огава, выделенный в 1991 г. в Одессе от больного с диагнозом «холера» [2]. Контролем служил выделенный из морской воды штамм V. cholerae eltor Р-9337 Огава с таким же генотипом, но абсолютно авирулентный для лабораторных животных.
Для выделения токсических субстанций культуру выращивали в модифицированной триптоно-вой среде, как описано ранее [3], в условиях, способствующих наилучшей продукции ФКП и исключающих синтез растворимого гемолизина. Клетки осаждали центрифугированием при 10000 об/мин, надосадочную жидкость обеззараживали мертиола-том натрия (1:10000) и фильтровали через мембранные фильтры (0,22 мкм). Препараты токсина-сырца получали двумя способами: 1-й - белки осаждали сульфатом аммония (80 % насыщения) [12], а затем адсорбировали из растворенного и диализованного осадка на карбоксиметилцеллюлозе (СМ-52) Whatman и элюировали с нее 0,2 М фосфатным буфером (pH 7,0), элюат диализовали и лиофилизировали; 2-й - в культуральные супернатанты вносили взвесь ДЕАЕ-52 (Whatman) в 10 мМ трис-HCl буфере (pH 7,1), перемешивали в течение 2 ч при 4 °С, затем ДЕАЕ-52 отделяли фильтрованием через бумажный фильтр в воронке Бюхнера, промывали 10 мМ трис-HCl буфером и проводили ступенчатую элюцию растворами хлористого натрия (в том же буфере) возрастающей концентрации (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 М), элюаты диализовали и концентрировали под вакуумом при 4 °С.
В дальнейшем фракцию белков, элюированную с ДЕАЕ-52 0,2 М NaCl, подвергали гель-фильтрации на колонке LKB 1,54x90 см, ¡заполненной Toyopearl HW55F. Колонку промывали 0,3 М NaCl (pH 7,3) со скоростью 1,2 мл/мин и собирали фракции, соответствующие пикам, регистрируемым с помощью UVcord SII2238 при 280 нм. Фракции диализовали и концентрировали под вакуумом.
Содержание белка определяли по Лоури, электрофоретическое разделение белков в ПААТ проводили, как описано в [4], белки визуализировали окрашиванием Coomassi R250 (Serva) [4], либо нитратом серебра с использованием набора реактивов «Silver Stain Kit 161-0443» (BioRad) согласно рекомендациям изготовителя.
С целью получения сывороток кроликов иммунизировали лиофилизированными препаратами токсина-сырца по схеме [11]. Сыворотки истощали препаратом белков, выделенным тем же способом из авирулентного штамма V. cholerae eltor Р-9337.
Биологическую активность препаратов исследовали на моделях животных (кроликов-сосунков, белых мышей; в тесте повышения кожной проницаемости Крейга) с помощью общепринятых методов, модифицированных И.Д.Бардых [1] и на моно-слойных клеточных культурах линий СНО-К1, Vero, Hela и НЕр-2 [5].
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследований из культуральной жидкости штамма Р-14863 нами получены препараты токсина-сырца с помощью осаждения сульфатом аммония и последующей бач-адсорбции на СМ-52. Препараты характеризовались термолабильностью, вызывали развитие феномена повышения кожной проницаемости в пробе Крейга (удельная активность 1,2-10“9 г белка), отек лапок белых мышей (5,7-10-6 г белка). Их активность не нейтрализовалась сыворотками к очищенному СТ. Однако при использовании для нейтрализации сывороток к препаратам СТ-сырца, выделенного из холерогенных штаммов, титры ФКП в пробе Крейга снижались на 1-2 порядка (удельная активность 10-7-10-8 г белка), очевидно, за счет присутствия в этих сыворотках нейтрализующих антител к содержащемуся в неочищенных препаратах дополнительному токсину, синтезируемому одновременно с СТ.
При интраинтестинальном введении кроликам-сосункам препараты способствовали развитию эн-теропатогенного эффекта со скоплением в кишечнике спущенных эпителиоцитов. Кроме того, они вызывали накопление жидкости в кишечнике взрослых белых мышей при введении сублетальных доз препарата (2,4—5,1 • 10-6 г) не только внутрикишечно, но и внутрибрюшинно и внутривенно, причем наибольшая выраженность диарейного синдрома отмечена при парентеральном введении.
Препараты образовывали линии преципитации в реакции Оухтерлони с сыворотками к препарату-сырцу СТ, но не с сывороткой к очищенному холе-рогену. Сыворотки к препарату из штамма Р-14863, истощенные полученным в тех же условиях препаратом из штамма Р-9337, положительно реагировали с концентрированными культуральными супернатантами как вирулентных, но нехолерогенных (5 штаммов), так и холерогенных (3 штамма) вибрионов.
При тестировании данного препарата в культурах клеток линий CHO-KI, Vero, HeLa и НЕр2 под действием разведений с содержанием белка >3,5 мкг/мл происходило округление живых клеток, аналогичное вызываемому протеолитическими ферментами [5], а также токсинами NMDCY [10] и RTX [7]. Присутствие в препаратах протеаз выявлялось и луночным методом на молочном агаре (>3,9 мкг белка/мл). Однако в дальнейших разведениях (до 0,85 мкг/мл) имело место удлинение клеток, сходное с таковым под действием СТ, но не идентичное ему: удлинение было не столь выраженным, а количество таких измененных клеток - значительно меньшим (15-25 %), чем при достоверной реакции на СТ (40-75 %) (рис.1).
А Б
Рис. 1. Действие препарата нового токсина-сырца на культуру клеток СНО (х240):
А - интактные клетки; Б - удлинение клеток под действием холерного токсина; В - округление клеток под действием низких разведений препарата; Г - удлинение клеток под действием высоких разведений препарата
В результате адсорбции секретируемых белков на ДЕАЕ-52 и последующей элюции ступенчатым градиентом хлористого натрия из культуральной жидкости штамма Р-14863 получено 6 фракций, соответствующих концентрациям №С1 от 0,1 до 0,6 М. Наибольший интерес представляла фракция с концентрацией 0,2 М, поскольку только она давала положительный результат в реакции Крейга и вызывала удлинение клеток СНО, идентичное описанному выше и принятому нами за показатель присутствия нового токсина в разведениях с содержанием белка >120 мкг/мл (рис. 1 Г), тогда как такая же фракция, параллельно полученная из штамма Р-9337, не обладала биологической активностью. Вместе с тем эта фракция отличалась высоким содержанием протеаз и балластных белков, выявляемых электрофоретически, что затрудняло анализ свойств и биологического действия искомого токсина. Поэтому мы предприняли дальнейшее фракционирование 0,2 М элюата с помощью гель-фильтрации на Тоуореаг1 Н\¥55Р. На рис. 2 представлен профиль разделения белков, зарегистрированный с помощью 1Л/согс1 8112238 при 280 нм. Как видно из рисунка, аналогичный профиль был получен для штамма Р-9337, но пик 1 был менее выраженным. После диализа фракции, соответствующие четырем пикам, концентрировали и подвергали дальнейшим исследованиям.
Характерное для действия нового токсина удлинение 15-25 % клеток СНО наблюдалось только под действием фракции 0,2 М/1, соответствующей первому пику гель-фильтрации (только для штамма Р-14863, но не для Р-9337; содержание белка составляло соответственно 26 и 12 мкг/мл). Эта фракция характеризовалась отсутствием протеолитиче-ской активности и положительно реагировала с истощенными сыворотками к токсину-сырцу, но в связи с крайне низкой концентрацией белков они не выявлялись в электрофорезе при окраске СоошавБ!
Рис. 2. Профили разделения белков на Toyopearl HW55F: слева - для штамма Р-14863, справа - Р-9337
R250. Однако более чувствительный метод окраски гелей нитратом серебра позволил выявить в ней 2 мажорные линии с ММ 49 и 54 кДа, отсутствующих в препарате из штамма Р-9337.
Полученные данные позволяют с определенной долей вероятности предположить, что один из дополнительных токсинов холерных вибрионов представляет собой белок, либо диссоциирующий на 2 субъединицы, либо пока не очищенный до состояния единственной полосы.
Как отмечено выше, основные свойства полученных нами препаратов токсина-сырца совпадают с таковыми NCT (new cholera toxin), описанного Sanyal et al. [11-13]. Механизм действия этого токсина неизвестен. Известно лишь, что он не связан с активацией аденилатциклазной системы, поскольку токсин не связывается с GM| [13]. Он не имеет генетического и иммунологического родства с СТ, термолабильным токсином Е. coli (LT) и Шига-подобным токсином, термолабилен, способен индуцировать в организме кроликов образование нейтрализующих антител и, по-видимому, экспрессируется как ctx~-, так и с1х+-штаммами вибрионов [11, 12]. До настоящего времени ничего не известно о генетических детерминантах NCT и их распространении среди штаммов холерных вибрионов. Поскольку исследованные нами штаммы выделены от больных с клиническими признаками типичной холеры и вызывали выраженный эффект на моделях чувствительных животных, а оптимальные условия продукции ими нового токсина совпадали с таковыми СТ [3], наиболее вероятным мы сочли предположение о том, что синтезируемый ими токсин идентичен NCT. Вместе с тем использование нами названия, предложенного вышеупомянутыми авторами, остается условным, поскольку ни в одной из опубликованных ими работ не приводится никаких
данных о физико-химических свойствах очищенного токсина. Все работы выполнены с использованием препаратов-сырцов, полученных______осаждением
белков из культуральной жидкости сульфатом аммония, а свойства определены исключительно иммунологическими методами и на модели взрослых кроликов. К сожалению, эти исследования не нашли своего продолжения в работе начавших их авторов. В публикациях же других исследователей, посвященных изучению дополнительных токсинов холерных вибрионов, полностью отсутствуют упоминания о NCT и группе Sanyal et al. Поэтому полная идентичность выявленного нами токсина и NCT вызывала некоторые сомнения, и мы провели сравнительный анализ его свойств с таковыми других известных на сегодняшний день дополнительных токсинов холерных вибрионов, не имеющих генетического и иммунологического родства с СТ, LT Е. coli, гемолизином эльтор и Шига-подобными токсинами. Основные данные представлены в таблице.
Так, другая группа индийских ученых [9, 10] выявила у ctx'zorace"sto~hlyA+-KnHHH4ecKHx штаммов Vibrio cholerae не 01, а затем и 01 группы сек-ретируемый термолабильный токсин, обозначенный NMDCY (non-membrane-damaging cytotoxin), обладающий одновременно энтеротоксической и цито-токсической активностями и вызывающий повышение проводимости кишечной ткани в камерах Юс-синга. На одном из первых этапов наших исследований мы не исключали присутствия NMDCY в частично очищенных препаратах NCT из-за сходства с ним по ММ одной из полос, выявляемых электрофорезом в ПААТ. Однако более тщательная очистка и проведение электрофореза с SDS не подтвердили этих подозрений.
Наконец, третья группа индийских исследователей [15] описала еще один новый токсин, обозначенный как novel toxin, или токсин W07 (по названию клинического штамма холерного вибриона эльтор, из которого он был получен). Очищенный токсин связывался с GM| и вызывал агглютинацию свежевыделенных эритроцитов кролика. Наши препараты не содержали фракций, идентичных ему по ММ и не обладали способностью агглютинировать эритроциты кролика, поэтому, несмотря на сходное действие на клетки СНО, присутствие в них токсина W07 маловероятно, тем более что на сегодняшний день он обнаружен только у одного штамма, и распространение его среди представителей V. cholerae неизвестно.
С вирулентностью холерных вибрионов связывают еще один недавно обнаруженный комплекс факторов, кодируемый кластером генов RTX [6,7], тесно связанный с CTX-элементом (профагом), и включающий 4 сцепленных гена rtxA, rtxC, rtxB, rtxD, из которых ген А кодирует собственно токсин, а С - его активатор. На нескольких моделях показано, что высокомолекулярный белок RtxA обладает выраженной цитотоксичностью за счет необычного механизма реорганизации клеточного актина [7]. Учитывая высокую активность низких разведений изученных нами препаратов NCT-сырца в плане округления клеток различных культур (что могло быть следствием действия не только одних протеаз), мы не исключаем содержания в этих препаратах токсина RtxA, хотя и не располагаем данными о
Свойства дополнительных токсинов холерных вибрионов
Наименование токсина Получен ли в чистом виде Мол. масса, кДа Термола- бильность Накопление жидкости в кишечнике кроликов Цитотоксичность Проба Крейга Другие особенности Ссылка
NCT (new cholera toxin) - ND + + Не удлиняет СНО + Устойчив к протеазам, не связывается с ОМ 1 [11-13]
NMDCY (non-membrane damaging cholera cytotoxin) + 35-37 + + (в высоких дозах) Округление СНО, HeLa ND [9, Ю]
W07 (novel toxin) + Две с/ед: 58 и 40 + + Округление Vero, удлинение СНО ND Агглютинирует эритроциты кролика, связывается с ОМ1 [15]
RtxA (repeats-in-toxin) - 484 ND N0 Округление НЕр2 ND Связан с клеткой, частично секретируется [6,7]
Cef (CHO cell elongating factor) + .85 + N0, + на модели запечатанных мышей Удлинение СНО ND р1 3,8. Не повышает уровня цАМФ в клетках СНО [8]
S-CEP (secreted CHO cell elongating protein) + 75 + N0, + на модели запечатанных мышей Удлинение СНО ND Устойчив к папаину и термолизину, чувствителен к трипсину и химотрипсину [14]
Новый холерный токсин + 49 и 54 из штамма Р-14863 Примечание. ND - не определяли. + +, а также у мышей Удлинение СНО, Vero, HeLa, НЕр2 + Вызывает накопление жидкости в кишечнике мышей при парентеральном введении Настоящее исследование
присутствии в геноме штамма-продуцента интакт-ных генов RTX-комплекса.
Недавно были описаны еще два новых цитото-нических токсина, вызывающие накопление жидкости в кишечнике запечатанных мышей и удлинение клеток СНО: полученный из клеточных экстрактов вибриона эльтор Cef (СНО cell elongating factor) [8] и выделенный из культуральной жидкости классического вакцинного штамма S-CEP (secreted СНО cell elongating protein) [14]. Поскольку в полученных нами препаратах-сырцах NCT, выделенных разными способами, содержалось множество выявляемых электрофоретически белков, мы не можем исключить. способности исследуемых нехолерогенных штаммов к синтезу одного из этих токсинов (вероятнее, Cef, обнаруженного у вибриона эльтор), тем более, что эти препараты вызывали удлинение клеток культур в очень высоких разведениях. Вполне возможно, что такая активность могла быть результатом сочетанного действия двух или более токсинов.
Таким образом, нами установлена способность некоторых нехолерогенных штаммов к продукции токсина, близкого или идентичного NCT, описанному в работах Sanyal et al., хотя не исключено, что это совсем другой, еще не описанный токсин. Возможно, что изученные нами штаммы экспрессируют не один этот фактор, а также цитотоксический Rtx и/или цитотонический Cef, совместное действие которых приводило к тем серьезным физиологическим расстройствам, которые наблюдались на моделях чувствительных лабораторных животных, а также обусловило тяжесть течения холероподобных заболеваний, диагностированных у инфицированных этими возбудителями пациентов. Для более точного определения набора факторов вирулентности каждого конкретного этиологически опасного клона холерных вибрионов необходимы дальнейшие исследования, включающие выявление генетических детерминант дополнительных токсинов и способности штаммов к их экспрессии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бардых И. Д. Экспериментальные модели в патогенезе холеры: Автореф. дис... канд. мед. наук. - Саратов, 1993. -2.Власов В.П., Харланова Н.Г., Монахова Е В. и др. // Докл. АН. - 1997. - № 1. - С. 278-280. - 3. Мазрухо А.Б., Михась Н.К., Монахова Е.В., Рожков К.К. // ЖМЭИ. - 2000. - № 1. - С. 21-24. - 4. Маурер Г. Диск-электрофорез. - М.: Мир, 1971. - 5. Сальникова О.И., Лобанов В.В., Шиманюк Н.Я. // ЖМЭИ. - 1991. - №6. -С. 94-99. - 6. Fullner K.J., Mekalanos J.J. II The EMBO Journal. - 2000. - Vol: 19, N 20. - P. 5316-5323. - 7. Lin W., Fullner K.J., Clayton R. et al. II Proc. Natl. Acad. Sci USA. -1999. - Vol. 96, N2. - P. 1071-1076. - 8. McCardell B.A., Kothary M.H., Hall R.N., Sathyamoorthy V.//Microb. Pathogen. - 2000. - Vol. 29, N 1. - P. 1-8. - 9. Mitra R., Saha P.K., Basu l.etal. II FEMS Microbiol. Lett. -1998. -Vol. 169, N2.-P. 331-333.- 10. Saha P.K., Koley H., Nair G.B. // Infect. Immun. - 1996. - Vol. 64, N 8. - P. 3101-3108. - 11. Saha S., Sanyal S.C. // FEMS Microbiol. Letters. - 1988. - Vol.50. -P. 113-116. - 12. Saha S., Sanyal S.C.//J. Med. Microbiol.-1990.-Vol. 32, N1,-P. 33-37.- 13. Sanyal S.C., Alam K., Neogi P.K.B. et al. II Lancet. - 1983. - N 8337. - P. 1337. -
14. Sathyamoorthy V., Hall R.H., McCardell B.A. et al. II Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68, N 10. - P. 6062-6065. -
15. Walia K., Ghosh S., Singh H. et al. // Infect. Immun. -1999. - Vol. 67, N 10. - P. 5215-5222.
E.V.Monakhova, N.K.Mikhas’, R.V.Pisanov, O.I.Salnikova, A.B.Mazrukho, L.M.Ovsova, B.L.Mazrukho
Characterization of Additional Diarrhea-Inducing and Cytotoxic Factors, Synthesized by Vibrio cholerae
Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute
Supernatant fluids of a highly virulent Vibrio cholerae eltor strain lacking the CTX element were used to isolate toxin preparations that varied in their purity levels. A thorough analysis of their physical and chemical characteristics and biological activities by comparison with those of additional Vibrio cholerae toxins, described elsewhere, suggested that our newly isolated toxin should be very similar or identical to the novel NCT toxin as shown by Sanyal et al. (1983-1990). On the other hand, it cannot be ruled out that our strain simultaneously produces also a cytotoxic factor RTX [7] and/or a cytotonic factor Cef [8].
Поступила 17.11.03
