Научная статья на тему 'ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ РЕЧНОЙ ВОДЫ НА ТОК-СИНОПРОДУКЦИЮ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ'

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ РЕЧНОЙ ВОДЫ НА ТОК-СИНОПРОДУКЦИЮ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ Текст научной статьи по специальности «Рыбное хозяйство. Аквакультура»

CC BY-ND
2
1
Поделиться
Ключевые слова
ХОЛЕРНЫЕ ВИБРИОНЫ / VIBRIO CHOLERAE / ТОКСИНОПРОДУКЦИЯ / СТРЕСС / STRESS / РЕЧНАЯ ВОДА / RIVER WATER / TOXIN PRODUCTION

Аннотация научной статьи по рыбному хозяйству и аквакультуре, автор научной работы — Сизова Ю.В., Бурлакова О.С., Черепахина И.Я., Алексеева Л.П., Евдокимова В.В., Писанов Р.В., Водопьянов С.О.

В процессе жизнедеятельности патогенные холерные вибрионы чередуют пребывание в организме человека с персистированием в водных объектах, в результате чего подвергаются воздействию низких температур, осмолярности среды, сложностей в питании. Изучено влияние вышеперечисленных стрессорных факторов, имитирующих условия существования в окружающей водной среде, на уровень токсинопродукции холерных вибрионов. При анализе результатов показано, что токсигенные холерные вибрионы могут персистировать в воде открытых водоемов при температуре выше 22-24 °С в течение достаточно продолжительного срока с сохранением продукции холерного токсина. Низкая температура, как стрессор, моделирующий условия окружающей среды в речной воде в холодное время года, ингибирует продукцию холерного токсина уже в течение первого месяца

Похожие темы научных работ по рыбному хозяйству и аквакультуре , автор научной работы — Сизова Ю.В., Бурлакова О.С., Черепахина И.Я., Алексеева Л.П., Евдокимова В.В., Писанов Р.В., Водопьянов С.О.,

О Influence of river water temperature on toxin production vibrio cholerae

During the vital activities the pathogenic Vibrio cholerae alternate stay in the human organism with persistence in water bodies, as a result, they are exposed to low temperature, the osmolarity of the environment, difficulties in feeding. The effect of the aforesaid stress factors simulating the conditions of existence in the aquatic environment on the level of toxin production of Vibrio cholerae has been studied. The analysis results showed that the toxigenic Vibrio cholerae are able to persist in open water reservoirs at the temperature above 22-24 °С sufficiently long period while maintaining production of cholera toxin. Low temperature as a stressor, which simulates the environmental conditions in the river water in the cold season, inhibits the production of cholera toxin in the first month.

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

Текст научной работы на тему «ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ РЕЧНОЙ ВОДЫ НА ТОК-СИНОПРОДУКЦИЮ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ»

54

ЗНиСО

УДК 616.932

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ РЕЧНОЙ ВОДЫ НА ТОКСИНОПРОДУКЦИЮ

ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

Ю.В. Сизова, О.С. Бурлакова, И.Я. Черепахина, Л.П. Алексеева, В.В. Евдокимова, Р.В. Писанов, С.О. Водопьянов

ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора,

г. Ростов-на-Дону, Россия

В процессе жизнедеятельности патогенные холерные вибрионы чередуют пребывание в организме человека с персистированием в водных объектах, в результате чего подвергаются воздействию низких температур, осмолярности среды, сложностей в питании. Изучено влияние вышеперечисленных стрессорных факторов, имитирующих условия существования в окружающей водной среде, на уровень токсинопродукции холерных вибрионов. При анализе результатов показано, что токсиген-ные холерные вибрионы могут персистировать в воде открытых водоемов при температуре выше 22-24 °С в течение достаточно продолжительного срока с сохранением продукции холерного токсина. Низкая температура, как стрессор, моделирующий условия окружающей среды в речной воде в холодное время года, ингибирует продукцию холерного токсина уже в течение первого месяца. Ключевые слова: холерные вибрионы, токсинопродукция, стресс, речная вода.

Yu.V. Sizova, O.S. Burlakova, I.Ya. Cherepakhina, L.P. Alekseeva, V.V. Evdokimova, R.V. Pisanov, Б.О. Vodop'yanov □ INFLUENCE OF RIVER WATER TEMPERATURE ON TOXIN PRODUCTION VIBRIO CHOLERAE □ Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia.

During the vital activities the pathogenic Vibrio cholerae alternate stay in the human organism with persistence in water bodies, as a result, they are exposed to low temperature, the osmolarity of the environment, difficulties in feeding. The effect of the aforesaid stress factors simulating the conditions of existence in the aquatic environment on the level of toxin production of Vibrio cholerae has been studied. The analysis results showed that the toxigenic Vibrio cholerae are able to persist in open water reservoirs at the temperature above 22-24 °С sufficiently long period while maintaining production of cholera toxin. Low temperature as a stressor, which simulates the environmental conditions in the river water in the cold season, inhibits the production of cholera toxin in the first month. Key words: Vibrio cholerae, toxin production, stress, river water.

В настоящее время вопрос о стабильности основных свойств, определяющих генотип и фенотип возбудителя холеры при воздействии различных стрессовых условий (низких температур, осмолярности среды, сложностей в питании и др.), малоизучен и представляет большой интерес как с точки зрения особенностей биологии холерного вибриона, так и с целью совершенствования эпиднадзора за холерой с учетом полученных сведений о диапазоне его изменчивости в различных экологических условиях.

Как известно, наибольшую опасность в эпидемическом плане имеют токсигенные штаммы V. еко1егае, синтезирующие термолабильный эн-теротоксин - холероген, являющийся главным фактором вирулентности холерных вибрионов и определяющий основные проявления холеры. Основной метод выявления холерного токсина - ПЦР - позволяет обнаружить у исследуемых штаммов генетическую детерминанту вирулентности - ген холерного токсина СхАБ. Наличие данного гена говорит о возможности продукции холерогена штаммами холерного вибриона, и, по данным некоторых авторов, его экспрессия может изменяться под влиянием различных внешних сигналов [2, 4, 5, 7].

Цель исследования - изучение влияния различных стрессорных факторов, имитирующих условия существования в окружающей водной среде, на уровень токсинопродукции холерных вибрионов.

Материалы и методы. В работе было использовано 13 штаммов V. еко1егае О1 серогруп-пы биовара Эль-Тор, выделенных от больных, вибриононосителей и из речной воды, и 2 штамма классического биовара, содержащих ген с1хАВ. Для решения поставленных задач холерные вибрионы инкубировали в стериль7ной речной воде (конечная концентрация 1 х 10 м.к./мл) в холодильнике при 4 °С и в комнатном термостате при 22 °С в течение нескольких месяцев. Также,

моделируя условия пребывания возбудителя холеры в речной воде в летнее, осеннее и зимнее время, эксперимент продолжали 2 месяца при 22 °С, 2 месяца - при 10 °С, 5 месяцев - при 4 °С при сниженном содержании кислорода (в речной воде оно составляет около 1 %). Ежемесячно производили высевы на агар Мартена для определения выживаемости холерных вибрионов и определяли продукцию холерогена. Для этого культуры инкубировали по методике М. Iwanaga |8] на среде AKI в шуттель-аппара-те Environmental Shaker-Yncubator ES-20/60 при 120 об./мин в течение 18 часов, затем центрифугировали. Продукцию токсина определяли в супернатантах после их предварительной обработки гентамицином в концентрации 200 у на 1 мл в ОМ1-ИФА [3] с антитоксической сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов по специально разработанной авторами схеме препаратом токсина штамма V. cholerae 569, в рабочем разведении 1 х 20 000. Результаты оценивали при титрации супернатантов по следующей схеме: низкий уровень токсинопродукции - титр в ОМ1-ИФА 1/2-1/20, средний уровень - 1/40-1/320, высокий уровень - 1/6401/2560. Наличие гена ctxAB у исследуемых штаммов определяли в ПЦР [1].

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

Результаты и обсуждение. Изучение влияния низкотемпературного стресса (4 °С) на ток-синопродукцию холерных вибрионов при их персистировании в речной воде показало, что в течение первых 14 дней имело место некоторое увеличение показателей у большей части исследуемых штаммов. Исключение составили штаммы V. cholerae 1601 и 17427, у которых отмечалось незначительное снижение титра, и штаммы 569, 1310, 19188, у которых уровень продукции оставался без изменений (табл. 1).

Через месяц стрессового воздействия показатели токсинообразования резко снижались у

12763065

ЗНиСО

55

большей части штаммов, вплоть до полного исчезновения признака к концу второго месяца. К этому времени только три штамма V. cholerae el tor сохранили способность к токсинопродук-ции, определяемой методом ИФА: высокоток-^^ сигенный штамм 1310, а также 3119 и 19667. ^ij Остальные 10 штаммов перестали продуцировать холероген, несмотря на рост культуры в г-ь бульоне AKI и сохранение генов ЛхАВ. Через три месяца низкотемпературного стресса ни одна из культур не выросла в среде AKI, показатели токсинопродукции были отрицательными, гены ctxAB в ПЦР не определялись.

Таким образом, низкая температура как стрессор, имитирующий условия окружающей среды в речной воде в холодное время года, вероятно ингибирует активацию белка ToxT, ответственного за транскрипцию генов, кодирующий холерный токсин, уже в первый месяц. Установлено, что, вне зависимости от отрицательных показателей ИФА, гены сЬхАВ обнаруживаются в ПЦР до тех пор, пока в популяции исследуемых штаммов сохраняются живые вибрионы. В «пустых» пробах, исследуемых после гибели всей популяции V. cholerae, гены, ответственные за токсинопродукцию, не обнаруживаются.

При проведении опытов, моделирующих условия водоемов в эндемичных очагах (температура воды 22-24 °С, продолжительность инкубации не менее 9 месяцев) наблюдалось сохранение токсинопродукции. В течение первых 1014 дней инкубации в речной воде уровень ее значительно вырос по сравнению с исходными штаммами (за исключением показателей высокоток-сигенных эталонных штаммов 569В и 1310 -они остались на прежнем высоком уровне); т. е. как при 22 °С, так и при 4 °С имеет место повышение токсинопродукции, что, вероятно, связано с адаптивными регуляторными процессами, происходящими с холерными вибрионами при попадании из богатой питательной среды в новую экологическую нишу - речную воду, где они испытывают сложности в питании, действие необычной температуры и гипоксии [6].

При дальнейшем культивировании при 22 °С взятые в опыт классические холерные ви брионы сохраняли способность к токсинопро-дукции на протяжении периода выделения (два

месяца). При этом высоко токсигенный штамм 569В сохранял стабильно высокий титр в ИФА (1/1280), а низко токсигенный 1601 после подъема титра на 14 сутки до 1/40 к концу второго месяца снизился до исходного значения (1/10). Через три месяца все классические холерные вибрионы погибли, гены ЛхАВ не обнаруживались (генетические исследования продолжались до конца пятого месяца эксперимента).

При анализе данных, полученных при исследовании холерных вибрионов Эль-Тор, было отмечено, что основная часть штаммов сохранила и даже несколько увеличила уровень токсинопродукции к исходу первого месяца. Исключение составили штаммы V. ско1егае 19188, 18418, 18826, выделенные от больных, которые снизили титры на 1-2 разведения, но при этом они остались выше значений исходных штаммов. Наибольший интерес на этом сроке исследования представляет штамм V. ско1егае 18588, выделенный из воды реки Темерник, уровень токсинопродукции которого значительно вырос (титр составил 1/1280) и оставался таким практически до конца исследования.

К окончанию второго месяца культивирования при 22 °С в речной воде у 2 штаммов отмечалось увеличение уровня продукции холерогена титры достигали значений 1/320), у 2 V. спо1егае '879 и 17427 — некоторое снижение титров, остальные штаммы сохраняли прежние показатели. Дальнейшие исследования на протяжении 3—9 месяцев показали постепенное снижение токсинопродукции практически у всех изучаемых штаммов.

Таким образом, температура 22—24 °С при проведении опытов, моделирующих условия окружающей среды в теплое время года (или в эндемичных очагах при длительной инкубации), вызывала колебания уровня холерогена у изучаемых штаммов холерных вибрионов Эль-Тор, но при этом наблюдалось сохранение токсинопро-дукции в течение всего периода наблюдений.

Наибольший интерес представляло моделирование условий пребывания холерных вибрионов в речной воде в летнее, осеннее, зимнее время при разных температурах: (2 месяца — 22 °С, два месяца — 10 °С, 5 месяцев — 4 °С (табл. 2).

Таблица 1. Анализ динамики токсинопродукции холерных вибрионов при инкубации в речной воде при 22 °С и 4 °С (титры СМх-ИФА)

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

№ пп № штамма Дата выделения Место выделения Источник выделения Срок инкубации и температура

исход. 14 дн. 1 мес. 2 мес. 3 мес. 4 мес. 5 мес. 6 мес. 7 мес. 8 мес. 9 мес.

22 °С 4 °С 22 °С 4 °С 22 °С 4 °С 22 °С 4 °С 22 °С 22 °С 22 °С 22 °С 22 °С 22 °С

1 569В клас. 1968 Индия больной 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280 1/2 1/1280 н.и.* н.и.* н.и.* н.и.* н.и.* н.и. н.и. н.и. н.и.

2 1601 клас. 1962 Индия больной 1/10 1/40 1/2 1/40 0* 1/10 н.и.* н.и.* н.и.* н.и.* н.и.* н.и. н.и. н.и. н.и.

3 1310 1966 Индия больной 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280 н.и.* 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280

4 3119 1970 г. Одесса больной 1/2 1/20 1/20 1/160 1/40 1/160 1/40 1/80 н.и.* 1/80 1/40 1/80 1/80 1/40 1/20

5 5879 1972 г. Таганрог больной 1/2 1/160 1/160 1/320 1/80 1/80 0* 1/20 н.и.* 1/20 1/20 1/20 1/20 1/20 1/2

6 19667 2014 г. Москва больной 1/20 1/160 1/160 1/160 1/80 1/320 1/80 1/160 н.и.* 1/80 1/80 1/80 1/80 1/80 1/20

7 19242 2012 г. Москва больной 1/20 1/160 1/40 1/160 1/20 1/160 0* 1/80 н.и.* 1/80 1/40 1/80 1/80 1/40 1/20

8 19187 2010 г. Москва больной 1/10 1/160 1/40 1/160 1/10 1/160 0* 1/80 н.и.* 1/80 1/40 1/20 1/20 1/20 1/10

9 19188 2010 г. Москва больной 1/2 1/40 1/2 1/20 1/2 1/40 0* 1/40 н.и.* 1/40 1/40 1/40 1/40 1/20 1/20

10 19613 2014 р. Темерник вода 1/10 1/160 1/80 1/160 1/40 1/320 0* 1/320 н.и.* 1/320 1/320 1/320 1/160 1/160 1/20

11 19241 2011 г. Таганрог мор.вода 1/2 1/160 1/640 1/160 1/160 1/160 0* 1/80 н.и.* 1/80 1/80 1/80 1/80 1/80 1/20

12 18418 2001 г. Казань больной 1/2 1/80 1/10 1/40 1/2 1/40 0* 1/40 н.и.* 1/40 1/40 1/40 1/40 1/20 1/2

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

13 18826 2005 г. Тверь больной 1/2 1/160 1/10 1/80 1/2 1/80 0* 1/80 н.и.* 1/80 1/80 1/80 1/80 1/20 1/10

14 17427 1994 г. Хасвюрт носитель 1/40 1/160 1/10 1/160 1/20 1/80 0* 1/80 н.и.* 1/80 1/80 1/80 1/80 1/40 1/40

15 18588 2003 р. Темерник вода 1/40 1/80 1/160 1/1280 1/80 1/1280 0* 1/1280 и.и.* 1/1280 1/1280 1/320 1/320 1/160 1/40

Примечания: 0 — токсинопродукция при исследовании в ИФА отсутствовала, несмотря на наличие роста в бульоне АК1; н.и. — пробы не исследовались на токсинопродукцию, так как отсутствовал рост в бульоне АК1; * — пробы исследовались в ПЦР на наличие генов ctxAB

12763065

ЕС

ЗНиСО

Таблица 2. Изменение токсинопродукции холерных вибрионов при различных температурах в разные сроки

№ п.п. № штамма Дата выделения Место выделения Источник выделения Температура и срок инкубации

Исход. 22 °С 10 °С 4 °С

14 дн. 1 мес. 2 мес. 3 мес. 4 мес. 5 мес. 6 мес.

1 569В клас. 1968 Индия больной 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280 1/640 н.и.* н.и.* н.и.*

2 1601 клас. 1962 Индия больной 1/10 1/40 1/40 1/10 н.и. н.и.* н.и.* н.и.*

3 1310 1966 Индия больной 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280 1/1280 н.и.* н.и.* н.и.*

4 3119 1970 г. Одесса больной 1/2 1/20 1/160 1/160 1/40 н.и.* н.и.* н.и.*

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

5 5879 1972 г. Таганрог больной 1/2 1/160 1/320 1/80 1/40 1/40 н.и.* н.и.*

6 19667 2014 г. Москва больной 1/20 1/160 1/160 1/320 1/80 1/80 н.и.* н.и.*

7 19242 2012 г. Москва больной 1/20 1/160 1/160 1/160 1/320 1/80 н.и.* н.и.*

8 19187 2010 г. Москва больной 1/10 1/160 1/160 1/160 1/80 1/80 н.и.* н.и.*

9 19188 2010 г. Москва больной 1/2 1/40 1/20 1/40 1/20 1/20 н.и.* н.и.*

10 19613 2014 р. Темерник вода 1/10 1/160 1/160 1/320 1/160 1/160 н.и.* н.и.*

11 19241 2011 г. Таганрог мор. вода 1/2 1/160 1/160 1/160 1/160 н.и.* н.и.* н.и.*

12 18418 2001 г. Казань больной 1/2 1/80 1/40 1/40 1/80 1/80 н.и.* н.и.*

13 18826 2005 г. Тверь больной 1/2 1/160 1/80 1/80 1/2 н.и.* н.и.* н.и.*

14 17427 1994 г. Хасвюрт носитель 1/40 1/160 1/160 1/80 1/40 н.и.* н.и.* н.и.*

15 18588 2003 р. Темерник вода 1/40 1/80 1/1280 1/1280 1/320 1/320 н.и.* н.и.*

Примечание: 0 - токсинопродукция при исследовании в ИФА отсутствовала, несмотря на наличие роста в бульоне АК1; н.и. - пробы не исследовались на токсинопродукцию, так как отсутствовал рост в бульоне АК1; * - пробы исследовались в ПЦР на наличие генов йхАВ

Как видно из таблицы, классические холерные вибрионы 569В в течение первого месяца инкубации при 10 °С снизили уровень токсинопродукции, а еще через месяц при этой температуре не высевались и токсин не продуцировали. Гены СхАВ отсутствовали. Второй классический штамм при 10 °С не рос, токсин, соответственно, не продуцировал, гены СхАВ в ПЦР не определялись.

Токсигенные холерные вибрионы Эль-Тор переживали снижение температуры до 10 °С в течение первого месяца с сохранением незначительной части популяции. У 9 из 13 штаммов наблюдалось снижение количества токсина, что, вероятно, связано с отсутствием необходимости продукции этого белка в речной воде в больших количествах и энергетической нецелесообразности. В течение второго месяца инкубации при данной температуре уровень холеро-гена в среде АК1, определяемом в ИФА, у выжившей части популяции штаммов сохранился практически без изменений. Вибрионы штаммов У.сЬо1егае 1310, 3119, 19241, 18826, 17427 на данном сроке при 10 °С в речной воде не выделялись ни в исходных высевах, ни после культивирования в бульоне АК1, гены СхАВ в ПЦР не обнаруживались. При дальнейшем снижении температуры до 4 °С токсигенные холерные вибрионы в опытных пробах погибали, гены СхАВ в ПЦР не определялись.

Выводы. Таким образом, было показано, что токсигенные холерные вибрионы могут персистировать в воде открытых водоемов при температуре выше 22-24 °С в течение достаточно продолжительного срока с сохранением продукции холерного токсина, т. е. оставаясь эпидемически значимыми; при температуре 10 °С и ниже снижают уровни токсинопродук-ции вплоть до отрицательных значений. Изменений в популяции клеток вибрионов, выживших после низкотемпрературного стресса, свя-

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

- ♦

занных с утратой профага CTXy, несущего гены, ответственные за синтез холерного токсина, в наших экспериментах (в отличие от данных других исследователей [5]) не отмечено.

ЛИТЕРАТУРА

1. Водопьянов С. О. и др. Испытание метода ПЦР в работе индикационной лаборатории мобильного комплекса СПЭБ при исследовании экспериментальных проб на холеру / С.О. Водопьянов, А.С. Водопьянов, И.П. Олейников [и др.] // ЗНиСО.. 2011. № 8. С. 43-45.

2. Горяев А.А. Штаммы Vibrio cholerae биовара эльтор с из-менной продукцией холерного токсина: получение и мо-лекулярно-генетический анализ: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Саратов, 2009. 24 с.

3. Егоров А.М. и др. Теория и практика иммунофермент-ного анализа / А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзанти-ев, Е.М. Гаврилова. М.: Высш. шк., 1991.

4. Заднова С.П. Выявление в природных популяциях холерного вибриона клонов с различной экспрессией факторов вирулентности и персистенции и их феноти-пический анализ // Пробл. особо опасных инф. 2009. Вып. 3. С. 39-44.

5. Кульшань Т.А. и др. Потенциально эпидемически опасные штаммы холерного вибриона: механизм возникновения и структура генома / Т.А. Кульшань, Е.Ю. Бара-нихина, Д.А. Агафонов [и др.] // Холера и патогенные для человека вибрионы. 2015. № 28. С. 113-116.

6. Мишанькин Б.Н. и др. Транзиторная гиперинфекциоз-ность у холерного вибриона / Б.Н. Мишанькин, Л.В. Романова, О.С. Дуванова [и др.] // Холера и патогенные для человека вибрионы. 2010. № 23. С. 77-81.

7. Смирнова Н.И. и др. Структурные и функциональные изменения генома возбудителя холеры в водной среде / Н.И. Смирнова, Т. А. Кульшань, Н.Б. Челдышева, А.В. Осин // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2007. № 1. С. 22-27.

8. Iwanaga M. et al. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 el tor. // Microbiol. Immunol. 1986. Vol. 30. Р. 1075-83.

Контактная информация:

Сизова Юлия Владимировна, тел.: +7 (918) 509-74-62, e-mail: yuisa@mail.ru Contact information: Sizova Yulia,

phone: +7 (918) 509-74-62,

e-mail: yuisa@mail.ru ♦ -

Не можете найти то что вам нужно? Попробуйте наш сервис подбора литературы.

12763065