Мембраносвязанные протеазы ompT+ и ompT - штаммов холерного вибриона Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

МИКРОБИОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

С.Н.Козлов, В.Б.Николаев, Е.Ю.Марков, Л.Я.Урбанович, Л.В.Миронова

МЕМБРАНОСВЯЗАННЫЕ ПРОТЕАЗЫ OMPT+ И OMPT- ШТАММОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА

Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока

Цель. Выявление протеаз в наружных мембранах (НМ) отрТ+ и отрТ-штаммов холерного вибриона О1 и О139 серогрупп. Материалы и методы. Специфически стерильные препараты НМ получали лизисом живых клеток холерных вибрионов 4,5 М раствором мочевины с последующим дифференциальным центрифугированием и обработкой нуклеазами. Экстракцию белков НМ, предварительно обработанных саркозинатом натрия, проводили Тритоном Х-100 в присутствии ЭДТА. Протеазный и полипептидный спектры изучали в субстратном и SDS-электрофорезе. Чувствительность протеаз к ингибиторам определяли в диффузионном тесте в агарозном геле, содержащим субстрат, с использованием соевого ингибитора трипсина (СИТ) и фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ). Наличие гена ompT определяли в ПЦР с использованием специфических праймеров. Результаты. По данным ПЦР 13 штаммов Vibrio cholerae О1 и 3 штамма V. cholerae О139, выделенные из клинического материала, а также 22 штамма V. cholerae О1, изолированные из объектов окружающей среды, содержали ген ompT. Два штамма V. cholerae О1, выделенные от человека, 9 штаммов V. cholerae О1 и 2 штамма V. cholerae О139, выделенные из окружающей среды, не имели ompT гена. С помощью ДСН- и энзим-электрофореза в полиакриламидном геле обнаружены количественные и качественные различия в составе полипептидов и протеаз, гидролизующих желатин, казеин и протаминсульфат, НМ ompT+ и ompT- штаммов холерных вибрионов. Ингибирование экстрактов НМ ФМСФ и СИТ приводило к снижению их протеолитической активности. Заключение. В препаратах и экстрактах НМ ompT+ и ompT- V. cholerae обнаружено до трех протеаз, часть из которых может быть отнесена к омптиноподобным.

Журн. микробиол., 2013, № 2, С. 3—12

Ключевые слова: Vibrio cholerae, протеазы, субстратный электрофорез, наружные мембраны

S.N.Kozlov, V.B.Nikolaev, E.Yu.Markov, L.Ya.Urbanovich, L.V.Mironova

MEMBRANE-BOUND PROTEASES OF ompT+ AND ompT- VIBRIO CHOLERAE STRAINS

Irkutsk Research Institute of Plague Control of Siberia and the Far East, Russia

Aim. Detection of proteases in outer membranes (OM) of ompT+ and ompT-Vibrio cholerae strains of O1 and O139 serogroups. Materials and methods. Specific sterile preparations of OM were obtained by lysis of live V. cholerae cells by 4.5 M urea solution with subsequent differential centrifugation and treatment by nucleases. Extraction of OM proteins previously treated by sodium sarcosinate was carried out by Triton X-100 in the presence of EDTA. Protease and polypeptide spectra were studied in substrate and SDS electrophoresis. Sensitivity of proteases to inhibitors was determined in diffusion test in agarose gel containing substrate by using soy trypsin inhibitor (STI) and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF). The presence of ompT was determined in PCR by using specific primers. Results. According to PCR data 13 Vibrio cholerae О1 strains and 3 V. cholerae О139 strains isolated from clinical material as well as 22 V. cholerae О1 strains isolated from environmental objects contained ompT gene. 2 V. cholerae О1 human isolated strains, 9 V. cholerae О1 strains and 2 V. cholerae О139 strains isolated from the environment did not have ompT gene. By using SDS- and enzyme-electrophoresis in polyacrylamide gel quantitative and qualitative differences in composition of polypeptides and proteases of OM ompT+ and ompT- V. cholerae strains that hydrolyze gelatin, casein and protamine sulfate were detected. Inhibition of OM by STI and PMSF resulted in a decrease of their proteolytic activity. Conclusion. In preparations and extracts of ompT+ and ompT- V. cholerae OM up to 3 proteases some of which may be related to ompT-like were detected.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 2, P. 3-12

Key words: Vibrio cholerae, proteases, substrate electrophoresis, outer membranes

ВВЕДЕНИЕ

Наличие у бактерий протеолитических ферментов, ассоциированных с мембранами, свидетельствует об их участии в разнообразных физиологических процессах, а также в иммуно- и патогенезе многих инфекционных заболеваний, что обусловливает актуальность изучения этих белков [6]. Особый интерес вызывают относящиеся к семейству омптинов протеазы/адгезины наружных мембран (НМ) грамотрицательных бактерий [20]. Прототипом этой уникальной группы эндопептидаз является белок НМ (БНМ) OmpT Escherichia coli K-12. К омптинам также относят БНМ OmpP E. coli, SopA Shigella flexneri, PgtE Salmonella enterica и Pla

Yersinia pestis. Большинство омптиновых белков относят к факторам вирулентности патогенных бактерий, они играют роль в патогенезе заболевания, что делает их потенциальными мишенями при разработке антибактериальных препаратов и вакцин. Многие представители этого семейства протеаз способны защищать клетки патогенных бактерий от воздействия катионных антимикробных пептидов (дефензинов) [19], активировать воспалительную реакцию организма хозяина и обладают антикоагуляционной активностью [12]. Сведения о наличии протеаз необходимо учитывать при изучении протеома бактериальных клеток и получении рекомбинатных белков с использованием бактерий, поскольку многочисленные цитоплазматические и ассоциированные с клеточными стенками и мембранами протеазы могут вызывать деградацию или появление нефункциональных белков в результате протеолиза [10]. Омптины обладают уникальным активным центром, совмещающим элементы сериновых и аспарагиновых протеаз, критическим для проявления их активности является взаимодействие с ЛПС [9].

Сведений о наличии аналогичных протеаз у холерного вибриона нет. Однако с помощью диффузионного теста [1], спектрофотометрии [2, 3] и субстратного диск-электрофореза [5] показано наличие у Vibrio cholerae в НМ протеаз, способных гидролизовать желатин, казеин и специфичный для омптинов субстрат — антимикробный пептид протамин [3], а также активировать плазминоген человека [4], что сближает эти протеазы с ом-птинами. Сравнение состава протеаз холерных вибрионов, различающихся по содержанию гена, кодирующего синтез белка НМ OmpT, может помочь выяснить наличие или отсутствие омптинов у холерного вибриона.

Цель работы — зимографический анализ в электрофорезе состава протеаз наружных мембран отрТ+ и отрТ- штаммов холерного вибриона.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Всего изучен 51 штамм холерного вибриона, изолированный от людей и из объектов окружающей среды в период осложнений по холере и из объектов окружающей среды на фоне эпидемиологического благополучия (табл. 1).

Специфически стерильные препараты НМ получали по модифицированному методу A. Lohia et al. (1984) посредством лизиса живых клеток холерных вибрионов 4,5 М раствором мочевины с последующим дифференциальным центрифугированием и обработкой нуклеазами [1]. Равновесное (изопикническое) центифугирование препарата НМ холерного вибриона в градиенте плотности сахарозы проводили по методу C.A. Schnaitman [18] на ультрацентрифуге Spinco L2 65B (Beckman) и роторе SW 28 с последущим определением плавучей плотности. НАДхН-де-гидрогеназную активность определяли спектрофотометрически по изменению оптической плотности реакционной среды при 340 нм и 600 нм в присутствии 2,6-дихлорфенолиндофенола [17]. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-26. Содержание белка, гексоз,

Таблица 1. Характеристика штаммов холерных вибрионов

Генотип

Штаммы Объект выделения Кол-во ctxAB+, tcpA+, toxR+ ctxAB-, tcpA+, toxR+ ctxAB-, tcpA-, toxR+ ctxAB-, tcpA-, toxR-

V.cholerae eltor О1 человек 15* 12 1 1 1

ООС 31 4 0 22 5

V.cholerae О139 человек 3 3 0 0 0

ООС 2 0 0 2 0

Всего 51 19 1 25 6

Примечание. *В том числе один штамм RO-вариант; ООС — объекты окружающей среды.

общих липидов, мурамовой кислоты, ЛПС определяли общепринятыми методами.

Экстракцию белков НМ, предварительно обработанных 1% раствором саркозината натрия для удаления возможных примесей белков цитоплаз-матической мембраны [7], проводили 4% раствором Тритона Х-100 в присутствии 5 мМ ЭДТА в течение 30 мин согласно процедуре, разработанной для выделения OmpT из НМ V. cholerae [8], с последующим осаждением двумя объемами охлажденного (4°С) изо-пропилового спирта.

Протеазную активность препаратов оценивали в диффузионном тесте в 1% агарозном геле с использованием в качестве субстрата желатина (0,5%) («Serva»), казеина (0,25%) («Sigma»), протаминсульфата (0,5%) («Sigma»). Для диффузионного теста образцы готовили с добавлением 10 mM ^додецил-^^диметил-1-аммонио-3-пропансульфоната (DodMe2 NPrSO3) («Serva») и без добавления.

Полипептидный спектр препаратов изучали с использованием диск-электрофореза в 10-13% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецидсульфата натрия и в денатурирующих условиях с окраской Кумасси ярко-синим R-250 [15]. Анализ полученных электрофореграмм проводили с использованием системы гель-документирования Gel-Doc XR+ и компьютерной программы «Image Lab 2.01» («Bio-Rad»).

Протеазный спектр препаратов изучали с использованием субстратного электрофореза в ПААГ, содержащего в качестве субстрата либо желатин, либо казеин или протаминсульфат в конечной концентрации 0,1% [11]. Гели окрашивали раствором Амидочерного 10 В («Serva»).

Чувствительность протеаз к ингибиторам в препаратах определяли в диффузионном тесте с использованием соевого ингибитора трипсина (СИТ) («Reanal») и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) («Sigma»).

ДНК холерного вибриона получали термолизисом микробных взвесей исследуемых штаммов в концентрации 108 м. к./мл по ОСО мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Реакционную смесь для ПЦР готовили с использованием универсальных наборов (ООО «Синтол»), реакцию амплификации проводили на термоциклере С 1000 Termocycler («Bio-Rad»). Учет

результатов амплификации осуществляли электрофорезом в 1,5% агароз-ном геле при напряжении 160 В в Трис-боратном буфере с использованием для оценки размера ампликонов маркеров молекулярной массы 100

— 1000 п.н. («Fermentas»). Анализ электрофореграмм проводили с использованием программы «Gel Imager 2.0»(«Bio-Rad»). Статистическая обработка данных проведена общепринятыми методами.

Наличие гена ompT определяли методом ПЦР с использованием специфических праймеров ompT F — ATTGGTTCTGGTTCTTCG и ompT R — TTTGCATTATCTTCTGGA [16].

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

Наличие в геноме вибрионов гена оmpT, кодирующего соответствующий белок НМ, определяли по наработке в ПЦР специфического ампли-кона размером в 350 п. н. (рис. 1). Все штаммы, изолированные в период острых вспышек холеры от больных и из объектов окружающей среды, обладающие основными генетическими детерминантами вирулентности

— ctxAB, tcpA и toxR, содержат ген ompT. Штамм от вибриононосителя V. cholerae И-1299 не содержал ген ompT. Отличались отсутствием гена ompT и ряд изолированных из поверхностных водоемов в период эпидбла-гополучия штаммов холерного вибриона, лишенных генов токсинообра-зования и токсинкорегулируемых пилей адгезии. Молекулярно-генетическое исследование показало, что к вибрионам с оmрТ+ генотипом относится большинство исследованных штаммов холерного вибриона обеих серогрупп, обладающих основными генетическими детерминантами вирулентности, и часть авирулентных штаммов (табл. 2).

Изучение протеаз проводили на препаратах НМ, получаемых обработкой живых клеток холерного вибриона 4,5 М раствором мочевины. Данный метод позволяет выделять специфически стерильные препараты НМ, сохраняющие ферментативную активность [1]. Осаждаемые при 105000 g НМ

1Í3Ü 5Б739 10

Рис. 1. Электрофорез продуктов амплификации в ПЦР препаратов ДНК V.cholerae eltor.

1 — V.cholerae eltor И-1362; 2 — V.cholerae eltor И-563; 3 — V.cholerae И-502; 4 — V.cholerae eltor 2-01; 5 — V.cholerae eltor И-1330; 6 — V.cholerae eltor И —1337; 7 — V.cholerae eltor И-914; 8 — маркер молекулярного веса «Fermentas» от 100 до 1000 п. н.; 9 — отрицательный контроль — дистиллированная вода; 10 — V.cholerae eltor И-1298.

Таблица 2. Результаты скрининга в ПЦР штаммов V. choleгae на наличие ompT гена

Штаммы Объект выделения Количество отрТ+ штаммов Количество отрТ-штаммов

УсИо1егае еНог О1 человек 13 2

ООС 22 9

УсИо1егае О139 человек 3 0

ООС 0 2

Примечание. ООС — объекты окружающей среды.

имеют серовато-белый цвет, нерастворимы в воде и состоят, как было показано ранее [2], из замкнутых мембранных образований — везикул, лишенных цитоплазматического содержимого целых микробных клеток. При центрифугировании в градиенте плотности сахарозы НМ формируют один серовато-белый слой с плавучей плотностью около 1,24 г/мл, соответствующей плавучей плотности НМ других грамотрицательных бактерий [13]. Свежевыделенные НМ не обладали НАДхН-дегидрогеназной акив-ностью, характерной для цитоплазматической мембраны.

Препараты НМ вызывают сдвиг максимума поглощения карбоциани-нового красителя (КК) (530 нм) в более коротковолновую область спектра (467 нм), что свидетельствует о наличии в них маркерного компонента НМ липополисахарида (ЛПС). Судя по величине оптической плотности комплекса с КК, содержание ЛПС в НМ составляло около 25%. Кроме того, химический анализ показал, что препараты НМ холерного вибриона содержат (в% к сухому весу) 30 — 37% общих липидов, 40 — 45% белка, 20% эквивалентов глюкозы.

В субстратном электрофорезе проанализировано двадцать два штамма холерного вибриона, в том числе 17 штаммов V. сИо1егае еког 01 и 5 штаммов V. сИо1егае 0139. Показано наличие на энзимограммах нескольких протеолитических белковых полос, отличающихся по электрофоретиче-ской подвижности и интенсивности протеолиза субстрата, импрегнирую-щего полиакриламидный гель (рис. 2).

По распределению зон гидролиза субстрата все штаммы как отрТ+, так и отрТ- можно разделить на две группы: в одной отмечены протеазы с молекулярной массой 38, 44, и 50 кДа (рис. 2, А), а в другой препараты НМ содержали единичные протеазы с молекулярной массой около 100 кДа (рис. 2, А) или нескольких протеаз с мол. массой от 45 до 100 кДа (рис. 2, А). Штамм V. сИо1егае 1291 (клинический изолят), отличающийся от других клинических штаммов отсутствием основных детерминант вирулентности и гена отрТ, обладал сходным протеазным репертуаром (рис. 2, А, трек 5). В препаратах НМ штаммов, выделенных из поверхностных водоемов в период эпидблагополучия по холере (V. сИо1егае еког 2131, И-1407, 2131, 129-05-В и V. сИо1егае 0139 И-5 и И-16) и лишенных основных детерминант вирулентности и гена отрТ, также обнаружены белки, обла-

дающие протеазной активностью. Единственным штаммом, в препарате НМ которого отсутствовали полипептиды с протеазной активностью, оказался штамм И-1299, выделенный от вибриононосителя и не обладающий ни основными детерминантами вирулентности, ни отрТ-геном (рис. 2, А, трек 7).

Экстракцию протеаз из НМ V. еИо1егае И-1263 (отрТ+) и И-638 (отрТ-) осуществляли обработкой Тритоном Х-100 в присутствии ЭДТА. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле показал наличие в экстрактах НМ указанных штаммов 3 мажорных полипептидов с мол. массой в пределах 35, 38 и 40 кДа. На зимограмме этих экстрактов выявлено наличие также трех протеаз с молекулярной массой от 36, 38 и 40 кДа, расщепляющих наряду с желатином и казеином протаминсульфат (рис. 2, Б, трек 1, 2).

А 1 е й 1 в г; 7 & Я № Ь 1 г

т

^_^^в

Рис. 2. Энзим-электрофорез препаратов НМ V.choleгae и их экстрактов в 7,5% ПААГ, содержащим 0,1% желатине. Окраска Амидочерным 10 B.

А: 1 — Маркерные белки: 92,5; 67; 45; 30 кДа; 2 — УеИо1егае 0139 И-5; 3 — УеИо1егае еНог И-638; 4 — V.cho1erae 0139 И-11; 5 — V.cho1erae еИог 1291; 6 — V.cho1erae еИог И-1263; 7 — V.cho1erae еНог И-1299; 8 — V.cho1erae еНог И-1327; 9 — V.еho1eгae еИог И-1330; 10 — V.еho1eгae еИог И-1332. Б: 1 — экстракт из НМ V.cho1erae еНог И-638, 2 — экстракт из НМ V.cho1erae еИог И-12.

Рис. 3. ДСН-электрофорез препаратов экстрактов белков из наружных мембран V.choleгae в 13% ПААГ. Окраска Кумасси R-250.

1 — Маркер молекулярного веса 6,5 — 200 кДа; 2 — V.cho1erae еНог 129-05-В; 3 — V.cho1erae еНог 1291; 4 — V. cho1erae еНог И-1407; 5 — V.cho1erae еНог 1263; 6 — V.cho1erae еИог 1298; 7 — V.cho1erae еНог И-1369; 8 — V.еho1eгae О139 И-5; 9 — V.cho1erae еНог И-1330; 10 — V.cho1erae еНог И-1298.

Экстракты НМ проявляли протеазную активность и в диффузионных тестах с желатином, казеином и протаминсульфатом в качестве субстрата. Оптимум рН для экстрактов при использовании в качестве субстрата желатина оказался разным: так, для экстракта НМ V. сИо1егае И-1263 он составил 8,3; для экстракта НМ V. сИо1егае И-638 — 7,5. Отмечена более высокая гидролитическая активность экстракта НМ V. сИо1егае И-1263 в сравнении с экстрактом И-638 в отношении желатина и протаминсуль-фата: 6±0,05 мм против 3±0,05 мм и 4±0,05 мм против 2±0,05 мм соответственно (Р<0,05). Добавление в образцы экстрактов детергента DodMe2NPгS03, используемого для рефолдинга мембранных белков [14], оказывало положительный эффект и приводило к увеличению зон гидролиза обоих экстрактов на 2 мм. Ингибиторы сериновых протеаз СИТ и PMSF в 5 тМ концентрации в диффузионном тесте снижали активность обоих экстрактов, уменьшая размер зон гидролиза вдвое.

SDS-электрофорез экстрактов НМ выявил некоторые различия в экспрессии БНМ с молекулярной массой 38 и 40 кДа. При сравнении полипептидных спектров отрТ+ и отрТ- штаммов V. сИо1егае наблюдается отсутствие полипептида с мол. массой 40 кДа (рис. 3, треки 2 — 4) у отрТ-штаммов, в то время как у отрТ+ штаммов он присутствует ( рис. 3, треки 5 — 10).

ОБСУЖДЕНИ Е

ПЦР-анализ взятых в исследование штаммов показал, что ген отрТ присутствует в геноме подавляющего большинства штаммов V. сИо1егае еког 01 серогруппы (клинических и из поверхностных водоемов), в то время как у представителей V. сИо1егае 0139 он обнаруживается у всех клинических штаммов, водные же изоляты этой серогруппы характеризуются отсутствием отрТ гена, что может свидетельствовать о роли 0МРТ+ в патогенезе заболевания.

SDS-электрофорез выявил различия в составе полипептидов, экстрагированных из наружных мембран отрТ+ и отрТ- штаммов холерного вибриона. Так, в большинстве отрТ+ штаммов (V. сИо1егае 1263, 1298, 1330, 0139 И-5) был обнаружен полипептид с молекулярной массой 40 кДа (предположительно, 0трТ), а у отрТ- штаммов его обнаружено не было. Также у всех штаммов был обнаружен полипептид (предположительно, 0три) с мол. массой 38 кДа. Однако необходимо учитывать возможное влияние протеолитической деградации полипептидов НМ под действием обнаруженных протеаз во время процедуры получения субклеточных фракций холерного вибриона за счет их лизиса мочевиной, учитывая способность омптиноподобных протеаз сохранять свою активность в денатурирующих условиях при высоких концентрациях мочевины вплоть до 8 М концентрации [21].

В НМ и их экстрактах отрТ+ и отрТ- штаммов холерного вибриона обнаружены протеазы с широким диапазоном молекулярных масс. Исключение составил один штамм от вибриононосителя, не проявляющий активности в данных условиях. С помощью субстратного электрофореза

обнаружены количественные и качественные различия в составе мембра-носвязанных протеаз ompT+ и ompT- штаммов V. cholerae. Препараты НМ V. cholerae 0139 отличаются наличием высокомолекулярных протеаз. Экстрагированные из НМ Тритоном Х-100 V. cholerae И-1263 и И-638 про-теазы сохраняют свою активность и проявляют чувствительность к ингибиторам сериновых протеаз. Протеазы отрТ+ штаммов, в отличие от протеаз отрТ- штаммов, способны гидролизовать наряду с желатином и казеином катионный пептид протаминсульфат, специфичный для омпти-нов/адгезинов энтеробактерий.

Таким образом, в препаратах НМ V. cholerae обнаружены мембрано-связанные белки, обладающие протеолитической активностью в отношении антимикробного катионного пептида и чувствительностью к ингибиторам сериновых протеаз. Учитывая выявленную способность мембраносвязанных протеаз гидролизовать антимикробный катионный пептид протаминсульфат, подавление их активности ингибиторами сери-новых протеаз (PMSF), а также взаимосвязь между наличием гена ompT и присутствием протеаз в НМ исследованных штаммов, выделенные из НМ холерного вибриона протеазы можно отнести к семейству омптиноподоб-ных белков. Однако необходимы дальнейшие исследования в отношении очистки, выявления субстратной специфичности и характеристики иммунобиологических свойств обнаруженных нами протеаз.

ЛИТЕРАТУРА

1. Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Голубинский Е.П. и др. Наружные мембраны холерного вибриона как потенциальный компонент химической вакцины. Журн. микробиол. 1995, 2: 86-89.

2. Марков Е.Ю. Поверхностные структуры и антигены холерного вибриона, бруцелл и туляремийного микроба. Автореф. дис. д-ра биол. наук. Иркутск, 2000.

3. Мишанькин Б.Н., Шипко Е.С., Атарова Г.Т. и др. Способность 0mpT+ и OmpT-штаммов холерных вибрионов гидролизовать антимикробный пептид протаминсульфат. Акт. вопр. инфекц. патол. Ростов-на-Дону, 2009, с. 426-430.

4. Мишанькин Б.Н., Шипко Е.С., Дуванова О.В. и др. Способность холерного вибриона активировать плазминоген человека в условиях in vitro. В: Материалы проблемной комиссии Координационного научного совета по санитарной охране территории. Ростов-на-Дону, 2010, 23, с.110-113.

5. Николаев В.Б., Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я. и др. Протеазный спектр наружных мембран Vibrio cholerae О1 и О139 серогрупп. Журн. инфекц. патол. 2009, 16 (3): 43-47.

6. Сабирова А.Р., Рудакова Н.Л., Шагимарданова Е.И. и др. Мембраносвязанные металлопротеиназы бактерий. Ученые записки Казанского университета. Естественные науки. 2011, 153 (2): 89-95.

7. Baneyx F., Georgiou G. In vivo degradation ofsecreted fusion proteins by the Escherichia coli outer membrane protease OmpT. J. Bacteriol. 1990, 172 (1): 491-494.

8. Chakrabarti S.R., Chaudhuri K., Sen K. et al. Porins of Vibrio cholerae: purification and characterization of OmpU. J. Bacteriol. 1996, 178 (2): 524-530.

9. Eren E., Murphy M., Goguen J.et al. An active site water network in the plasminogen activator Pla from Yersinia pestis. Structure. 2010, 18 (7): 809-818.

10. Hecker M., Antelmann H., Buttner K. et al. Gel-based proteomics of Gram-positive

bacteria: a powerful tool to address physiological questions. Proteomics. 2008, 8 (2324): 4958-4975.

11. Heussen C., Dowdle E. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in Polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem. 1980, 102 (1): 196-202.

12. Hwang B.Y., Varadarajan N., Li H. et al. Substrate specificity of the Escherichia coli outer membrane protease OmpP. J. Bacteriol. 2007, 189 (2): 522-530.

13. Johnston K.H., Gotschlich E.C. Isolation and characterization ofthe outer membrane of Neisseria gonorrhoeae. J. Bacteriol. 1974, 119 (1): 250-257.

14. Kramer R., Zandwijken D., Egmond M. et al. In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT. Eur. J. Biochem. 2000, 267 (3): 885-893.

15. Laemmli U., Favre M. Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events. J. Mol. Biol. 1973, 80 (4): 575-599.

16. Merrell D., Bailey C., Kaper J. et al. The ToxR-mediated organic acid tolerance response of Vibrio cholerae requires OmpU. J. Bacteriol. 2001, 183 (9): 2746-2754.

17. Mizushima S., Ishida M., Miura T. Subfractionation of protoplast membrane and enzyme localization in Bacillus megaterium. J. Biochem. 1966, 60 (3): 256-261.

18. Schnaitman C.A. Protein composition of the cell wall and cytoplasmic membrane of Escherichia coli . J. Bacteriol. 1970, 104 (2): 890-901.

19. Stumpe S., Schmid R., Stephens D. et al. Identification of OmpT as the protease that hydrolyses the antimicrobial peptide protamine before it enters growing cells of Escherichia coli. J. Bacteriol. 1998, 180 (15): 4002-4006.

20. Thomassin J.L., Brannon J.R., Gibbs B.F. et al. OmpT outer membrane proteases of enterohemorrhagic and enteropathogenic Escherichia coli contribute differently to the degradation of human LL-37. Infect. Immun. 2012, 80 (2): 483-492.

21. White C.B, Chen Q., Kenyon G.L. et al. A novel activity of OmpT. Proteolysis under extreme denaturing conditions. J. Biol. Chem. 1995, 270 (22): 12990-12994.

Поступила 19.06.12

Контактная информация: Козлов Станислав Николаевич,

664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78, р.т. (3952)22-01-38

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 Р.Н.Цепилов1, А.В.Белодед2, И.И.Самойленко1

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ STREPTOCOCCUS EQUI SUBSP. ZOOEPIDEMICUS - ПРОДУЦЕНТА ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, 2Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева, Москва

Цель. Селекция высокомукоидного морфотипа Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (Streptococcus zooepidemicus) и исследование его морфологических, физиологических, биохимических и технологических характеристик в части обеспечения повышенной секреции им гиалуроновой кислоты (ГК). Материалы и методы. Глубинное культивирование осущест-