Зимографическая детекция гидролаз Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп с использованием специфических субстратов

Козлов С.Н.; Марков Е.Ю.; Николаев В.Б.; Миронова Л.В.; Миткеева С.К.; Урбанович Л.Я.

18. Pat. 2495937C1. Rossijskaya Federaciya Sposob polucheniya takrolimusa metodom mikrobiologicheskogo sinteza [Method of obtaining of tacrolimus by microbiological synthesis method] Lobastova T. G., Gulevskaya S.A., Fokina V.V., SHutov A.A.; Nikolaeva V.M., Donova M.V. 02.04.2

DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2017.65.131 Козлов С.Н.1, Марков Е.Ю.2, Николаев В.Б.3, Миронова Л.В.4, Миткеева С.К.5, Урбанович Л.Я.6

Научный сотрудник, 2старший научный сотрудник, доктор биологических наук, 3старший научный сотрудник,

кандидат медицинских наук, 4ведущий научный сотрудник, кандидат медицинских наук, 5лаборант, 6старший

научный сотрудник, доктор медицинских наук, Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора ЗИМОГРАФИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ГИДРОЛАЗ VIBRIO CHOLERAE O1 И O139 СЕРОГРУПП С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕЦИФИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ

Аннотация

Цель работы. Зимографическая детекция гидролитических ферментов в субклеточных фракциях и супернатантах культуральной жидкости штаммов Vibrio cholerae О1 El Tor и V. cholerae О139 с использованием различных субстратов.

Материалы и методы. В работе исследовали препараты наружной мембраны, мочевинных экстрактов и супернатантов культуральной жидкости 16 штаммов V. cholerae El Tor О1 и О139 серогрупп разного происхождения. Гидролазы выявляли методом субстратного электрофореза в полиакриламидном геле и в реакции радиальной энзимодиффузии в агарозном геле с инкорпорированными растворимыми специфическими субстратами.

Результаты и выводы. В препаратах наружной мембраны, мочевинных экстрактов и супернатантов культуральной жидкости, полученных из большинства штаммов V. cholerae El Tor O1 и O139, зимографически выявлено наличие гидролаз, обладающих хитозаназной, липолитической, муциназной, лецитиназной, РНК-азной и протеазной активностью. Обнаружены количественные и качественные различия в спектре гидролаз и их активности у взятых в исследование препаратов. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования зимографических методов для определения наличия, изучения состава и свойств ферментов холерного вибриона.

Ключевые слова: Vibrio cholerae, зимография, гидролитические ферменты.

Kozlov S.N.1, Markov E.Yu.2, Nikolaev V.B.3, Mironova L.V.4, Mitkeeva S.K.5, Urbanovich L.Ya.6

Scientist researcher, 2Senior scientist researcher, PhD in Biology, 3Senior scientist researcher, MD, 4Leading researcher, MD,

5Laboratory assistant, 6Senior scientist researcher, MD, Irkutsk Antiplague Research Institute of Rospotrebnadzor WINTERGRAPHICAL DETECTION OF HYDROLYSIS VIBRIO CHOLERAE O1 AND O139 OF SEROGROUPS

USING SPECIFIC SUBSTRATES

Abstract

Objectives. Wintergraphical detection of hydrolytic enzymes in subcellular fractions and supernatants of the culture fluid of strains of Vibrio cholerae O1 El Tor and V. cholerae O139 with the use of various substrates.

Methods and materials. The samples of the outer membrane, urea extracts and supernatants of the culture liquid of 16 strains of V. cholerae El Tor O1 and O139 serogroups of different origin were studied. The hydrolases were detected by substrate electrophoresis in a polyacrylamide gel and in the radial enzymodiffusion reaction in an agarose gel with incorporated soluble specific substrates.

Results and conclusions. In the samples of the outer membrane, urea extracts and supernatants of the culture liquid, obtained from most strains of V. cholerae El Tor O1 and O139, the presence of hydrolases with chitosanase, lipolytic, mucinase, lecithinase, RNA-tic and protease activity was shown in zoomorphology. Quantitative and qualitative differences in the spectrum of hydrolases and their activity in the samples taken into the study were found. The obtained data indicate the prospects of using the wintergraphical methods for determining the presence, studying the composition and properties of the enzymes of the cholera vibrio.

Keywords: Vibrio cholerae, wintergraphics, hydrolytic enzymes.

Проблема холеры остаётся актуальной в связи с продолжающимся её пандемическим распространением. Это свидетельствует о необходимости всестороннего изучения возбудителя заболевания, включая особенности его энзимома (части протеома, обладающего ферментативной активностью). Большой интерес вызывают гидролитические ферменты микроорганизма, играющие роль в проявлении патогенности нехолерогенных вибрионов, и дополнительных факторов, усиливающих вирулентность холерного вибриона [4], [5], [10]. Установлено участие некоторых гидролаз, таких как нуклеазы и хитиназы, в выживании холерного вибриона в объектах окружающей среды (ООС) и формировании биоплёнки [8, 9]. Интерес к гидролазам, как возможным факторам патогенности возбудителя, обусловлен и тем, что выявленные ферменты могут быть использованы в качестве компонентов субъединичной вакцины против холеры [1], а также для создания антибактериальных противоферментных препаратов [11]. Однако к настоящему времени гидролитические ферменты холерного вибриона O1 и O139 серогрупп изучены далеко не полностью, в литературе данных о уставе, активности ферментов, их субстратной специфичности и межштаммовых

различиях вибрионов недостаточно. Исследование гидролаз будет способствовать пониманию роли ферментов в патогенезе заболевания.

Одним из наиболее информативных и высокочувствительных способов детекции гидролаз является метод диск-электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем различные белковые и небелковые субстраты, получивший название "зимография" [7]. Существенным преимуществом такого подхода с использованием прямой зимографии по сравнению с другими рутинными биохимическими методами является возможность определения спектра и субстратной специфичности гидролаз в сложных биологических смесях, а также их локализации в бактериальной клетке. Поэтому использование зимографического метода исследования для обнаружения и характеристики комплекса гидролитических ферментов холерного вибриона представляется весьма актуальным и перспективным.

С учётом изложенного цель работы - зимографическая детекция гидролитических ферментов штаммов V. cholerae О1 El Tor и V. cholerae О139 в отношении специфических субстратов.

Материалы и методы

В работе использовано 16 штаммов V. cholerae О1 El Tor и V. cholerae О139, полученных из музея живых культур Иркутского противочумного института, которые были разделены на две группы: первая группа - токсигенные штаммы, выделенные от больных и из ООС во время вспышки холеры, вторая группа - нетоксигенные штаммы, выделенные из ООС в благополучный по холере период. Для получения препаратов супернатанта культуральной жидкости (СКЖ) бактерии культивировали на щелочном МПА (pH 7,6) при 37 °С в течение 24 ч. Суточную культуру смывали физраствором и засевали во флаконы с МПБ (pH 7,6) в концентрации 2*108 м. к. /мл. После двухчасовой инкубации при комнатной температуре во флаконы для обеззараживания засеянной культуры холерного вибриона добавляли мертиолят натрия в концентрации 0,01 % и бактериальную суспензию выдерживали на холоду в течение двух суток. После контроля и подтверждения специфической стерильности суспензию центрифугировали при 10000 об/мин. Супернатант бесклеточной культуральной жидкости подвергали диализу и лиофильному высушиванию.

Специфически стерильные препараты субклеточных фракций: наружной мембраны (НМ) и мочевинного экстракта (МЭ) получали посредством лизиса живых клеток холерного вибриона 4,5 М раствором мочевины с последующим дифференциальным центрифугированием и лиофильным высушиванием супернатантов [3]. Выявление гидролаз в полученных препаратах проводили методом прямой зимографии в полиакриламидном геле и в тестах радиальной энзимодиффузии со специфическими субстратами, взятыми в конечной концентрации 0,1 % (вес/объем) по методу С. Heussen и E. Dowdle [6]. В качестве субстратов использовали коммерческие препараты желатина, муцина, гликольхитозана, дрожжевой РНК («Sigma-Aldrich»), из которых готовили маточные водные растворы каждого субстрата в 1 % концентрации для последующего введения расчётного количества субстрата в полиакриламидный гель (ПААГ). Тесты радиальной энзимодиффузии проводили в 1 % агарозном геле, используя вышеуказанные субстраты в конечной концентрации 0,5 % (вес/объём). О наличии гидролитической активности судили по образованию неокрашенных зон гидролиза на фоне окрашенного ПААГ в случае энзим-электрофореза и появлению прозрачных зон гидролиза на фоне мутного субстрата - в случае теста радиальной энзимодиффузии в агарозном геле. Наличие липолитических ферментов определяли методом электрофореза в 10 % ПААГ с его последующим постэлектрофоретическим переносом на пластину 1 % агарозного геля, содержащего в качестве субстрата 0,5 % Твин-20 или Тритон Х-305 и инкубацией гелей при 37 °С в течение 24 ч. О наличии активности фермента судили по образованию на агарозных репликах белых полос вследствие гидролиза субстрата. Анализ полученных зимограмм осуществляли, используя систему гель-документирования Gel-Doc XR+ и программу Image Lab 2.01 («Bio-Rad», США). Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с расчетом среднеарифметических величин и их средних ошибок [2].

Результаты

В результате проведённых исследований установлено (рис. 1, 2, 3, 4, 5), что субклеточные фракции (препараты НМ и МЭ), а также препараты СКЖ, полученные из большинства штаммов холерного вибриона Эль Тор и холерного вибриона O139 серогруппы, содержат гидролазы, обладающие хитозаназной, липолитической, лецитиназной, муциназной, РНК-азной и протеазной активностью.

Исследование хитозаназ. С применением зимографического метода показано, что в препаратах СКЖ токсигенного V. cholerae O1 биовара Эль Тор (И-1300) и четырёх нетоксигенных штаммов этого биовара (129-05-B, И-1368, И-638, И-680) обнаружено 8-9 полипептидов с хитозаназной активностью (рис 1А, Б треки 2, 3, 4, 7, 8). В препарате СКЖ токсигенного штамма V. cholerae O1 Эль Тор М-878 выявлено пять хитозаназ, располагающихся в высокомолекулярной и низкомолекулярной зонах электрофореграмм (рис. 1А, Б, трек 1). В препаратах СКЖ нетоксигенного V. cholerae O1 Эль Тор 2-01 и токсигенного V. cholerae O139 И-12 обнаружено по две хитозаназы. При этом в одном случае хитозаназная активность на зимограмме проявилась в низкомолекулярной зоне, а в другом - в высокомолекулярной (рис. 1А, треки 9 и 10; 1Б треки 9 и 10). СКЖ двух токсигенных V. cholerae O1 Эль Тор И-1334 и И-1263 показали слабую хитозаназную активность. У препаратов МЭ, полученных из взятых в исследование штаммов обнаружено от одного до пяти полипептидов с хитозаназной активностью, у препаратов НМ отмечается от одной до четырёх активных полипептидных полос, менее интенсивно гидролизующих субстрат. Важно отметить, что при окрашивании ПААГ раствором Кумасси R-250 хитозаназы выявляются хуже, тогда как при окрашивании флуоресцентным красителем Calcofluor white M2R обнаруживается по одной гидролазе, располагающейся в низкомолекулярной зоне (рис. 1А треки 5 и 6, Б треки 5 и 6), что свидетельствует о большей чувствительности этого красителя по сравнению с Кумасси R-250 в отношении хитинолитических ферментов.

Исследование липолитических ферментов. Анализ гелей после переноса при исследовании липолитической активности в субклеточных фракциях показал, что препарат МЭ токсигенного штамма V. cholerae Эль Тор O1 М-878 содержит шесть активных белков (рис. 1В, трек 1). В остальных препаратах субклеточных фракций, приготовленных из взятых в опыт штаммов, выявляется от одного до двух полипептидов с липолитической активностью. На некоторых треках, кроме чётко сформированных зон имеются диффузные зоны проявления гидролиза (рис. 1В, треки 7, 8, 9, 10),

а у препарата НМ токсигенного V. ско1егав Эль Тор И-1342 липолитическая активность проявляется только в следовых количествах (рис. 1В, трек 5).

Исследование муциназ. Выраженной муциназной активностью в субстратном электрофорезе с применением коммерческого муцина установлено, что наибольшей активностью обладают препараты СКЖ преимущественно токсигенных штаммов V. ско1егае O1 серогруппы (рис. 1Г, треки 1, 2, 3, 4). Лишь только у одного препарата СКЖ из нетоксигенного штамма V. ско1егае O139 И-16 было обнаружено 5 полипептидов с муциназной активностью (рис. 1Г,трек 9).

Рис. 1 - Энзим-электрофорез препаратов субклеточных фракций и культуральной жидкости штаммов V. cholerae

El Tor O1 и O139 серогрупп

А - детекция хитозаназной активности в 8 % ПААГ с использованием 0,1 % раствора гликольхитозана в качестве субстрата. V. cholerae El Tor O1: 1 - M-878 (ctx+); 2 - И-1300 (ctx+); 3 - 129-05-B (c/x); 4 - И-1368 (c/x); 5 - И-1334 (c/x+); 6 - И-1263 (ctx+); 7 - И-638 (ctx); 8 - И-680 (c/x); 9 - 2-01 (c/x"); V. cholerae O139: 10 - И-12 (ctx+). Окраска геля

0,1 % раствором Кумасси ярко-синим R-250 Б - детекция хитозаназной активности в 8 % ПААГ с использованием 0,1 % раствора гликольхитозана в качестве субстрата. V. cholerae El Tor O1: 1 - M-878 (ctx+); 2 - И-1300 (ctx+); 3 - 129-05-B (c/x); 4 - И-1368 (c/x-); 5 - И-1334 (c/x+); 6 - И-1263 (ctx+); 7 - И-638 (ctx"); 8 - И-680 (ctx"); 9 - 2-01 (c/x"); V. cholerae O139: 10 - И-12 (ctx+). Окраска геля

0,1 % раствором Calcofluor

В - детекция липолитической активности в препаратах НМ и МЭ холерного вибриона фракционированных в 13 % ПААГ после наложения на 1 % агарозный гель, содержащий в качестве субстрата раствор Тритона X-305. Штаммы V. cholerae O1 серогруппы: 1 - МЭ M-878 (ctx+); 2 - панкреатическая липаза; 3 - МЭ И-638 (ctx-); 4 - МЭ И-1263 (ctx+); 5 - НМ И-1342 (ctx+); 6 - МЭ И-1369 (ctx-); 7 - НМ И-1369 (ctx-); 8 - МЭ И-1298 (c/x+); 9 - НМ И-1298 (ctx+); штамм V.

cholerae O139 серогруппы: 10 - МЭ И-16 (ctx-) Г - муциназная активность препаратов СКЖ в 8 % ПААГ, импрегнированным 0,1 % раствором муцина. V. cholerae cholerae O1: 1 - 569B (ctx+); V. cholerae El Tor O1: 2 - И-1300 (ctx+); 3 - И-1263 (ctx+); 4 - И-563 (ctx+); 5 - И-1291 (cir); 6 - И-1296 (c/x); 7 - 2-01 (ctx-); 8 - И-1368 (ctx-); V. cholerae O139: 9 - И-16 (c/x); 10 - И-12 (ctx+). Окраска

0,1% раствором Кумасси R-250

Исследование лецитиназ. Показано, что препараты НМ взятых в исследование штаммов обладают фосфолипазной (лецитиназной) активностью. При этом активность более выражена у препаратов НМ, полученных из токсигенных штаммов холерного вибриона (рис. 2, треки 3, 5, 6). Наличие лецитиназной активности выявлено в препаратах ОКЖ у взятых в исследование трёх токсигенных изолятов холерного вибриона - V. ско1егае ско1егае 569B, V. ско1егае O1 Эль Тор И-563 и V. сНо1егае O139 И-11 (рис. 3, треки 1, 4, 9). Электрофоретический анализ СКЖ классического холерного вибриона показал наличие трёх высокомолекулярных полипептидов с лецитиназной активностью (рис. 3, трек 1). Отмечается схожесть электрофоретической картины у препаратов СКЖ холерного вибриона Эль Тор И-563 и холерного вибриона O139 серогруппы И-11, формирующих диффузную зону лецитиназной активности с двумя полипептидами с молекулярными массами, лежащими в диапазоне от 80 до 120 кДа (рис. 3, треки 4 и 9).

12 3 4 5 6789 10

Рис. 2 - Энзим-электрофорез препаратов субклеточных фракций штаммов V. cholerae eltor 01 и 0139 серогрупп в

8% ПААГ с 0,1% лецитином. Окраска 0,25% раствором Кумасси ярко-синим. V. cholerae eltor 01: 1 - МЭ М-878 (с/х+); 2 - НМ И-638 (с/х-); 3 - НМ И-1263 (с/х+); 4 - МЭ 129-05-В (с/х-); 5 - НМ И-1342 (с/х+); 6 - НМ М-800 (с/х+); 7 - МЭ И-1327 (с/х-); 8 - МЭ И-1407 (с/х-); V. Мете еПог 0139: 9 - МЭ И-12

(с/х+); 10 - НМ И-16 (с/х-)

1 23 4 56 789 10

Рис. 3 - Энзим-электрофорез препаратов культуральных фильтратов V. Ло1егае classicae, V. с^1егае 01 и 0139 серогрупп в 8% ПААГ с 0,1% лецитином в качестве субстрата. Окраска 0,25% раствором Кумасси Я-250.

V. Мете Мете 01: 1 - 569В (с/х+); V. Мете еПог 01: 2 - И-1300 (с/х+); 3 - И-1263 (с/х+); 4 - И-563 (с/х+); 5 - И-1296 (с/х-); 6 - И-1299 (с/х-); 7 - 2-01 (с/х-); 8 -И-1407 (с/х); V. Мете 0139: 9 - И-11 (с/х+); 10 - И-12 (с/х+)

Исследование РНК-аз. В отношении дрожжевой РНК гидролазной активностью обладают все препараты МЭ V. с^1ете, в отличие от препаратов НМ, что свидетельствует, о том, что РНК-азы являются растворимыми внутриклеточными ферментами. Отмечается, что РНК-азная активность препаратов МЭ всех токсигенных штаммов холерного вибриона (М-878, И-1342, 569В, V. Ло1егае 0139 И-12) заметно выше (проявление полос более чёткое и интенсивное) по сравнению с препаратами МЭ штаммов, не продуцирующих энтеротоксин (рис. 4, треки 1, 7, 8, 9).

Рис. 4 - Энзим-электрофорез препаратов МЭ V. cholerae O1 и V. cholerae O139 серогрупп в 8 % ПААГ с 0,1 % дрожжевой РНК. Окраска 0,1 % раствором толуидинового синего

V. cholerae El Tor Ol: 1 - M-878 (ctx+); 2 - 129-05-B (ctx-); 3 - И-1263 (ctx+); 4 - И-638 (ctx-); 5 - 2-01 (ctx-); 6 - И-1369 (ctx-); 7 - И-1342 (ctx+); V. cholerae cholerae Ol: 8 - 569B (ctx+); V. cholerae O139: 9 - И-12 (ctx+); 10 - И-16 (ctx-).

Исследование протеазной активности. Тест радиальной энзимодиффузии в агарозе с импрегнированным желатином показал, что все препараты СКЖ штаммов V. ско1егае 01 и 0139 серогрупп обладают протеазной активностью разной степени интенсивности. Установлено, что нетоксигенные штаммы отличаются большей протеолитической активностью, чем токсигенные. Так, например, размер зон гидролиза желатина у препаратов СКЖ, полученных из нетоксигенных штаммов составил в среднем (7,3±0,02) мм, (Р<0,05), (рис. 5, лунки 3, 4, 5, 9,10, 12). У препаратов, полученных из токсигенных штаммов он составил в среднем (2,6±0,03) мм (Р<0,05) (рис. 5, лунки 2, 6, 7, 8, 11).

Рис. 5 - КЕБ-тест препаратов культуральных фильтратов V. сИо1егае еНог 01 и V. сИо1егае 0139 серогрупп в 1% агарозном геле с использованием 0,5 % желатина в качестве субстрата.

1 - Положительный контроль - трипсин; 2 - М-878 (с/х+); 3 - 129-05-В (с/х); 4 - И-638 (с/х); 5 - И-680 (с/х); 6 -И-1263 (с/х+); 7 - И-1300 (с/х+); 8 - И-1334 (с/х+); 9 - И-1368 (с/х-); 10 - 2-01 (с/х); V. сНо1егае 0139: 11- И-12 (с/х+); 12

- 0139 И-16 (с/х)

Результаты количественного изучения гидролазной активности препаратов субклеточных фракций и препаратов СКЖ, полученных из штаммов V. ско1егае разного происхождения, представлены в таблице 1. По данным КЕБ-теста, препараты, полученные из токсигенных штаммов холерного вибриона, отличаются более высокой суммарной активностью ферментов (хитозаназной, липолитической, лецитиназной, РНКазной и др.) по сравнению с препаратами, полученными из нетоксигенных штаммов.

Таблица 1 - Гидролазная активность штаммов Vibrio cholerae 01 и O139 серогрупп разного происхождения

Штаммы V. cholerae Активность в ПААГ

Хитозаназная Липолитическая Лецитиназная Муциназная РНК-азная Протеазная

И-1300, 129-05-B, И-1368, И-638, И-680 ++++ ++ + ++ +++

М-878, 569B, И-563, И-1334, И-1263, 2-01, 0139 И-12, O139 И-16 + +++ ++ ++++ ++++ ++++

И-1342, И-1337, М-800, И-1298 ++ — ++++ — ++++ +

Активность в RED-тестах (мм), M±I95, n=3

(c/x): 129-05-B, И- 1368, И-638, И-680, 2-01, O139 И-16 3,0±0,03 2,5±0,03 1,0±0,03 1,0±0,03 7,3±0,02

(c/x+): М-878, 569B, И-1263, И-1300, И-1334, 0139 И-12 5,0±0,02 3,0±0,03 2,0±0,02 3,0±0,02 2,5±0,03 2,6±0,03

Примечание: +- величина, соответствующая зоне гидролиза минимум одного белка (одна полоса) в ПААГ; -отсутствие полосы гидролиза (активности); М-среднее значение зоны активности в КЕБ-тестах; 195- 95% доверительный интервал; п- число повторов определения образцов с материалом.

Обсуждение

Haличие хитинолитической активности в препаратах СКЖ указывает на секрецию хитозаназ холерными вибрионами. Сравнение хитозаназной активности препаратов субклеточных фракций из штаммов V. cholerae El Tor O1 M-878, И-1334, И-1263, 2-0l и V. cholerae Ol39 И-12 показало более высокую активность указанных ферментов токсигенных штаммов по сравнению с нетоксигенными.

Феномен формирования диффузных зон при изучении липолитической активности можно объяснить замедленной диффузией фермента в агарозный гель с субстратом или частичной его деградацией в процессе электрофореза или во время блоттинга. При сравнении реплик, полученных после переноса с ПAAГ, и исходного окрашенного геля, оказалось, что основной липолитической активностью обладают белки, молекулярная масса которых лежит в диапазоне от 3l до l00 кДа. Установлена значительная вариабельность липолитической активности в зависимости от используемого субстрата и токсигенности штаммов холерного вибриона. Более высокая способность препаратов MЭ, приготовленных из нетоксигенных штаммов вибриона Эль Тор Ol и из токсигенных штаммов холерного вибриона Ol39 серогруппы к гидролизу субстратов, содержащих короткоцепочечные жирные кислоты (Твин-20) может быть обусловлена преобладанием в препаратах указанных штаммов эстераз. Более высокая активность препаратов MЭ из токсигенных штаммов в отношении Тритона X-305, в состав которых входят длинноцепочечные жирные кислоты, можно связать с действием липаз. Обнаруженные различия в липолитической активности препаратов в отношении используемых субстратов отражают индивидуальные свойства взятых в исследование штаммов, и, по-видимому, связаны как с разным составом липолитических ферментов, удельной активностью полученных из них препаратов, так и чувствительностью к факторам внешней среды и в целом отражают интенсивность липидного обмена микробной клетки.

Обнаруженные закономерности в проявлении муциназной активности, заключающиеся в её определении преимущественно у токсигенных штаммов, могут свидетельствовать о существенном вкладе муколитических ферментов в патогенез холерной инфекции.

В целом обнаруженные в ходе проведённых экспериментов различия в степени гидролитической активности у препаратов, полученных из штаммов холерного вибриона разного происхождения, указывают на некоторые закономерности: в среднем гидролитическая активность нетоксигенных штаммов (хитозаназная) выше таковой токсигенных штаммов холерного вибриона, что говорит об их вкладе в адаптационно -приспособительный потенциал нетоксигенных изолятов, выделенных из ООС. Выявленная более высокая PHK-азная и липолитическая активность у препаратов из токсигенных штаммов может указывать на роль данных ферментов в вирулентности возбудителя. Отмеченная превосходящая суммарная гидролитическая активность препаратов СКЖ по сравнению с препаратами субклеточных фракций, говорит о повышенной активности секретируемых ферментов у взятых в исследование штаммов холерного вибриона.

Таким образом, в результате проведённого зимографического анализа с применением комплекса специфических субстратов, установлено наличие в полученных из штаммов V. cholerae Ol и Ol39 препаратов MЭ, HM и СКЖ хитозаназной, липолитической, лецитиназной, муциназной, PHK-азной и протеолитической активности. В ходе экспериментов с помощью прямой зимографии в ПAAГ удалось добиться стабильно воспроизводимых и сопоставимых результатов по детекции гидролаз, относящимся к разным классам и по их продукции в препаратах выявить межштаммовые отличия. Прослеживается также зависимость степени активности обнаруженных гидролаз в тестах радиальной энзимодиффузии от токсигенности исходных штаммов, что может быть использовано для дополнительной фенотипической характеристики штаммов в отношении их потенциальной эпидзначимости и персистентного потенциала. Штаммы-продуценты обнаруженных гидролаз в дальнейшем могут быть использованы для выделения и очистки этих ферментов в качестве протективных антигенов для конструирования субъединичной вакцины против холеры.

Список литературы I References

1. Лдамов A.K. Mетaболический иммунитет к холере / A.K. Лдамов - Саратов: Изд-во Саратовского университета., l982. - l76 с.

2. Лшмарин И.П., Воробьёв A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Aшмaрин, A.A. Воробьёв. - Л.: Mедгиз., l962. - l80 с.

3. Maрков Е.Ю. Шружные мембраны холерного вибриона как потенциальный компонент химической вакцины / Е.Ю. Maрков, Л.Я. Урбанович, Е.П. Голубинский [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1995. -Вып 2. (Приложение). - С. 86-89.

4. Finkelstein R.A. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease, colonial variation, virulence, and detachment / R.A. Finkelstein, M Boesman-Finkelstein, Y. Chang, [et al.] // Infect. Immun. - 1992. - Vol.60, N2. - P.472-478.

5. Galen J.E. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin / J.E. Galen, J.M. Ketley, A. Fasano [et al.] // Infect. Immun. - 1992. - Vol.60, N2. - P. 1358-1362.

6. Heussen C. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates / C. Heussen, E.B. Dowdle // Anal. Biochem. - 1980. - Vol.102, N1. - P. 196-202.

7. Lantz M.S. Zymographic techniques for detection and characterization of microbial proteases / M.S. Lantz, P. Ciborowski // Methods Enzymol. - 1994. - Vol.235. - P. 563-594.

8. Mondal M. The Vibrio cholerae extracellular chitinase ChiA2 is important for survival and pathogenesis in the host intestine / M. Mondal, D. Nag, H. Koley [et al.] // PLoS One. - 2014. - Vol. 9, N9. - P. e103119.

9. Seper A. Extracellular nucleases and extracellular DNA play important roles in Vibrio cholerae biofilm formation / A. Seper, V.H.I. Fengler, S. Roier [et al.] // Mol. Microbiol. - 2011. - Vol. 82, N4. - P. 1015-1037.

10. Shinoda S. Proteases produced by Vibrio cholerae and other pathogenic vibrios: pathogenic roles and expression / S. Shinoda - New York: Springer, 2011. - P. 245-258.

11. Zang P. Targeting druggable enzymome by exploiting natural medicines: An in silico-in vitro integrated approach to combating multidrug resistance in bacterial infection / P. Zang, A. Gong, P. Zhang [et al.] // Pharm. Biol. - 2016. - Vol.54, N4. - P. 604-618.

^исок литературы на английском языке / References in English

1. Adamov A.K. Metabolicheskii immunitet k cholere [Metabolic immunity to cholera] / A.K. Adamov - Saratov: Izdatelstvo Saratovskogo universiteta, 1982. - 176 p. [in Russian]

2. Ashmarin I.P. Statisticheskie metodi v mikrobiologicheskich issledovaniyach [Statistical methods in microbiological studies] / I.P. Ashmarin, A.A. Vorob'ev. - L.: MEDGIZ, 1962. - 180 p. [in Russian]

3. Markov E.Yu. Naruzhnie membrane cholernogo vibriona kak potencialnii component chimicheskoi vakcini [The outer membranes of Vibrio cholerae as a potential component in a chemical vaccine] / E. Yu. Markov, L.Ya. Urbanovich, E.P. Golubinsky [i dr.] // Zhurn. mikrobiol., epidemiol. i immunobiol [Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol.]. - 1995. - №2, (Prilozhenie) [Suppl]. P.86-89. [in Russian]