CC BY
21© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
О.В.Маркина1, Е.В.Максименко2, Н.В.Маркин2, Н.А.Селянская1, А.И.Шелохович1, А.Б.Мазрухо1, Н.И.Борисенко2
ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ЭКСТРАКТОВ РАСТЕНИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИМИКРОБНЫМ ЭФФЕКТОМ В ОТНОШЕНИИ VIBRIO CHOLERAE EL TOR, С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Ростовский-на-Дону противочумный институт, 2Южный Федеральный университет, Ростов-на-Дону
Цель. Изучение состава экстрактов растений с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и оценка их антимикробного эффекта в отношении штаммов Vibrio cholerae El Tor. Материалы и методы. Качественный и количественный состав растительных экстрактов был изучен с помощью ВЭЖХ. Определение чувствительности микроорганизмов к растительным экстрактам проводили методом диффузии в агаре и методом серийных разведений. Результаты. Исследован антибактериальный эффект водных, водно-спиртовых и ацетоновых экстрактов корней кермека, барбариса, солодки. Определены наиболее эффективные способы экстрагирования биологически активных веществ, обладающих антимикробным действием против различных штаммов V.cholerae El Tor. Заключение. Применение ВЭХЖ позволило установить наличие в экстрактах, обладающих антимикробным эффектом в отношении штаммов V.cholerae El Tor, катехинов, алкалоидов протоберберинов и глицирризиновой кислоты.
Журн. микробиол., 2016, № 1, С. 63—66
Ключевые слова: растительные экстракты, ВЭЖХ, Vibrio cholerae El Tor
O.V.Markina1, E.V.Maksimenko2, N.V.Markin2, N.A.Selyanskaya1, A.I.Shelokhovich1, A.B.Mazrukho1, N.I.Borisenko2
STUDY OF COMPOSITION OF PLANT EXTRACTS, POSSESSING ANTIMICROBIAL EFFECT AGAINST VIBRIO CHOLERAE EL TOR, USING HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
1Rostov-on-Don Institute for Plague Control, 2Southern Federal University, Rostov-on-Don, Russia
Aim. Study the composition of plant extracts using high-performance liquid chromatography (HPLC) and evaluation of their antimicrobial effect against Vibrio cholerae El Tor. Materials and methods. Qualitative and quantitative composition of plant extracts was studied using HPLC. Determination of sensitivity of microorganisms to plant extracts was carried out by diffusion into agar method and serial dilutions method. Results. Antibacterial effect of water, water-alcohol and acetone extracts of roots of Limonium gmelinii L., Berberis vulgaris L. and Glycyrrhiza glabra L. was studied. The most effective methods of extraction of biologically active substances, possessing antimicrobial effect against various strains of V.cholerae El Tor, were determined. Conclusion. The use of HPLC allowed to establish the presence of catechines, alkaloids protoberberines and glycyr-rhizic acid in extracts, possessing antimicrobial effect against V.cholerae El Tor strains.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 1, P. 63—66
Key words: plant extracts, HPLC, Vibrio cholerae El Tor
Одним из источников противомикробных средств природного происхождения могут явиться традиционные растения, которые содержат целый комплекс фармакологически активных соединений, обладающих выраженным антимикробным действием. Действие этих веществ основано на денатурации белков мембраны, дестабилизации систем переноса протонов и электронов, нарушении активного
транспорта, ингибирование синтеза ДНК, РНК, белков и полисахаридов. В настоящее время эти соединения представляют особый интерес в связи с появлением антибиотикорезистентных микроорганизмов, в том числе и холерных вибрионов. Описаны экстракты видов растений, обладающих антибактериальным эффектом в отношении Vibrio cholerae [3, 6 — 9]. Их качественный и количественный состав изучается с помощью различных современных методов, одним из которых является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), позволяющая разделять сложные смеси веществ до отдельных составляющих. Отечественных работ, касающихся изучения антибактериальных свойств растительных экстрактов в отношении холерных вибрионов, практически нет. В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение состава экстрактов растений с помощью ВЭЖХ и оценка их антимикробного эффекта в отношении штаммов Vibrio cholerae El Tor.
Водные и водно-спиртовые экстракты корней кермека (Limonium gmelinii L.), барбариса (Berberis vulgaris L.) и солодки (Glycyrrhiza glabra L.) приготовлены следующим образом: к высушенному и измельченному растительному материалу (10 г) добавляли 50 мл дистиллированной воды или 50% водного раствора этанола и оставляли при +4°C или + 25°C соответственно на 18 часов. Затем экстракты центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 20 минут и фильтровали через фильтровальную бумагу. Водные экстракты были обеззаражены с использованием нитроцеллюлозных мембран (диаметры пор 0,45 мкм и 0,22 мкм; Millipore). Для получения ацетонового препарата солодки навеску измельченного корня настаивали в ацетоне в течение 1 часа при интенсивном перемешивании, экстракт фильтровали, а сырье заливали ацетоном и кипятили на водяной бане в течение 5 минут с обратным холодильником. Стадию экстракции горячим ацетоном повторяли еще 2 раза. Растворитель выпаривали, а сухой осадок растворяли в 50% этаноле. В качестве контроля использовали воду и 50% раствор этанола. Качественный и количественный состав экстрактов изучали с помощью обра-щенно-фазового варианта ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «Agilent 1200» (Agilent Technologies, Waldbroon, Germany) с диодно-матричным детектированием (ДАД). Использовали следующие условия хроматографирования: колонка «Zorbax SB-C18» (2,1х150 мм, 3,5^м), подвижная фаза: ацетонитрил (CH3CN): 0,01н H2SO4 — 20:80 об. %, температура колонки 28°С, скорость потока подвижной фазы 0,14 мл/мин, длина волны на УФ-детекторе — 205, 280 нм, время хроматографирования — 40 мин, объем вводимой пробы — 1,0 мкл. При детальном изучении экстрактов, содержащих катехины, использовали следующие условия хроматографирования: подвижная фаза — CH3CN: 0,01н серная кислота — 8:92 (градиент), температура колонки 35°С, скорость элюента 0,14 мл/мин, УФ-детектор 320, 290, 264, 254 и 205 нм. Количественное определение суммы катехинов в экстрактах кермека проводили по методу абсолютной калибровки. В качестве стандартов использовали следующие препараты: катехин и эпикатехин (ICN Biomedicals Inc.), гидрохлорид берберина (Fluka), глицирризиновая кислота (Fluka). Антимикробный эффект экстрактов изучали с помощью токсигенных штаммов V.cholerae El Tor Р-18895, Р-18826, Р-4696, Р-12214, V.cholerae dassica Р-1391 и атоксигенных штаммов V.cholerae El Tor Р-18943, Р-18960, Р-17905, V.cholerae nonO1/nonO139 Р-9741, полученных из музея Ростовского-на-Дону противочумного института. Среди них штамм V.cholerae El Tor Р-18826 являлся высокорезистентным к на-лидиксовой кислоте, стрептомицину, ампициллину, триметоприму/сульфаметок-сазолу, умеренно резистентным к цефтриаксону и цефотаксиму, имел перекрестную устойчивость к фторхинолонам (ципрофлоксацину, офлоксацину, пефлоксацину, норфлоксацину). Для оценки антибактериального действия экстрактов колонии суточных культур вибрионов суспендировали в ФСБ (рН 7,4) с таким расчетом, чтобы плотность клеток достигала 109 КОЕ/мл. На чашки c агаром LB (рН 7,2) высевали по 0,1 мл бактериальной суспензии. Металлическим пробойником асептически делали лунки d=5мм, в которые вносили испытуемые препараты растений в различных концентрациях в объеме 50 мкл. Результаты
учитывали на следующие сутки, измеряя диаметры зон подавления роста вибрионов. Определение чувствительности микроорганизмов к растительным препаратам методом серийных разведений проводили на агаре LB, в который добавляли растительные препараты в разных концентрациях. Для этого стерильно вносили во флакон с 18 мл агара по 2 мл различных препаратов. Тщательно перемешивали и выливали в чашку Петри. После этого на поверхность агара наносили бактериальную суспензию (109 КОЕ/мл). Через сутки учитывали интенсивность роста бактерий. Для статистической обработки результатов использовали пакет программ Office XP (Excel).
При изучении хроматограммы водного экстракта кермека были зарегистрированы несколько пиков в области УФ спектра 205 нм. Согласно данным литературы, таким поглощением характеризуются хромофоры класса R-OH [2]. К ним относятся гидролизуемые и негидролизуемые танины, в частности, катехин, эпи-катехин и их производные. Испытание полученного экстракта, содержащего катехин и его производные в концентрации 4,6 мг/мл, показало, что диаметры зон подавления роста (ЗПР) холерных вибрионов в концентрации 109 КОЕ/мл, составили от 10 до 16 мм. Если концентрацию микроорганизмов снижали до 108 КОЕ/мл, то диаметр ЗПР увеличивался в некоторых случаях до 36 мм. В методе серийных разведений нами было установлено, что при добавлении в питательный агар LB экстракта кермека, содержащего катехины в концентрациях от 1,0 до 2,3 мг/мл, полностью подавлялся рост холерных вибрионов. На хроматограммах водных экстрактов корней барбариса и стандарта берберина зарегистрированы пики с tR=18,2; 19,99; 35,97 и 38,58 минут, свидетельствующие об одинаковой химической природе данных соединений, а именно — алкалоиды протобербери-ны; наличие пиков с tR в пределах 2 — 7 минут свидетельствовало о содержании в экстракте также соединений из группы катехинов. Данный экстракт барбариса, содержащий 5,3 мг/мл бербериновых алкалоидов, обладал более слабой активностью в отношении вибрионов, чем экстракт кермека и, в частности, не ингиби-ровал рост штаммов V.cholerae El Tor P-18895, P-4696, P-18826. Диаметры ЗПР остальных штаммов не превышали 10,0 мм. На хроматограмме водного экстракта корней солодки регистрировали небольшие пики, соответствующие пикам гли-цирризиновой кислоты и ее производных — главных биологически активных веществ этого растения. Однако данный экстракт оказался неактивным в отношении всех изученных штаммов холерных вибрионов.
Поскольку считается, что вода достаточно слабо экстрагирует такие соединения как алкалоиды, полифенолы, флавонолы и терпеноиды, то на следующем этапе работы для их экстракции из корней кермека, барбариса и солодки использовали 50% этанол. В результате, были получены водно-спиртовые экстракты кермека, которые обладали активностью, не превышающей активность водных экстрактов. Водно-спиртовые экстракты корней барбариса содержали бербери-новые алкалоиды в концентрации 7,2 мг/мл и обладали активностью в отношении всех штаммов холерных вибрионов; диаметры ЗПР составляли от 10 до 18 мм. В методе серийных разведений экстракты с содержанием алкалоидов в концентрации 3 — 4 мг/мл ингибировали рост всех штаммов V.cholerae. В водно-спиртовом экстракте корней солодки концентрация глицирризиновой кислоты составляла 16,2 мг/мл. При его испытании установлено, что диаметры ЗПР штаммов V.cholerae были на уровне 11,0 — 15,0 мм. Одновременно нами были получены ацетоновые экстракты корней солодки с концентрацией глицирризиновой кислоты 20,2 мг/мл. Антимикробная активность ацетоновых экстрактов в сравнении с водно-спиртовыми увеличивалась в 1,5 — 2 раза.
Таким образом, в настоящем исследовании нами был изучен антимикробный эффект в отношении штаммов холерных вибрионов экстрактов корней кермека, барбариса и солодки, полученных различными способами и охарактеризованных с помощью ВЭЖХ. Установлено, что экстракты обладают различной антимикробной активностью в отношении штаммов V.cholerae El Tor. Так, высоким антибак-
5. ЖМЭИ 1 № 22-2016
65
териальным эффектом обладал водный экстракт кермека, что, по-видимому, связано с наличием в нем соединений, принадлежащих группе катехинов (эпи-катехины, эпигаллокатехины и др.), обладающих способностью связываться с различными структурными белками клеточной стенки, токсинами, ферментами, адгезинами вибрионов, которые представлены в корнях кермека. Считается, что из индивидуальных веществ, именно эпигаллокатехин-3-О-галлат имеет высокий показатель противомикробной активности при минимальной концентрации. Антибактериальная активность экстрактов барбариса в отношении некоторых грамотрицательных микроорганизмов, как известно, связана с алкалоидами про-тоберберинами [4]. Эти соединения непосредственно воздействуют на ДНК клетки путем интеркаляции (образование вставок между парами оснований), запускают механизм свободно-радикального окисления с повреждением мембран клеток и внутриклеточных структур, ДНК, что ведет к нарушению процессов репликации и транскрипции [5]. Эти вещества и были нами обнаружены в водном и водно-спиртовом экстрактах барбариса. Однако не исключено, что определенный вклад в их антимикробный эффект вносят и соединения группы катехинов, обнаруженные в экстракте корней барбариса. Антибактериальную активность экстрактов корней солодки, как правило, связывают с тритерпеноидами, в частности, глицирризиновой кислотой и ее солями, изофлавоноидами, например, глабридином и др. [1]. В нашем эксперименте высокой активностью обладали только водно-спиртовой и ацетоновый экстракты, тогда как водные были неактивны, хотя в них также регистрировали присутствие глицирризиновой кислоты. Не исключено, что наиболее высокое биологическое действие ацетоновых экстрактов связано не только с глизирризиновой кислотой, но и с присутствием в них каких-то других антибактериальных соединений. Можно заключить, что благодаря ВЭЖХ нам удалось провести качественную и количественную характеристику экстрактов растений и определить наиболее эффективные способы экстрагирования биологически активных веществ, обладающих антимикробным действием в отношении различных штаммов V.cholerae El Tor, в том числе и анти-биотикорезистентных.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 13-03-12271 офим).
Л ИТЕРАТУРА
1. Астафьева О.В. Использование Glicyrriza glabra, Achillea micrantha Willd. и Helichrysum arenarium L. для разработки биопрепаратов с антибактериальными свойствами. Автореф. дис. канд. биол. наук. Ставрополь, 2013.
2. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976.
3. Akinsinde K.A., Olukoya D.K. Vibriocidal activities of some local herbs. J. Diarrhoeal. Dis. Res. 1995, 13 (2): 127-129.
4. Cernáková M., Kostálová D. Antimicrobial activity of berberine — aconstituent of Mahonia aquifolium. Folia Microbiol. (Praha). 2002, 47 (4): 375-378.
5. Cowan M.M. Plant products as antimicrobial agents. Clinical. Microbial. Rev. 1999, 12 (4): 564-582.
6. Kumar P., Selvi S.S., Govindaraju M. et al. In vitro anti-biofilm and anti-bacterial activity of Junceella juncea for its biomedical application. Asian. Pac. J. Trop. Biomed. 2012, 2 (12): 930935.
7. Mutalib A. A., Ashwell R. N., Kannan R. R. et al. Antimicrobial and selected in vitro enzyme inhibitory effects ofleaf extracts, flavonols and indole alkaloids isolated from croton menyharthii. Molecules. 2013, 18: 12633-12644.
8. Sánchez E., García S., Heredia N. Extracts of edible and medicinal plants damage membranes of Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbial. 2010, 76 (20): 6888-6894.
9. Yamasaki S., Asakura M., Basu N. S. et al. Inhibition of virulence potential of Vibrio cholerae by natural compounds. Indian. J. Med. Res. 2011, 133 (2): 232-239.
Поступила 10.06.15
Контактная информация: Маркина О.В.,
344002, Ростов-на-дону, ул. М.Горького, 117/40, р.т. (863)234-23-11
