CC BY
22© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
О.В.Маркина1, Л.П.Алексеева1, Н.В.Маркин2, Н.Р.Телесманич1
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТОВ РАСТЕНИЙ НА АКТИВНОСТЬ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА VIBRIO CHOLERAE
1Ростовский-на-Дону противочумный институт, 2НИИ биологии Южного Федерального университета, Ростов-на Дону
Цель. Изучение активности экстрактов растений в отношении холерного токсина (ХТ) Vibrio cholerae O1. Материалы и методы. Определяли антитоксическую активность растительных экстрактов, используя иммуноферментный анализ и культуру клеток CHO-K1. Результаты. Было исследовано 8 водных экстрактов растений. Показано, что экстраты ореха, зверобоя, тысячелистника, базилика не влияют на активность ХТ в ИФА и культуре клеток CHO-K1. Экстракты чистотела и ревеня не снижают иммунохимическую активность ХТ, но препятствуют удлинению клеток CHO-K1. Экстракты дуба и хмеля подавляют связывание в ИФА холерного токсина с рецепторами GM1 и незначительно снижают его активность в культуре клеток. Заключение. Антитоксическая активность экстрактов растений в отношении ХТ перспективна для разработки препаратов, обладающих инги-бирующим эффектом.
Журн. микробиол., 2013, № 1, С. 9—13
Ключевые слова: холерный токсин, растительные экстракты, иммуноферментный анализ, культура клеток
O.V.Markina1, L.P.Alekseeva1, N.V.Markin2, N.R.Telesmanich1
INFLUENCE OF PLANT EXTRACTS ON THE ACTIVITY OF CHOLERA TOXIN OF VIBRIO CHOLERAE
1Rostov-on-Don Research Institute of Plague Control, 2Research Institute of Biology of Southern Federal University, Rostov-on-Don, Russia
Aim. Study the activity of plant extracts against cholera toxin (CT) of Vibrio cholerae O1. Materials and methods. Antitoxic activity of plant extracts was determined by using enzyme immunoassay and CHO-K1 cell culture. Results. 8 water extracts of plants were studied. Extracts of nut, tutsan, milfoil, basil do not have effect on CT activity in EIA or CHO-K1 cell culture. Celandine and rhubarb extracts do not reduce CT immunochemical activity but prevent elongation of CHO-K1 cells. Oak and hop extracts suppress binding in EIA of cholera toxin and GM1 receptors and insignificantly reduce its activity in cell culture. Conclusion. Antitoxic activity of plant extracts against CT is perspective for the development of preparations possessing inhibition effect.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 1, P. 9—13
Key words: cholera toxin, plant extracts, enzyme immunoassay, cell culture
ВВЕДЕНИЕ
Массовое применение антибиотиков и сульфаниламидных препаратов стало основой значительного прогресса медицины ХХ века. Благодаря этим препаратам были санированы очаги многих опасных инфекций, в том числе и холеры. В то же время, оборотной стороной массового применения антибиотиков стало появление микроорганизмов с комплексной к ним устойчивостью. Так, в послед-
нее время все больше выявляется штаммов Vibrio cholerae, устойчивых к тетрациклину, гентамицину, эритромицину, рифампицину, ампициллину, левомице-тину, стрептомицину [3]. В связи с этим, поиск новых антимикробных веществ остается актуальным и одним из способов решения данной задачи является создание препаратов на основе растительных компонентов. Так, общеизвестно, что сильной бактериоцидной активностью
обладают хвойные, чистотел, цикорий и многие другие. В отношении холерных вибрионов установлено, что хна, сарака, гвоздичник, чеснок, дурман обыкновенный, гуава, базилик, кактус, акация и др. содержат вибриоцидные вещества [4, 9, 10]. Зарубежными авторами также было показано, что растительные полифенолы (RG-танины, катехины, ресвератрол и др.), выделенные из хмеля, ревеня, зеленого чая, зеленого яблока, ингибируют действие главного токсина холерного вибриона — холерогена — путем прямого взаимодействия с его А- и/или B-субъ-единицами [6, 7]. В связи с этим, некоторые вещества, выделенные из растений, в частности, высокополимеризованные катехины, рекомендуются для лечения и профилактики холеры [8]. Другие биологически активные соединения растений могут регулировать экспрессию генов токсина на молекулярном уровне, в частности, алкалоид капсаицин, выделенный из красного перца чили (Capsicum annuum), снижает экспрессию генов ctxA, tcpA and toxT, одновременно увеличивая экспрессию hns гена [12]. В отечественной литературе работ в этом направлении мы не встретили, в связи с этим, целью исследования явилось изучение влияния экстрактов растений на активность холерного токсина с помощью методов ИФА и культуры клеток СНО-К1.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали препарат холерного токсина (ХТ) V.cholerae cholerae 569B (Ростовский НИПЧИ). Водные экстракты (Эк) растений готовили из высушенных листьев дуба черешчатого (Quercus robur), грецкого ореха ^¿glans regia), а также цветков и листьев зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum), тысячелистника (Achillea millefolium), чистотела (Chelidonium majus), базилика (Ocimum basilicum), корня ревеня (Rhei rhizoma), а также шишек хмеля (Htoulus lupulus).
Для этого к 1 г высушенных растений добавляли 5 мл дистиллированной воды и экстрагировали в течение 18 часов при 4°C [9]. Иммунохимическую активность
холерного токсина определяли в GM1-иммуноферментном анализе [11] и GM1-дот ИФА [2]. ХТ, связавшийся с ганглио-зидами GM1, выявляли с помощью кроличьей антитоксической сыворотки, полученной к ХТ (Calbio^em, США), в рабочем разведении 1:5000. Определение биологической активности холерогена проводили в культуре клеток СНО-К1 (Ин-т цитологии, С.-Петербург). Для этого в лунки с клетками СНО-К1 (10 тыс./лунка или 30 тыс./лунка) вносили: 1) препарат холерного токсина; 2) токсин, инкубированный с экстрактами в течение 30 минут при 37°C (соотношение 1:3); 3) отдельно экстракты. Панель оставляли в течение ночи в СО2-инкубаторе (Sanyo, Япония). Учет результатов проводили путем сравнения морфологии опытных и контрольных клеток СНО-К1 с помощью инвертированного микроскопа. За цито-тоническую дозу принимали минимальное количество токсина, вызывающего удлинение не менее 50% клеток популяции. Фотографирование клеток, не окрашенных и окрашенных 1% раствором генцианвиолета, проводили с помощью инвертированного микроскопа и цифрового фотоаппарата. Для этого клетки промывали раствором ФСБ, затем влажный монослой фотографировали через прозрачное дно панели с увеличением Об х Ок=20х15, 40х15 и 60х15.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Заметным ингибирующим эффектом на связывание холерогена с рецепторами GM1 обладал экстракт из листьев дуба. Так, при испытании в GM1-иммуно-ферментном анализе установлено, что Эк из листьев дуба приводит к снижению способности ХТ (1 мкг/мл) связываться с ганглиозидами GM1 в 2 раза (ОПср. контроля/ОПср. опытной пробы = 1,666/ 0,764). Когда в приготовлении экстракта использовали дубовые галлы, то при тех же условиях постановки ИФА оптическая плотность реакции ХТ с рецепторами снижалась до 0,261. Экстракты хмеля и зверобоя также снижали активность ХТ, однако эта реакция была не столь явно выражена. Для исключения возможности самостоятельного связывания Эк с
Результаты активности ХТ и экстрактов растений в GM1-ИФА.
1 — ревень, 2 — дуб, 3 — дуб+галлы, 4 — орех, 5 — чистотел, 6 — зверобой, 7 — хмель, 8 — тысячелистник, 9 — базилик, 10 — вода (пол. контроль). Черный столбик — Эк, штриховка — Эк + ХТ, белый — Эк отмытый + ХТ
ганглозидами GM1 и тем самым экранирования рецепторов, нами был проведен следующий эксперимент: экстракты были предварительно нанесены на ганглиозиды GM1, через 30 минут отмыты, после чего добавлен препарат ХТ, далее реакцию проводили по стандартной схеме ИФА. В результате установлено, что Эк не препятствуют взаимодействию ганглиозидов GM1 с ХТ, т.е. самостоятельно с ними не связываются. Внесение Эк после того, как токсин связался с рецептором GM1, также не повлияло на результаты ИФА, свидетельствуя о том, что активные компоненты Эк не «отрывают» ХТ от рецептора и не маскируют его на последующем этапе
Морфологические изменения клеток СНО-К1 под действием растительных экстрактов совместно с ХТ и без ХТ
взаимодействия с сывороточными антителами.
Параллельно эксперимент был проведен в GM1-дот ИФА. Как видно на рис., кроме Эк дуба экстракты зверобоя и хмеля незначительно снижали эффективность взаимодействия токсина с ган-глиозидами. Самостоятельно Эк этих растений не связывались с ганглиозида-ми, нанесенными на нитроцеллюлозную мембрану, то есть не «экранировали» рецепторы GM1 от ХТ. Экстракты других растений не оказывали влияния на активность ХТ в обоих вариантах ИФА.
Результаты иммуноферментного анализа могут свидетельствовать об эффективности взаимодействия рецептора GM1 с В-субъединицей ХТ, однако не позволяют оценить биологическую активность токсина, которая зависит от его А-субъ-единицы, поэтому активность ХТ, проинкубированного с Эк, была определена в культуре живых клеток СНО-К1. Сначала экстракты самостоятельно были внесены в лунки панели с предварительно внесенными клетками СНО-К1 (10 тыс./лунка). Как следует из результатов, представленных в табл., некоторые растительные Эк оказались токсичными для клеток, в частности, Эк клена вызывал гибель клеток в титре до 1:200.
Наименее токсичными оказались Эк чистотела, тысячелистника, хмеля, базилика и ревеня, а Эк из листьев дуба, зверобоя, хмеля, базилика в низких разведениях вызывали округление клеток (табл.). При этом, если клеточный монослой был
Экстракт
Разведение препаратов, вызывающих морфологические изменения клеток
Эк совместно с ХТ
Эк самостоятельно
Округление Удлинение
Округление Удлинение
Клен 1:200 — 1:640 1:200 — —
Орех 1:24 — 1:640 1:24 — —
Дуб 1:24 1:6 1:320 1:24 1:6 —
Чистотел 1:12 — 1:160-640 1:12 — —
Тысячелистник 1:6 — 1:640 1:6 — —
Зверобой 1:24 1:48 1:640 1:24 — —
Хмель 1:6 1:12 1:320 — 1:12 —
Базилик 1:6 1:12 1:640 1:6 1:12 —
Ревень 1:6 — 1:20 1:6 — —
Вода 1:6 — 1:640 — — —
Примечание. — Изменений нет.
сливной, то отмечали его отхождение от подложки и «сворачивание». На следующем этапе был протестирован ХТ, инкубированный с Эк. В качестве положительного контроля служил препарат ХТ, к которому вместо экстрактов была добавлена вода, используемая для экстракции.
Согласно полученным данным, незначительно активность ХТ (с 1/640 до 1/320) снижали экстракты хмеля и дуба. Экстракты чистотела и ревеня практически полностью блокировали действие холерогена в культуре клеток. Однако дальнейшее исследование показало, что этот эффект вызван различными причинами. Так, при изучении ХТ, инкубированного с Эк чистотела, в разведениях 1:6 — 1:80 удлинения клеток не наблюдали, но при дальнейшем разведении от 1:160 до 1:640 в лунках появлялись клетки СНО-К1 с игольчатым концами, что является индикаторной реакцией клеток на холероген. Следовательно, при уменьшении концентрации Эк чистотела в ходе титрования холерный токсин даже в низких дозах (до 1/640) проявлял свой цито-тонический эффект. Окрашивание клеток 1% раствором генцианвиолета позволило установить, что Эк чистотела приводит к появлению многоядерных клеток СНО-К1 с крупной цитоплазмой и неровными краями, что указывает на нарушение деления клеток и изменение их цитоскелета. В то же время, Эк ревеня ингибировал действие самого холерного токсина, при этом самостоятельно никаких морфологических изменений клеток практически не вызывал.
ОБСУЖДЕНИЕ
В зарубежных работах последних лет большое внимание уделяется изучению антимикробного действия различных растительных компонентов. Список растений, обладающих вибриоцидной или антитоксической активностью, постоянно пополняется, и становится очевидным, что растения, являющиеся источником биологически активных соединений, могут стать эффективным средством для профилактики многих инфекционных заболеваний. В отечественной
литературе сведения по данной проблеме немногочисленны, а в отношении холерных вибрионов и вовсе отсутствуют. В настоящем исследовании было изучено влияние экстрактов растений на активность холерогена УсИо1егае О1 с помощью ИФА и культуры клеток СНО-К1. Установлено, что Эк из листьев дуба, хмеля и зверобоя частично снижают способность ХТ связываться с рецептором GM1, и при этом, Эк хмеля и дуба незначительно ингибировали холероген в культуре клеток СНО-К1. Видимо, даже после инкубации с Эк часть токсина остается несвязанной и вызывает специфическое удлинение клеток СНО-К1. Ингиби-рующий эффект данных экстрактов связываем с наличием в них полифенолов, в частности, танинов, которые, как известно, могут образовывать с белками высокомолекулярные агрегаты, тем самым препятствуя взаимодействию холерного токсина с рецепторами. Практически полностью блокировали действие высоких концентраций холерогена в культуре клеток СНО-К1 экстракты чистотела и ревеня. Однако полученные результаты позволяют предположить различные механизмы этого явления. Так, Эк чистотела обладает антимитотическим действием, что обусловлено наличием в его листьях и цветках алкалоида хелидонина, а он и близкие к нему по функции гомо-хелидонин и метоксихелидонин задерживают деление клеток подобно колхицину [1]. В работе [5] показано, что колхицин лишает клетку способности удлиняться под действием цАМФ путем взаимодействия с микротрубочками цитоскелета. Учитывая сходство биологического эффекта Эк чистотела, содержащего хели-донин, и колхицина можем предположить, что Эк чистотела блокирует удлинение клеток СНО-К1 под действием холерогена за счет ингибирования полимеризации тубулина микротрубочек цитоскелета. Снижение концентрации хелидонина при разведении Эк чистотела ведет к восстановлению способности клеток СНО-К1 к изменению морфологии. Эк ревеня в 30 раз снизил биологическую активность ХТ, при этом самостоятельно не вызывал никаких морфо-
логических изменений в клетке. С помощью ИФА показано, что биологически активные вещества из экстракта ревеня не связываются с В-субъединицами токсина, так как показатели ОПср реакции были на уровне положительного контроля (ХТ самостоятельно), свидетельствуя о том, что рецепторная активность холерогена не изменилась. Однако Эк блокировал биологическую активность холеро-гена в культуре клеток СНО-К1, видимо, влияя на ADP-рибозилтрансферазную активность А-субъединицы ХТ за счет содержания в экстракте RG-танинов.
Таким образом, результаты проведенной работы свидетельствуют, что экстракты ореха, зверобоя, тысячелистника, базилика практически не вляют на активность ХТ в ИФА и культуре клеток СНО-К1. Экстракты чистотела и ревеня не снижают иммунохимиче-скую активность холерогена, но в то же время, препятствуют удлинению клеток СНО-К1. При этом, Эк чистотела лишает клетку способности к различным морфологическим изменениям, а Эк ревеня нейтрализует сам холероген на уровне блокирования его А-субъеди-ницы. Экстракты дуба и хмеля подавляют связывание ХТ с рецепторами в ИФА и незначительно снижают активность токсина в культуре клеток СНО-К1, видимо, за счет присутствия в них полифенолов, образующих высокомолекулярные комплексы с холерогеном. Полученные результаты показывают необходимость дальнейшего изучения экстрактов растений, поскольку применение натуральных растительных компонентов перспективно для разработки препаратов, обладающих профилактическим эффектом.
ЛИТЕРАТУРА
1. Зузук Б. М., Куцик Р. В., Федяк И. О. Чистотел большой Chelidonium majus. Провизор. 2006, 9: (http://www.provisor. com.ua/archive/2006/N9/art_15.php).
2. Маркина О.В., Алексеева Л.П., Телесма-нич Н.Р. и др. ОМ1-ИФА для выявления токсинпродуцирующих штаммов Vibrio
cholerae. Клин. лаб. диагностика. 2011, 5: 49-52.
3. Рыжко И.В., Дудина Н.А., Ломов Ю.М. и др. Антибактериальная активность 22 препаратов в отношении штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогруппы, выделенных от людей в период с 1927 по 2005 гг. Антибиотики и химиотерапия. 2005, 8: 38-42.
4. Birdi T., Daswani P., S Brijesh et al. Newer-tinesights into the mechanism of action of Psidium guajava leaves in infectious diarrhea. BMC Complement. Altern. Med. 2010, 10: 33. (http://www.biomedcentral.com/1472-6882/10/33).
5. DiPasquale A.M., McGuire J,, Moellman G., Wasserman S.J. Microtubule assembly in cultivated green melanoma cells is stimulated by dibutiryl adenosine 3':5'-cyclic monophosphate or cholera toxin. J. Cell. Biology. 1976, 71: 735-748.
6. Morinaga N., Iwamaru Y., Yihiro K. et al. Differential activities of plant polyphenols on the binding and internalization of cholera toxin in vero cells. J. Biol. Chem. 2005, 280 (24): 23303-23309.
7. Morinaga N., Yahiro K., Noda M. Toxicon. Resveratrol, a natural polyphenolic compound, inhibits cholera toxin-induced cyclic AMP accumulation in Vero cells. Toxicol. 2010, 56 (1): 29-35.
8. Saito T., Miyake M., Toba M. et al. Inhibition by apple polyphenols of ADP-ribosyltrans-ferase activity of cholera toxin and toxin-induced fluid accumulation in mice. Microbiol. Immunol. 2002, 46 (4): 249-255.
9. Sa'nchez E., Garcia S., Heredia N. Extracts ofedible and medicinal plants damage membranes of Vibrio cholerae. Appl. Envir. Microbiol. 2010, 76 (20): 6888-6894.
10. Sharma A., Kumar V. P., Navin A.C. Vibriocidal activity of certain medicinal plants used in Indian folklore medicine by tribals ofMahakoshal region ofcentral India. Indian J. Pharmacol. 2009, 41 (3): 129133.
11. Svennerholm A.M., Wikstrom M., Lindblad M. et al. Monoclonal antibodies against Escherichia coli heat-stable toxin (STa) and their use in a diagnostic ST ganglioside GM1-enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 1986, 24 (4): 585-590.
12. Yamasaki S., Asakura M., Basu S. N. et al. Inhibition of virulence potential of Vibrio cholerae by natural compounds. Indian. J. Med. Res. 2011, 133 (2): 232-239.
Поступила 13.03.12
Контактная информация: Телесманич Наталья Робертовна, д.б.н., 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40, р.т. (863)240-35-94
