Научная статья на тему 'Вариабельность токсинопродукции холерных вибрионов под влиянием стрессорных эндогенных факторов желудочно-кишечного тракта человека'

Вариабельность токсинопродукции холерных вибрионов под влиянием стрессорных эндогенных факторов желудочно-кишечного тракта человека Текст научной статьи по специальности «Медицина и здравоохранение»

CC BY-ND
15
5
Поделиться
Ключевые слова
ХОЛЕРНЫЕ ВИБРИОНЫ / VIBRIO CHOLERAE / ТОКСИНОПРОДУКЦИЯ / СТРЕСС / STRESS / ХОЛЕРОГЕН / TOKSINOPRODUKTSIYA / TOXIN GENES

Аннотация научной статьи по медицине и здравоохранению, автор научной работы — Сизова Ю.В., Бурлакова О.С., Черепахина И.Я., Евдокимова В.В., Алексеева Л.П.

Изучено влияние ряда эндогенных факторов желудочно-кишечного тракта человека на токсинопродукцию возбудителя холеры. При анализе влияния различных монострессоров, имитирующих условия существования холерных вибрионов в макроорганизме (кислота в желудке, повышенный рН в тонком кишечнике, желчь, условия гипоксии), на продукцию холерогена было отмечено резкое повышение его продукции, что свидетельствует об активации в условиях макроорганизма экспрессии генов ctxAB, кодирующих основной фактор вирулентности холерный токсин.

Похожие темы научных работ по медицине и здравоохранению , автор научной работы — Сизова Ю.В., Бурлакова О.С., Черепахина И.Я., Евдокимова В.В., Алексеева Л.П.,

Variability toksinoproduktsii vibrio cholerae due stress endogenous factors gastrointestinal human

The aim of the present work was to study the influence of a number of endogenous factors of the gastrointestinal tract of humans on toksinoproduktsiyu cholera. In analyzing the impact of various monostressorov simulating the conditions of existence of V. cholerae in macroorganism (acid in the stomach, elevated pH in the small intestine, bile, hypoxia), product choleragen there was a sharp increase in its production, which indicates that activation in a microorganism gene expression ctxAV encoding the main virulence factor cholera toxin.

Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

Текст научной работы на тему «Вариабельность токсинопродукции холерных вибрионов под влиянием стрессорных эндогенных факторов желудочно-кишечного тракта человека»

СЕНТЯБРЬ №9 (270) ЗНифО

51

г-Ь

УДК 616.932

ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ТОКСИНОПРОДУКЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ СТРЕССОРНЫХ ЭНДОГЕННЫХ ФАКТОРОВ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО

ТРАКТА ЧЕЛОВЕКА

Ю.В. Сизова, О.С. Бурлакова, И.Я. Черепахина, В.В. Евдокимова, Л.П. Алексеева

ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону, Россия

Изучено влияние ряда эндогенных факторов желудочно-кишечного тракта человека на токсинопродукцию возбудителя холеры. При анализе влияния различных монострессоров, имитирующих условия существования холерных вибрионов в макроорганизме (кислота в желудке, повышенный рН в тонком кишечнике, желчь, условия гипоксии), на продукцию холерогена было отмечено резкое повышение его продукции, что свидетельствует об активации в условиях макроорганизма экспрессии генов ctxAB, кодирующих основной фактор вирулентности — холерный токсин. Ключевые слова: холерные вибрионы; токсинопродукция; стресс; холероген.

Y.V. Sizova, O.S. Burlakova, I.J. Cherepahina, V.V. Evdokimova, L.P. Alekseeva □ VARIABILITY TOKSINOPRODUKTSII VIBRIO CHOLERAE DUE STRESS ENDOGENOUS FACTORS GASTROINTESTINAL HUMAN □ The Federal Government Health Institution «Rostov-on-Don Plague Control Researsh Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare, Rostov-on-Don, Russia

The aim of the present work was to study the influence of a number of endogenous factors of the gastrointestinal tract of humans on toksinoproduktsiyu cholera. In analyzing the impact of various monostressorov simulating the conditions of existence of V. cholerae in macroorganism (acid in the stomach, elevatedpH in the small intestine, bile, hypoxia), product choleragen there was a sharp increase in its production, which indicates that activation in a microorganism gene expression ctxAV encoding the main virulence factor — cholera toxin. Key words: Vibrio cholerae; toksinoproduktsiya; stress; toxin genes.

Характерной особенностью экологии холерного вибриона является возможность смены экологической ниши его обитания в процессе жизнедеятельности (пребывание в инфицированном макроорганизме чередуется с существованием в природных экосистемах), в результате которой он подвергается воздействию различных стрессовых факторов. В организме человека это действие кислой среды желудочного сока, желчи, гипоксии. Различными авторами показано влияние жирных кислот и холестерина, присутствующих в желчи, на выживаемость, экспрессию факторов вирулентности и подвижность холерных вибрионов [3, 4]. При попадании из организма человека в водную экосистему холерные вибрионы испытывают воздействие низких температур, осмомолярности среды, сложности в питании.

Главным фактором вирулентности холерных вибрионов является термолабильный энтеротоксин — холероген, синтезируе-

мый эпидемически значимыми штаммами V. ско1вгав, который и определяет симптоматику холеры. В настоящее время для определения токсигенности вибрионов используют разные методы: молекулярно-генетические, биологические, цитологические и серологические. Однако использование ПЦР позволяет обнаружить у исследуемых штаммов генетическую детерминанту вирулентности — ген холерного токсина (^хАВ), что свидетельствует только о потенциальной возможности продукции холе-рогена штаммами холерного вибриона, но не саму продукцию токсина. По литературным данным, различные сигналы внешней среды могут модифицировать экспрессию генов, ответственных за патогенность и персистенцию холерных вибрионов [1, 2]. Однако изменение токсинопродукции холерных вибрионов под влиянием эндогенных факторов желудочно-кишечного тракта человека изучено мало.

52

ЗНиСО СЕНТЯБРЬ №9 (270)

Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

В связи с этим, целью нашей работы было изучение влияния различных отдельных стрессовых факторов, присутствующих в желудочно-кишечном тракте человека, и их комбинированное воздействие на уровень токсинопродукции холерных вибрионов.

Материалы и методы. В работе было использовано 13 штаммов V. cholerae О1 серогруппы биовара эльтор и 2 штамма классического биовара, содержащих ген с1хЛВ.

В эксперименте, имитирующем условия организма человека, использовали желчь крупного рогатого скота в концентрации 50 мг/мл, рН 4,0 и 9,0 (имитирующие условия кислой и щелочной сред желудка и кишечника человека), микроаэрофильные условия — 10—12 % О2 и 5—6 % СО2 (соответствующая условиям в тонком кишечнике человека), а также сочетания этих факторов. Создание данных условий проводили в соответствии с разработанными нами и утвержденными Ученым советом ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора Методическими рекомендациями «Методики создания условий стресса для холерных вибрионов при изучении персистентного потенциала возбудителя холеры». Для создания кислотного стресса 1 мл взвеси исследуемых культур, содержащих 1х109 м-кл/мл добавляли в 9 мл раствора ацидинпепсина в кипяченой водопроводной воде рН 4,0, который действует более щадяще, чем используемая обычно для этих целей соляная кислота и инкубировали в течение часа при 37 °С. Для создания щелочного стресса 1 мл 1 млрд взвеси исследуемых культур добавляли в 9 мл раствора кипяченой водопроводной воды рН 9,0 (значения рН получали подщелачиванием 10 % раствором NaOH). Влияние желчи, как монострессора, изучали, инкубируя 1 мл взвеси исследуемых культур, содержащих 1х109 м-кл/мл в бульоне Мартена и добавлением желчи КРС в концентрации 50 мг/мл в течение 5 часов при 37 °С. Комбинированный стресс создавали последовательным культивированием культур холерных вибрионов в кислой среде 1час (время нахождения в кислотной среде желудка), затем переносили 1 мл культуры в пробирки с 9 мл бульоном Мартена с добавлением желчи в концентрации 50 мг/мл и рН 9,0, которые инкубировали при 370С в эксикаторе в течение 5 часов (имитация содержимого тонкого отдела кишечника). После этих манипуляций культуры осаждали центрифугированием при 8 000 об./ мин в течение 20 мин и ресуспендировали полученный осадок в 1 мл физиологического раствора и исследовали полученные

взвеси холерных вибрионов на продукцию холерогена. ^

Для определения продукции холерного ^ токсина культуры инкубировали по методике М. Iwanaga [5] на среде AKI в шуттель-аппарате Environmental Shaker-Yncubator ES-20/60 при 120 об./мин в течение 18 часов, с= затем центрифугировали и обеззараживали гентамицином в концентрации 200у на 1 мл супернатанта. Уровень продукции холерного токсина определяли иммуноферментным методом в GMl-ИФА и на культуре клеток СНО.

Токсинопродукцию холерных вибрионов оценивали по титрам в GMl-ИФА: низкий уровень — титр 1/2-1/20, средний уровень — титр 1/40-1/320, высокий уровень — титр 1/640-1/2560. Результаты и обсуждения. Токсинопродукция у холерных вибрионов до воздействия стресса различалась у разных штаммов, но преобладали штаммы с низким уровнем продукции холерогена (табл. 1).

Некоторые авторы считают, что для улучшения секреции холерного токсина штаммами V. cholerae El Tor в отличие от V. cholerae classical необходимо проведение бифазного культивирования (чередование статических условия роста при 37 °С c последующим шуттелированием при 37 °С), при этом большое значение придается объему и площади аэрируемой поверхности флакона [8]. Поэтому представляло интерес сравнить токсинопродукцию холерных вибрионов при культивировании с активным шуттелированием и без него. Было показано, что наиболее высокой активностью при шуттелировании в течение 18 часов при 37 °С обладали два штамма в изучаемой коллекции: V.cholerae classical 569B, V. cholerae El Tor 1310 - титры в ИФА 1:1280. Два штамма обладали средним уровнем токсинопродукции (титр 1/40) — V. cholerae El Tor 17427 и 18588. Остальные штаммы были низко продуцирующими.

При выращивании в термостате без шут-телирования у ряда штаммов было отмечено изменение уровня продукции токсина как в большую, так и в меньшую сторону. Так, у штаммов V. cholerae El Tor 3119, 5879, 19667, 19242, 18588 наблюдалось увеличение значений на 2—4 разведения (до среднего уровня), остальные же штаммы показали более низкие титры вплоть до полного прекращения продукции холерогена. В результате для дальнейших исследований была выбрана методика с активным шуттелированием при 37 °С.

СЕНТЯБРЬ №9 (270) ЗНифО

53

Таблица. Токсинопродукция музейных штаммов холерных вибрионов

№ п/п № штамма Год выделения Источник выделения Условия культивирования Титр в GM1-ИФА Титр в СНО

1 569В 1968 больной, Индия шуттель 1/1280 удлинение до 1/1280

термостат 1/10 удлинение до 1/320

2 1601 1962 больной, Индия шуттель 1/10 удлинение до 1/160

Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

термостат 1/2 удлинение до 1/40

3 1310 1966 больной, Ирак шуттель 1/1280 округление до 1/10, удлинение 1/20-1/1280

термостат 1/80 лизис клеток до 1/1280, единичные — удлинение

4 3119 1970 больной, г. Одесса шуттель 1/2 округление до 1/10, удлинение 1/20-1/160

термостат 1/80 удлинение до 1/1280

5 5879 1972 больной, г . Таганрог шуттель 1/2 удлинение до 1/80

термостат 1/10 лизис клеток до 1/40, удлинение 1/80-1/160

6 19667 2014 больной, г. Москва шуттель 1/20 округление до 1/20, удлинение 1/40-1/640

термостат 1/160 лизис клеток до 1/320, удлинение 1/640-1/1280

7 19242 2012 больной, г. Москва шуттель 1/10 удлинение до 1/320

термостат 1/160 лизис клеток до 1/640, удлинение 1/1280

8 19187 2010 больной, г. Москва шуттель 1/10 округление до 1/10, удлинение 1/20-1/320

термостат 1/10 лизис клеток до 1/160, удлинение 1/320

9 19188 2010 больной, г. Москва шуттель 1/2 удлинение до 1/640

термостат 1/2 лизис клеток до 1/160

Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

10 19613 2014 вода, р.Темерник шуттель 1/10 удлинение до 1/40

термостат - лизис клеток до 1/160

11 19241 2011 мор.вода, г. Таганрог шуттель 1/2 удлинение до 1/160

термостат - лизис клеток до 1/320

12 18418 2001 больной, г. Казань шуттель 1/2 удлинение до 1/80

термостат - лизис клеток до 1/160

13 18826 2005 больной, г. Тверь шуттель 1/2 удлинение до 1/80

термостат 1/2 лизис клеток до 1/320

14 17427 1994 носитель, г. Хасвюрт шуттель 1/40 удлинение до 1/320

термостат 1/10 лизис клеток до 1/160

15 18588 2003 вода, р.Темерник шуттель 1/40 округление до 1/160, удлинение 1/320

термостат 1/80 лизис клеток до 1/20, удлинение 1/40-1/1280

На культуре клеток СНО при стандартной методике изучения токсинопродукции (шуттелирование) наблюдалось удлинение клеток. При этом титры в GM1-ИФА были значительно ниже, чем титры при использовании культуры клеток. При выращивании в термостате без шуттелирования наблюдался выраженный лизис клеток у большей части штаммов. Поскольку все взятые в опыт штаммы не обладали гемолитической активностью, можно предположить, что лизис

клеток вызывал (или вызывали) какие-то дополнительные токсины, возможно, ци-тотоксический комплекс RTX.

При изучении влияния различных монострессоров, имитирующих условия существования холерных вибрионов в макроорганизме, на продукцию холерогена было обнаружено изменение титров в ИФА практически у всех штаммов, за исключением высоко-токсигенного штамма V.cholerae classical, который практически не реагировал на стресс

Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

54

ЗНиСО СЕНТЯБРЬ №9 (270)

ц

Титов ИФА: 1-1/2 2-1/10 3-1/20 4-1/40 5-1/80 6-1/160 7-1/320 8-1/640 9-1/1280 Рис. Токсинопродукция вибрионов биовара EI Tor после воздействия стресса

(показатели несколько снижались только при воздействии желчью — до титра 1:160). У низкопродуцирующего классического штамма 1601 токсинопродукция в ИФА с 1:10 повышалась до 1:320 после воздействия желчью, до 1:40 (рН 9,0), до 1:640 (комбинированный стресс). В группе вибрионов Эль Тор все штаммы, кроме высокотокси-генного 1310, реагировали на стрессорное воздействие (рис.).

Продуцент холерного токсина V. choleraе El Tor 1310, как и штамм V. cholerae classical 569B, сохранял способность к высокой продукции холерогена при всех видах воздействия (лишь в присутствии желчи она немного снижалась). Остальные штаммы, обладавшие, в большинстве своем, низкой способностью к экспрессии экзотоксина in vitro, активно реагировали на стресс. При этом все штаммы резко повышали продукцию холерогена до среднего и высокого уровня при воздействии кислоты, щелочи, и комбинированного воздействия этих факторов с добавлением желчи и микроаэрофильных условий культивирования.

Максимальные уровни токсинопродукции после стрессового воздействия были зарегистрированы, в первую очередь, у штамма 19241, титры в ИФА у которого возросли с 1:2 до 1:1280; аналогичная динамика наблюдалась у штаммов 5879, 19667, 19242, 19613.

Как видно из диаграммы, штаммы, имеющие изначально низкий уровень токсинопродукции, сильнее реагировали на изменение среды в кислую сторону, что выражалось в увеличении титров на 4—6 разведений, в то время как штаммы холерных вибрионов со средним исходным уровнем (V. cholerae 17427 и 18588) меньше реагировали — титры увеличились на 2 разведения, т. е. активация экспрессии гена ctx начинается уже при

попадании холерных вибрионов в кислую среду желудка.

Похожие результаты были получены при изучении влияния щелочной среды (рН 9,0) на продукцию токсина холерными вибрионами: практически у всех штаммов наблюдалось увеличение титров на 1 —4 разведения. Исключение составили штаммы V. cholerae 5879 и 19241, у которых титры увеличились на 6—7 разведений, и V. cholerae 17427 и 1310, которые практически не реагировали на изменение условий среды.

Желчь, как монострессор, не вызывала резкого подъема уровня токсинопродукции, чаще показатели не изменялись или наблюдалась незначительная ингибиция продукции холерогена (в том числе и у вы-сокотоксигенного штамма 1310) и только у 3 штаммов показатели после инкубации с желчью незначительно возрастали на 1—2 разведения. По данным литературы, это связано с отрицательной регуляцией желчью белка ТохТ, ответственного за активацию транскрипции генов, кодирующий холерный токсин и токсин-корегулируемые пили [6].

При изучении сочетанного влияния стрессоров, наиболее приближающее условия эксперимента к естественной среде тонкого кишечника человека наблюдали значительное увеличение уровня токсинопродукции по сравнению с исходным уровнем на пять и более разведений, т.е. из низкотоксигенных штаммы переходили в высокотоксигенные, что является логичным с точки зрения патогенеза холеры и говорит об активации токсинопродукции факторами желудочно-кишечного тракта человека, приводящее к состоянию гиперинфекциозности [7].

Таким образом, установлено, что те условия, с которыми сталкиваются вибрионы при

СЕНТЯБРЬ №9 (270) ЗНифО

попадании в организм человека (кислота в ^ желудке, повышенный рН в тонком кишеч-^ нике, желчь, условия гипоксии) вызывают резкое повышение продукции экзотоксина, что свидетельствует об активации в условиях макроорганизма экспрессии генов ctxAB, с= кодирующих основной фактор вирулентности — холерный токсин.

Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Горяев А.А. Штаммы Vibrio cholerae биовара эль-тор с изменной продукцией холерного токсина: получение и молекулярно-генетический анализ: Автореф. дис. ...канд. биол. наук. Саратов, 2009. 24 с.

2. Заднова С.П. Выявление в природных популяциях холерного вибриона клонов с различной экспрессией факторов вирулентности и персистенции и их фенотипический анализ //Пробл. особо опасных инф. Саратов, 2009. Вып. 3. С. 39—44

3. Татаренко О.А. и др. Оценка устойчивости типичных и «ругозных» вариантов вибрионов Эль тор к действию абиотических факторов / О.А. Татаренко, И.С. Шестиалтынова, О.С. Чемисова //Холера и патоген. для человека вибрионы. Матер. пробл. комиссии — Ростов н/Д, 2014. Вып. 27. С. 132—135.

4. Фецайлова О.П. и др. Билирезистентность холерных вибрионов и ее роль в персистенции

возбудителя холеры / О.П. Фецайлова, О.И. Помухина, Е.В. Сизова //Рос. журн. гастоэн-терол., колопроктол. 2009. T.XIX. №5. Прилож. 34. С.180 (679).

5. Iwanaga M. [et. al] Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. / M. Iwanaga, K. 6. Yamamoto N. Higa //Microbiol. Immunol. 1986. Vol.30:1075—83.

6. Childers B.M[et. al] Terminal residues of the Vibrio cholera virulence regulatory protein ToxT involved in dimerization and modulation by fatty acids / B.M. Childers, X. Cao, G.G. Weber, B. Demeler, P.J. Hart, K.E.N Klose //J.Biol.Chem. 2011. Vol.286. № 32. P.28644—55.

7. MerrellD.S. [et. al] Host-induced epidemic spread of the cholera bacterium / D.S. Merrell, S.M. Butler, F. Qardi, N.A. Dolganov //Nature. 2002. Vol. 417. P. 642—645.

8. Murley Y.M. [et. al] Differential transcription of the tcpPH operon confers biotype-specific control of the Vibrio choleraeToxR virulence regulon / Y.M. Murley, P.A. Carroll, K. Skorupski, R.K. Taylor // Infect.Immun. 1999. Vol.67:5117—5123.

Контактная информация:

Сизова Юлия Владимировна, тел.: +7 (918) 509-74-62, e-mail: yuisa@mail.ru Contact information: Sizova Yulia,

р^га: +7 (918) 509-74-62, e-mail: yuisa@mail.ru

>

Знаменательные даты медицины СЕНТЯБРЬ

Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

3 сентября 70 лет со дня рождения Гурия Петровича Ступакова (1943) — российского специалиста в области медицины труда, авиационной медицины и психофизиологии, академика РАН, генерал-майора медицинской службы запаса, доктора медицинских наук, профессора. Ступаков внес вклад в системные исследования по оптимизации деятельности лиц экстремальных профессий в сфере авиации и космонавтики, профилактических мер их оздоровления.

5 сентября 2015 70 лет со дня рождения Олега Ивановича Киселева (1945) — российского вирусолога, академика РАН, директора НИИ гриппа, Руководителя Федерального центра по гриппу и ОРЗ. Научные исследования посвящены генной инженерии продуцентов биологически активных веществ, изучению первичной структуры генов вируса гриппа, детерминации признака резистентности вирусов к ремантадину; молекулярных механизмов действия противовирусных препаратов.

9 сентября 90 лет со дня рождения Даниэля Карлетона Гайдузека (Гайдушек) (1923—2008)

— американского врача-педиатра, вирусолога, эпидемиолога. Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1976 году «за открытия, касающиеся новых механизмов происхождения и распространения инфекционных заболеваний». Автор работ по этнографии, вирусологии, эпидемиологии, педиатрии, генетике и эволюции человека в изолированных популяциях. Впервые подтвердил инфекционную природу прогрессирующих заболеваний, сопровождающихся необратимыми дегенеративными изменениями различных органов и тканей.

9 сентября Всемирный День красоты.

10 сентября Всемирный день предотвращения самоубийств.

12 сентября (вторая суббота сентября) Всемирный день оказания первой медицинской помощи.

13 сентября 160 лет со дня рождения Ганса Кристиана Грама (1853—1938) — датского бактериолога. Разработал метод разделения двух