Научная статья на тему 'Система активации плазминогена у Vibrio cholerae'

Система активации плазминогена у Vibrio cholerae Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
74
14
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ПЛАЗМИН / PLASMIN / ПЛАЗМИНОГЕН / PLASMINOGEN / α-ЕНОЛАЗА / α-ENOLASE / ШТАММЫ / STRAINS / ВИБРИОНЫ / VIBRIOS / ОМПТИНЫ / ПОРИНЫ / PORINS / OMPTINS

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Мишанькин Б. Н., Дуванова О. В., Шипко Е. С., Романова Л. В., Водопьянов А. С.

Цель. Изучение системы активации плазминогена у Vibrio cholerae. Материалы и методы. В работе использовано 75 штаммов V. choleraе различного происхождения. Плазминоген выделяли из плазмы человека аффинной хроматографией на L-лизин сефарозе, α-енолазную активность определяли прямым методом, предполагающим превращение 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват. Для выделения мембранного белка OmpT вибрионы разрушали ультразвуковым дезинтегратором, не разрушенные клетки отбрасывали центрифугированием, а клеточный лизат центрифугировали 1 час при 105 000 g. Осадок солюбилизировали в буфере с 1% тритона Х-100 и пропускали через колонку с DE-52 целлюлозой. Результаты. Штаммы Vibrio cholerae O1 и O139, выделенные из клинических образцов и проб воды открытых водоемов, обладали способностью связывать с помощью α-енолазы и переводить плазминоген человека в плазмин под действием белка наружных мембран OmpT. Белок с молекулярной массой около 40 кДа обладал протеоли-тической активностью с широким спектром субстратной специфичности, расщеплял фибрин, жедатину, коллаген, протамин и активировал плазминоген. Компьютерный анализ показал, что OmpT белок холерного вибриона проявлял слабую степень родства с омптинами Enterobacteriaceae. Заключение. Проведенное исследование показало, что вибрионы обладают системой активации плазминогена, которая включает как минимум α-енолазу и мембранный белок OmpT. Предполагается, что белок OmpT принадлежит к новому классу поринов семейства Vibrionaceae и его ферментативная активность может играть существенную роль в патогенезе инфекции.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Мишанькин Б. Н., Дуванова О. В., Шипко Е. С., Романова Л. В., Водопьянов А. С.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

SYSTEM OF ACTIVATION OF PLASMINOGEN IN VIBRIO CHOLERAE

Aim. Study system of activation of plasminogen in Vibrio cholerae. Materials and methods. 75 strains of V. cholerae of various origins were used in the study. Plasminogen was isolated from human plasma by using affinity chromatography on L-lysine sepharose, α-enolase activity was determined by a direct method assuming transformation of 2-phosphoglycerate into phopshoenolpyruvate. Vibrios were destroyed by ultrasound disintegrator to isolate membrane OmpT protein, intact cells were discarded by centrifugation and cell lysate was centrifugated for 1 hour at 105000 g. The precipitate was solubilized in buffer with 1% triton X-100 and passed through a column with DE-52 cellulose. Results. Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated from clinical specimens and water samples from open water bodies had the ability to bind by using α-enolase and transform human plasminogen into plasmin under the effect ofouter membrane protein OmpT. A protein with molecular weight around 40 kDa had proteolytic activity with a wide specter of substrate specificity, degraded fibrin, gelatin, collagen, protamine and activated plasminogen. Computer analysis showed that OmpT protein of cholera vibrion had a low degree of relation with Enterobacteriaceae omptins. Conclusion. The study carried out showed that vibrios have a system of activation of plasminogen that includes at least α-enolase and OmpT membrane protein. OmpT protein is assumed to belong to a new class of porins of Vibrionaceae family and its enzymatic activity may play a significant role in pathogenesis of infection.

Текст научной работы на тему «Система активации плазминогена у Vibrio cholerae»

пептида связан с нарушением структурной организации клеточной стенки бактерий, в результате чего клетки становятся осмотически неустойчивыми. Атомно-силовая микроскопия зарекомендовала себя как адекватный поставленным задачам метод, позволяющий получать уникальную информацию, недоступную другим методам исследования.

Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-И-4-2052.

Л ИТЕРАТУРА

1. Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Filonov A.S. et al. Comparative studies of bacteria with an atomic force microscopy operating in different modes. Ultramicroscopy. 2001, 86 (1 — 2): 121-128.

2. Brogden K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat. Rev. Microbiol. 2005, 3 (3): 238-250.

3. Cheigh C.I., Pyun Y.R. Nisin biosynthesis and its properties. Biotechnol. Lett. 2005, 27 (21): 16411648.

4. Dorobantu L.S., Gray M.R. Application of atomic force microscopy in bacterial research. Scanning. 2010, 32 (2): 74-96.

5. Hancock R.E., Lehrer R. Cationic peptides: a new source of antibiotics. Trends Biotechnol. 1998, 16 (2): 82-88.

6. Hasper H.E., Kramer N.E., Smith J.L. et al. An alternative bactericidal mechanism of action for lantibioticpeptides that target lipid II. Science. 2006, 313 (5793): 1636-1637.

7. Hertz H. Über die Berührung fester elastischer Köroper (On the contact of elastic solids). Journal für die reine und angewandte Mathematik. 1881, 92: 156-171.

8. Hurst A. Nisin. Adv. Appl. Microbiol. 1981, 27: 85-123.

9. Jenssen H., Hamill P., Hancock R.E. Peptide antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Rev. 2006, 19 (3): 491-511.

10. Kaur G., Malik R.K., Mishra S.K. et al. Nisin and class IIa bacteriocin resistance among Listeria and other foodborne pathogens and spoilage bacteria. Microb. Drug. Resist. 2011, 17 (2): 197205.

11. Mangoni M.L., Papo N., Barra D. et al. Effects of the antimicrobial peptide temporin L on cell morphology, membrane permeability and viability of Escherichia coli. Biochem. J. 2004, 380 (Pt 3): 859-865.

12. Meincken M., Holroyd D.L., Rautenbach M. Atomic force microscopy study of the effect of antimicrobial peptides on the cell envelope of Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49 (10): 4085-4092.

13. Tong Z., Zhou L., Li J. et al. In vitro evaluation of the antibacterial activities of MTAD in combination with nisin against Enterococcus faecalis. J. Endod. 2011, 37 (8): 1116-1120.

Поступила 12.02.13

Контактная информация: Валышев Александр Владимирович, к.м.н., 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-86-97

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

Б.Н.Мишанькин, О.В.Дуванова, Е.С.Шипко, Л.В.Романова, А.С.Водопьянов, А.К.Ерибекян, М.В.Шишияну, Л.К.Лысова, С.О.Водопьянов

СИСТЕМА АКТИВАЦИИ ПЛАЗМИНОГЕНА У VIBRIO CHOLERAE

Ростовский-на-Дону противочумный институт

Цель. Изучение системы активации плазминогена у Vibrio cholerae. Материалы и методы. В работе использовано 75 штаммов V. ^о1егае различного происхождения. Плазминоген выделяли из плазмы человека аффинной хроматографией на L-лизин сефа-розе, а-енолазную активность определяли прямым методом, предполагающим превращение 2-фосфоглицерата в фосфоенолпируват. Для выделения мембранного белка OmpT вибрионы разрушали ультразвуковым дезинтегратором, не разрушенные клетки отбрасывали центрифугированием, а клеточный лизат центрифугировали 1 час при 105 000 g.

Осадок солюбилизировали в буфере с 1% тритона Х-100 и пропускали через колонку с DE-52 целлюлозой. Результаты. Штаммы Vibrio cholerae O1 и O139, выделенные из клинических образцов и проб воды открытых водоемов, обладали способностью связывать с помощью а-енолазы и переводить плазминоген человека в плазмин под действием белка наружных мембран OmpT. Белок с молекулярной массой около 40 кДа обладал протеоли-тической активностью с широким спектром субстратной специфичности, расщеплял фибрин, жедатину, коллаген, протамин и активировал плазминоген. Компьютерный анализ показал, что OmpT белок холерного вибриона проявлял слабую степень родства с омптинами Enterobacteriaceae. Заключение. Проведенное исследование показало, что вибрионы обладают системой активации плазминогена, которая включает как минимум а-енолазу и мембранный белок OmpT. Предполагается, что белок OmpT принадлежит к новому классу поринов семейства Vibrionaceae и его ферментативная активность может играть существенную роль в патогенезе инфекции.

Журн. микробиол., 2013, № 5, С. 13—20

Ключевые слова: плазмин, плазминоген, а-енолаза, штаммы, вибрионы, омптины, по-рины

B.N.Mishankin, O.V.Duvanova, E.S.Shipko, L.V.Romanova, A.S.Vodopianov, A.K.Eribekyan, M.V.Shishiyanu, L.K.Lysova, S.O.Vodopianov

SYSTEM OF ACTIVATION OF PLASMINOGEN IN VIBRIO CHOLERAE

Rostov-on-Don Institute of Plague Control, Russia

Aim. Study system of activation of plasminogen in Vibrio cholerae. Materials and methods. 75 strains of V. cholerae of various origins were used in the study. Plasminogen was isolated from human plasma by using affinity chromatography on L-lysine sepharose, а-enolase activity was determined by a direct method assuming transformation of 2-phosphoglycerate into phopshoe-nolpyruvate. Vibrios were destroyed by ultrasound disintegrator to isolate membrane OmpT protein, intact cells were discarded by centrifugation and cell lysate was centrifugated for 1 hour at 105000 g. The precipitate was solubilized in buffer with 1% triton X-100 and passed through a column with DE-52 cellulose. Results. Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated from clinical specimens and water samples from open water bodies had the ability to bind by using а-enolase and transform human plasminogen into plasmin under the effect ofouter membrane protein OmpT. A protein with molecular weight around 40 kDa had proteolytic activity with a wide specter of substrate specificity, degraded fibrin, gelatin, collagen, protamine and activated plasminogen. Computer analysis showed that OmpT protein of cholera vibrion had a low degree of relation with Enterobacteriaceae omptins. Conclusion. The study carried out showed that vibrios have a system of activation of plasminogen that includes at least а-enolase and OmpT membrane protein. OmpT protein is assumed to belong to a new class of porins of Vibrionaceae family and its enzymatic activity may play a significant role in pathogenesis of infection.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 5, P. 13—20

Key words: plasmin, plasminogen, а-enolase, strains, vibrios, omptins, porins

ВВЕДЕНИЕ

Способность активировать плазминоген — распространенное явление среди бактерий. Оно описано у многих патогенов, а также у обитателей желудочно-кишечного тракта (лактобациллы, бифидобактерии, кишечная палочка) [7, 18]. Плазминоген

— гликопротеин с мол. массой 92 кДа присутствует повсеместно (кровь, тонкий кишечник, интерстициальные жидкости) в организме млекопитающих в достаточно высоких количествах (180 — 200 мкг/мл) [19]. Это — зимоген, превращающийся в свою активную форму (плазмин) в результате точечного гидролиза пептидной связи

— 561А^ — Val562 — под действием урокиназы или тканевых активаторов, а также про-

теаз микроорганизмов, входящих в семейство омптинов. Плазмин — трипсиноподоб-ная сериновая протеаза с широким спектром субстратной специфичности, участвующая в неконтролируемом фибринолизе, гомеостазе, разрушении внеклеточного матрикса и базальных мембран, способствующая усилению миграции бактерий через поврежденные тканевые барьеры хозяина [6, 11, 12].

Омптины Pla Yersinia pestis, OmpT Escherichia coli, PgtE Salmonella enterica и др. атакуют врожденные защитные системы макроорганизма, разрушая катионактивные белки (дефенсины, протамины), белки комплемента, активируют плазминоген, усиливают адгезивность и инвазивность бактерий [12]. Активация плазминогена происходит после его связывания на поверхности клетки бактерии со специфическими рецепторами, из которых наиболее изучена а-енолаза (2-фосфо^-глицерат гидролиаза) — широко распространенный в природе белок, катализирующий обратимое превращение 2- фосфо^-глицерата в 2-фосфоенолпируват. Соединение плазминогена с а-енолазой осуществляется через его лизин-связывающие krinkle-домены, что ведет к изменению конформации молекулы и последующему повышению чувствительности к активации. Помимо отдельных остатков лизина в составе а-енолаз обнаружены последовательности из девяти аминокислотных остатков, участвующие во взаимодействии фермента с плазминогеном [6, 17].

Сведений о системе активатор плазминогена/плазмин у холерного вибриона в доступной литературе встретить не удалось. Между тем, экспериментальная септическая модель холеры у мышей, обусловленная внутрибрюшинным введением вибрионов, активно используется для изучения эффективности антибактериальных препаратов [4]. Показана не связанная с наличием гена vct способность к диссеминации во внутренние органы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп при внутрижелудочном заражении кроликов-сосунков [3], описаны случаи выделения вибрионов из крови людей [10], обсуждается возможность опосредованной М-клетками пейеровых бляшек тонкого кишечника транслокация Vibrio cholerae через слизистую как важный этап в инициации секреторного иммунного ответа [14]. Все это свидетельствует в пользу существования у холерных вибрионов структур, способствующих распространению возбудителя в организме хозяина.

Цель исследования — поиск и изучение аналога системы активатор плазминогена/ плазмин у вибрионов О1 и О139 сероваров, что могло бы способствовать углублению и уточнению наших представлений как об особенностях биологии вибрионов, так и о патогенезе инфекции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использовали 75 штаммов Vibrio cholerae О1 и О139 серогрупп различного происхождения из музея живых культур РПЧИ. Гены белков наружных мембран OmpT и OmpU V. choleraе, а также ген активатора плазминогена (pla) Y. pestis тестировали в ПЦР согласно [13, 16]. В работе использовали также штаммы E. coli QD5003 и E. coli QD5003pRD-13 (с геном pla из Y. pestis) [3].

Препараты плазминогена выделяли из порций плазмы крови человека, полученных со станции переливания крови Ростова-на-Дону, с помощью аффинной хроматографии на L-лизин-сефарозе 4В (Pharmacia, Швеция), как описано в [9].

Активность а-енолазы определяли спектрофотометрически[15]. Активацию плазминогена клетками холерных вибрионов изучали по методу [5]. При использовании хромогенного субстрата n-нитроанилид For-Ala-Phe-Lys-pNa.Hbr (НПО Ренам, Россия) о результатах реакции судили по данным спектрофотометрии (модель DU 730 Beckman Coulter) при 405 нм по отщепившемуся pNa. Активность выражали в цифрах экстинкции ДА405 = ti — t0 за определенный отрезок времени, из которых вычитали экстинкцию контрольных проб [7, 11].

Выделение препаратов наружных мембран осуществляли из вибрионов 18-часовых агаровых (агар Мартена, рН 7,6) культур штамма V. cholerae eltor 18950 OmpT ДOmpU

после смыва физиологическим раствором с 0,01% мертиолата и 1,5-часовой инкубации при комнатной температуре. Клетки осаждали центрифугированием на холоде при 6000 об./мин. и разрушали с помощью УЗ-дезинтегратора модели Bandelin SONOPULS HD 3200 (стержень КЕ-76, 10 циклов по 20 сек на холоду с 1-минутными интервалами) или механическим растиранием с песком. После удаления детрита лизаты центрифугировали при 105 000 g 1 час при 4°C в роторе Sorvall AH627 (центрифуга Beckman L5-50B). Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок солюбилизи-ровали физиологическим раствором с 1% тритона Х-100 (Serva) при комнатной температуре в течение ночи с последующим концентрированием в 2 — 4 раза ультрафильтрацией в системе Amicon (камера 10 РА, мембрана РМ 30).

Очистку белка OmpT проводили с помощью хроматографии отдиализованного препарата мембранных белков на колонке с целлюлозой ДЕ — 52 (15х1 см) (Whatman, Англия), уравновешанной 20 мМ трис-HCl буфером рН 8,0 с 0,1 % тритона Х-100. Элюцию белков осуществляли ступенчатым градиентом NaCl 0 — 0,1 М в том же буфере. Фракции собирали по 10 мл и проверяли на ферментативную активность, используя в качестве субстрата протаминсульфат. Белок определяли по Лоури спек-трофотометрией при 280 нм или флуорометрически с использованием набора реактивов и флуориметра Qubit™ фирмы Invitrogen (США).

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

Все исследованные штаммы вибрионов обладали а-енолазной активностью, которая четко выявлялась как у целых клеток обоих сероваров (9,2 — 32,5 мкг ФЕП/109 м.к.), так и в цитоплазме (65 мкг/мг), а также во фракции наружных мембран (129 — 231 мкг/мг белка), полученных в результате дифференциального центрифугирования.

Условия выращивания (среды, температура) и индивидуальные особенности штаммов вибрионов влияли на уровень активности а-енолазы: клетки, выращенные на агаре Мартена при 28°С, согласно [1], с вероятностью 95 — 97,5% обладали более высокой активностью по сравнению с клетками, выращенными при 37°С (табл. 1). Таким образом, у V.cholerae O1 и О139 сероваров обнаружена активность а-енолазы, которая наряду с другими структурными элементами клетки (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, нейраминидаза, жгутики, фимбрии и т.д.) может играть роль рецептора для плазминогена человека [15].

Согласно информации о а-енолазе V. cholerae O1 biovar El Tor str. No. 16961

(GenBank, № AAF 95589), кодирующий ее ген VC 2447 находится на первой (главной) хромосоме, обеспечивая образование продукта в 433 аминокислотных остатка, среди которых 33, или 7,6%, приходятся на лизин и лишь один — на цистеин. Последнее указывает на отсутствие в составе молекулы SH-групп и дисульфид-ных связей, что должно сопровождаться нечувствительностью фермента к блока-торам SH-групп и неучастием дисульфид-ных связей в формировании его вторичной и третичной структур. Молекулярная масса — 45,7 кДа. В составе молекулы удалось идентифицировать последовательность 252FYDAEKKEY260, аналогичную плазминоген-связывающему участку Aeromonas hydrophila [17], что свидетельствует о принципиальной возможности

Таблица 1. Влияние температуры культивирования на активность а-енолазы холерного вибриона

Штаммы Серовар, происхождение Активность енолазы, мкг ФЭП/109/ч

28°С 37°С

16488 О139, человек 26,46 8,09

16074 О139, человек 32,50 17,90

16487 О139, человек 31,51 4,92

16485 О139, человек 17,40 0,80

16484 О139, человек 32,5 17,90

17786 О139, вода 47,26 41,92

17673 О139, вода 35,04 23,86

17780 О139, вода 49,34 23,94

17793 О139, вода 70,81 24,03

569 В О1 25,30 12,96

5879 О1 30,86 16,65

14172 О1, вода 22,69 3,57

Штаммы Серовар, происхождение, ОП405, AA405=t1-t0

14280 AompT О1, вода 0

14172 AompT О1, вода 0

18950 ompT+AompU О1, вода 0,146; 0,174

17572 AompT О1, вода 0

18774 AompT О1, вода 0

18948 AompT О1 0,018

5879 ompT+ О1 0,022

569B ompT+ О1 0,028

18779 AompT О1, вода 0,072

17259 ompT+ О139, человек 0,153

16072 ompT+ О139, человек 0,030

17781 AompT О139, вода 0

17907 AompT О139, вода 0

17793 AompT О139, вода 0

17625 AompT О139, вода 0

17792 AompT О139, вода 0

а-енолазы V. cholerae взаимодействовать Таблица 2. Способность клеток штаммов хо-

с плазминогеном. леРных вибРионов активировать

„ _ „ сорбировавшимся на них плазми-

Изучение способности суспензий ноген человека

клеток штаммов холерных вибрионов 0139 и О1 сероваров адсорбировать и активировать на своей поверхности плаз-миноген человека проводили по реакции с плазмин-специфичным хромогенным субстратом n-нитроанилид трипептида For-Ala- Phe- Lys-pNa.HBr. Исследование показало, что вибрионы обладают способностью сорбировать на себя и активировать плазминоген человека (табл. 2). Однако это свойство превращать плаз-миноген в плазмин регистрировали только у штаммов с неповрежденным геном ompT.

Адекватно вели себя и контрольные штаммы кишечной палочки, демонстрируя активность своей OmpT-протеазы в отношении плазминогена у исходного штамма E. coli QD5oo3 (9,22 мкг аргинина/109 м.к. и ДА405 = 0,3 7 9) и его варианта

с плазмидой pRD-13, несущей ген pla из возбудителя чумы (19,83 мкг аргинина/109 м.к. и ДА405 = 0,569). Почти 2-кратное увеличение активности в последнем случае объясняется суммирующим действием двух известных омптинов (OmpT E.coli и pla Y. pestis).

Так как омптины близки по своей структуре и свойствам, все они расщепляют пептидные субстраты типа плазминогена и катионактивных белков [11], в связи с чем

во время поиска активатора плазминоге-на у вибрионов по аналогии с изучением OmpT E. coli [18] мы использовали в качестве субстрата протаминсульфат. Оказалось, что инкубация суспензий большинства штаммов вибрионов 01 и 0139 серогрупп с плазминогеном резко повышала его протеолитическую способность в результате перехода из неактивного состояния в активное (плазмин) (20 — 78 мкг аргинина/109 м.к.). Исключение составляли шесть выделенных из воды и лишенных, по данным ПЦР, гена ompT штаммов 0139 серовара, у которых активности не отмечалось. Данные подтверждались и при использовании плаз-мин-специфического хромогенного субстрата, который активно гидролизовался клиническими штаммами вибрионов (ДА405 =0,146-0,194).

Высокая плазминоген-активирующая способность (ДА405 = 0,928) была обнаружена в препаратах наружных мембран из клеток штамма V. с^!егае eltor 18950

Рис. 1. Хроматография препарата белка OmpT штамма V. cholerae О1 18950 на колонке целлюлозы DE-52.

Стрелками отмечена ступенчатая элюция белка 0,07 — 0,1 М растворами NaCl. Сплошная линия — оптическая плотность при 280 нм, прерывистая — активность OmpT белка.

2. ЖМЭИ 5 № 5186

17

ОтрТ Д Отри после их осаждения при 105000 g и солюбилизации белков 1% тритоном Х-100, что позволило предположить ответственность одного из мембранных белков за этот процесс.

Удельная активность фракции, полученной при элюции мембранных белков 0,09 М №С1, составила 933,3 мкг Арг/ мг белка, что практически в 4 раза выше активности препарата до его нанесения на колонку (242,5 мкг Арг/мг белка) (рис. 1), и согласно [30] относилась к порино-вому белку ОтрТ. При электрофорезе в 10% ПААГ- SDS препарат мембранного белка ОтрТ штамма V еИо1егае еког 18950 был представлен одной полосой с молекулярной массой около 40 кДа (рис. 2).

Протеолитическая активность ОтрТ белка проявляла неодинаковую чувствительность к различным веществам (табл. 3). Наибольшее ингибирующее действие было отмечено у е-аминокапроновой кислоты из-за блока аминокислоты ли-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Рис. 2. Результаты электрофоретического разделения в 10 % ПААГ-SDS препарата очищенного OmpT белка (лунка 1) V. cholerae 18950.

В лунке 2 — маркеры мол. веса в кДа.

Таблица 3.Влияние веществ различной химической природы на активность ОmpT протеазы холерного вибриона

зина, а также у мочевины и додецилсуль-фата натрия — из-за их денатурирующего действия. Белок был чувствителен к фенил-метилсульфонилфлуориду, но слабо реагировал на присутствие дитиотреитола, ЭДТА, р-хлормеркуриобензоата, ингибировался солями Zn2+ и Cu2+, что сближает его с сери-новыми протеазами. Прогревание при 60°С в течение 15 мин приводило к снижению активности на 90%. Оптимум рН действия приходился на 7,6.

По данным GenBank, продукт гена VC1854 белок OmpT холерного вибриона состоит из 344 аминокислотных остатков. Дополнительно мы нашли, что он несет два сайта гли-козилирования (Asn62 и Asn66 ) и 23 остатка лизина, не содержит в своем составе цистеин и проявляет всего 11 % идентичности и столько же сходства с омптинами из энтеробактерий (кишечная палочка, возбудитель чумы и сальмонелла). Он наделен протеолитической активностью, активировал плазминоген человека, расщеплял фибрин, протамин, желатину, казеин молока и коллаген, но не плазмин-специфичный пептидный хромогенный субстрат n-нитроанилид три-пептида For-Ala- Phe- Lys-pNa.HBr (инкубация 20 мкг белка OmpT в течение 24 часов давала ОП504=0,004—0,054).

Белок OmpT проявил свою антигенность при подкожной иммунизации кроликов. Антитела к белку OmpT обладали нейтрализующим действием, но не агглютинировали в развернутой реакции целые клетки V cholerae eltor 5879 и V cholerae O139 16064 (клинический вариант). Они также не взаимодействовали в реакции преципитации с лизатами штаммов кишечной палочки (E. coli

Реагенты Концентрация Относительная активность, %

Контроль _ 100

ЭДТА 1 mM 73,0

Мочевина 8 М 14,8

Азид Na 2 mM 110,0

CuSO4 5 mM 22,0

CaCl2 5 mM 96,3

SDS 2 mM 14,0

FeCl3 5 mM 155,8

ZnSO4 5 mM 89,6

MnCl2 5 mM 133,8

MgSO4 5 mM 141,0

е-амино- 20 mM 8,0

капроновая

кислота

Дитиотреитол 1 mM 128,2

ФМСФ 1 mM 17,6

Примечание.В качестве субстрата использовали протаминсульфат.

HB101, HB101pRD 39, QD5003 , QD5003pRD 13) и возбудителя чумы (Y pestis EV, EVpRD —39, 556/106 Otten, 2357 Tru, 2356 Java, ЖВ-R), видимо, из-за невысокой степени идентичности/сходства их аминокислотного состава. Из представителей рода Vibrio только V. choleraе choleraе, V. choleraе eltor и V choleraе O139 реагировали с антисывороткой к белку OmpT из холерного вибриона. Лизаты штаммов V. mimicus, V para-haemolyticus и V alginolyticus такой способностью не обладали.

Кластерный анализ поринов, осуществленный построением дендрограммы с учетом полиморфизма состояния аминокислотной последовательности структуры белков OmpT небольшой выборки бактерий из GenBank с использованием алгоритма Clustal W и программного обеспечения Vector, позволил разделить их на три группы, одну из которых составили V cholerae, V furnissii и V. mechnikovii, другую — омптины энтеробактерий (Y pestis, E. coli, S. enterica) и V. parahaemolyticus и третью — V vulnificus. Если принять во внимание еще и отрицательный результат указанных вибрионов в ПЦР с праймерами к гену ompT холерного вибриона, то гетерогенность представителей рода Vibrio становится очевидной.

ОБСУЖДЕНИЕ

Функции белка OmpT в биологии холерного вибриона до конца не выяснены. Кроме защиты от антимикробных белков и активации плазминогена, обеспечивающих известное преимущество вибрионам в условиях кишечника чувствительного хозяина, увеличение синтеза OmpT в присутствии высоких концентраций NaCl и пониженной (28°С) температуре позволяет предположить его участие в выживаемости V. cholerae во внешней среде. В составе пузырьков наружных мембран он может способствовать распространению факторов вирулентности в организме инфицированного хозяина. Учитывая известные на сегодня свойства белка OmpT наружных мембран холерного вибриона, в том числе результаты компьютерного анализа, его можно отнести к ом-птинам семейства Vibrionaceae, число которых будет увеличиваться по мере изучения представителей других патогенных для человека видов.

Таким образом, у холерного вибриона обнаружена система активации плазминогена в плазмин, включающая, как минимум, температурозависимую а-енолазу и мембранный белок OmpT, которая, на наш взгляд, усиливает патогенетические возможности возбудителя за счет увеличения его деструктивного потенциала, направленного против врожденных защитных сил чувствительного хозяина.

Л ИТЕРАТУРА

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962.

2. Миронова А.В., Меньшикова Е.А. Инвазивность токсигенных и нетоксигенных холерных вибрионов различных серогрупп. Журн. микробиол. 2002, 3: 58-60.

3. Мишанькин Б.Н., Гончаров Е.К., Марченков В.И. и др. Молекулярное клонирование плаз-миды Yersinia pestis, детерминирующей синтез пестицина, белка иммунности, фибриноли-зина и коагулазы. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1984, 10: 12-16.

4. Рыжко И.В., Цураева Р.И., Ломов Ю.М. и др. Результаты оценки активности антибактериальных препаратов in vitro и in vivo эпидемически значимых штаммов холерного вибриона биотипа эльтор. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000, 3: 21-25.

5. Шипко Е.С., Мишанькин Б.Н., Дуванова О.В. и др. Плазминоген-активирующая способность холерного вибриона и участие мембранного белка OmpT в этом процессе. Защита населения и среда обитания. 2012, 4: 17-19.

6. Bergmann S., Wild D., Dickmann O. et al. Identification of a novel plasmin(ogen) — binding motif in surface displayed а-enolase of Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 2003, 40: 411-423.

7. Candela M., Miccoli G., Bergmann S. et al. Plasminogen — dependent proteolytic activity in Bifidobacterium lactis. Microbiology. 2008, 153: 2457-2462.

8. Chakrabarti S.R., Chaudhuri K., Sen K. et al. Porins of Vibrio cholerae: purification and characterization of OmpU. J. Bacteriol. 1996, 178 (2): 534-538.

9. Deutsch D.G., Mertz E.T. Plasminogen: purification from human plasma by affinity chromatography. Science. 1970, 170: 1095-1096.

10. Gordon M.A., Walsh A.L., Rogerson S.R.K. et al. Three cases of bacteremia caused by Vibrio cholerae O1 in Blantyre, Malawi. Emerg. Infect. Diseases. 2001, 7 (6): 1059-1061.

11. Haiko J., Suomalainen M., Ojala T. et al. Invited review: Breaking barrier — attack on innate immune defences by omptin surface proteases of enterobacterial pathogens. Innate Immun. 2009, 15 (2): 67-80.

12. Lahteenmaki K., Edelman S., Korhonen T.K. Bacterial metastasis: the host plasminogen system in bacterial invasion. Trends in Microbiology. 2005, 13 (2): 79-85.

13. Merrell D.S., Bailey C., Kaper J.B. et al. The ToxR-mediated organic acid tolerance response of Vibrio cholerae requires OmpU. J. Bacteriol. 2001, 183 (9): 2746-2754.

14. Neutra M.R., Frey A., Kraehenbuhl J.P. Epithelial M-cells: gateways for mucosal infection and immunization. Cell. 1996, 86: 345 — 348.

15. Pancholi V, Fischetti V. Alpha-enolase, a novel strong plasmin(ogen) binding protein on the surface of pathogenic streptococci. J. Biol. Chem. 1998, 273 (23): 14503-14515.

16. Pouillot F., Derbise A., Kukkonen M. et al. Evaluation of O-antigen inactivation on Pla activity and virulence ofYersinia pseudotuberculosis harbouring the pPla plasmid. Microbiology. 2005, 151: 3759-3768.

17. Sha J., Erova T.E., Alyea R.A. et al. Surface-expressed enolase contributes to the pathogenesis of clinical isolate SSU of Aeromonas hydrophila. J. Bacteriol. 2009, 191 (9): 3095-3107.

18. Stumpe S., Schmid R., Stefens D.L. et al. Identification of OmpT as the protease that hydrolyzes the antimicrobial peptide protamine before it enters growing cells of E. coli. J. Bacteriol. 1998, 180: 4002-4006.

19. Zhang L., Seiffert D., Fowler B.J. et al. Plasminogen has a broad extrahepatic distribution. Tromb. Haemost. 2002, 87 (3): 493-501.

Поступила 12.02.13

Контактная информация: Мишанькин Б.Н.,

344002, Ростов-на-Дону, ул. Максима Горького, 117/40, р.т. (863)240-22-66

МОЛЕКУЛЯРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

А.А.Вязовая1, Н.С.Соловьева2, В.Ю.Журавлев2, И.В.Мокроусов1, О.А.Маничева2, Б.И.Вишневский2, О.В.Нарвская1

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗНЫМ СПОНДИЛИТОМ

1Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, 2Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии

Цель. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов M. tuberculosis, выделенных из операционного материала больных туберкулезным спондилитом. Материалы и методы. 107 штаммов M. tuberculosis, выделенных в 2007 — 2011 гг. от больных туберкулезом позвоночника, исследовали методами сполиготипирования и MIRU-VNTR типирования по 12 и 24 локусам. Результаты. Доминировали штаммы (n=80) генетического семейства Beijing, из них 78% обладали множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Также обнаружены штаммы генетических семейств: T, H3 (Ural), LAM, Manu, Н4 и S. Дифференцирование 80 штаммов генотипа Beijing методом МЖи-VNTR по 24 локусам выявило 24 варианта (HGI=0,83), включая 7 кластеров, наиболее крупный из которых 100-32 включал 23 штамма (87% — МЛУ). Заключение. Показана ведущая роль штаммов M. tuberculosis генотипа Beijing в развитии туберкулезного спондилита с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.