CC BY-ND
22
апрель №4 (229)
17
ПЛАЗМИНОГЕН-АКТИВИРУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА И УЧАСТИЕ МЕМБРАННОГО БЕЛКА OmpT В ЭТОМ ПРОЦЕССЕ
Е.С. Шипко, Б.Н. Мишанькин, О.В. Дуванова, Л.В. Романова, А.К. Ерибекян
VIBRIO CHOLERAE PLASMINOGEN-ACTIVATING POSSIBILITY AND INVOLVEMENT OF OUTER MEMRANE PROTEIN OmpT IN THIS CASE
E.S. Shipko, B.N. Mishankin, O.V. Duvanova, L.V. Romanova, A.K. Eribekjan
ФКУЗ Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Ростпотребнадзора, г. Ростов-на-Дону
Показано, что штаммы Vibrio cholerae О1 и О139 способны активировать плазминоген человека в условиях in vitro. В активации принимал участие белок наружных мембран OmpT, который был выделен и очищен с помощью дифференциального центрифугирования и хроматографии на колонке с целлюлозой DE-52. Белок OmpT обладал протеолитической активностью с широкой субстратной специфичностью, расщеплял фибрин, желатин, коллаген, протамин и активировал плазминоген. Предполагается, что ферментативная активность образовавшегося плазмина усиливает патогенетические возможности холерного вибриона.
Ключевые слова: плазминоген, плазмин, протамин, мембранный белок.
It was shown that Vibrio cholerae O1 and O139 strains were capable to activate of human plasminogen in vitro. The activation was mediated by outer membrane protein OmpT, which was isolated and purified by differential centrifugation and chromatographgy on column with DE-52 cellulose. OmpT protein obtained proteolytic activity with broad substrate specificity, degraded fibrin, gelatin, collagen, protamin and activated plasminogen. It is suggested that enzymatic activity of plasmin enhanced pathogenic possibility of cholera vibrios.
Keywords: vibrios, plasminogen, plasmin, protamin, membrane protein.
Холера до сих пор представляет угрозу для общественного здравоохранения многих стран мира. Ее этиологический агент — холерный вибрион — уникален по своей способности вызывать мировые пандемии среди диареегенных патогенов бактериальной природы. Он существует в свободноживу-щем состоянии, но способен колонизировать тонкий кишечник человека и высвобождать холерный токсин, приводящий к потенциально смертельной секреторной диарее в случае отсутствия надлежащего лечения. Эти две формы — водное окружение и кишечник человека — и составляют суть его жиз-
ненного цикла. Во время пребывания в желудочно-кишечном тракте, благодаря координированной экспрессии генов, он преодолевает врожденные защитные силы чувствительного хозяина (кислый рН желудка, желчь, катионактивные белки и др.). Немалую роль здесь играют и регулируемые геном toxR белки внешней мембраны OmpUи OmpT, синтез которых хотя и не является необходимым для экспрессии факторов вирулентности, но остается важным для выполнения ряда функций, способствующих сохранению холерных вибрионов в кишечнике и окружающей среде.
18
ЗНиСО апрель №4 (229)
Известно, что ряд микробных патогенов (Salmonella enterica, Helicobacter pylori, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Yersinia pestis) используют систему активации плазминогена в плазмин для преодоления тканевых барьеров во время так называемых бактериальных метастазов [4]. Некоторые из них экспрессируют на своей поверхности рецепторы для фиксации и последующей активации под влиянием урокиназы или тканевых активаторов плазминогена хозяина, другие для этого используют собственные протеа-зы, входящие в семейство омптинов. Известные омптины OmpTE. coli, PgtES. enterica и Pla Y. Pestis, хотя и отличаются своей субстратной специфичностью, а также особенностями экспрессии, но все они атакуют врожденные защитные системы макроорганизма, активируют плазминоген, разрушают катионактивные антимикробные пептиды (дефензины, протамины), затрагивают системы коагуляции, фибринолиза, комплемента, матричных металлопротеиназ, усиливают адгезивность и инвазивность бактерий [3]. У V. cholerae система активатор плазминогена/плазмин не описана, хотя известны случаи выделения вибрионов из крови людей [1].
Цель данного исследования — выявление у холерного вибриона способности переводить плазминоген в плазмин.
Было использовано 25 штаммов Vibrio cholerae O1 и О139 сероваров, полученных из музея живых культур РПЧИ. Гены белков наружных мембран OmpT и OmpUтестировались в ПЦР по методике D.S. Merell с соавторами [5]. Плазминоген человека получали из плазмы крови аффинной хроматографией на лизин-сефарозе 4В (Pharmacia, Швеция) по Deutsch D.G. и Mertz E.T. [2]. Активация плазминогена суспензиями культур проводилась в пластиковых пробирках Eppendorf объемом 2 мл. Смесь (0,2 М фосфатный буфер, рН 8,0; 5x109 м.к./мл; 15 мкг плазминогена) в объеме 1 мл инкубировалась 1 ч при 37 °С, после чего клетки осаждались центрифугированием (11 000 об./мин, биофуга Heareus) в течение 5 мин. В первую (контрольную) пробирку вносились все ингредиенты кроме суспензии клеток (контроль плазминогена), во вторую — только буфер (контроль протамина). Супернатанты переносились в чистые пробирки, добавлялись по 100 мкг про-тамина (Calbiochem) и инкубировались 2 ч при 37 °С. Реакция останавливалась добавлением 1 мл 20 % ТХУ. Осветленные центрифугированием
супернатанты переносились в стеклянные пробирки, помещались в ледяную баню и использовались для определения содержания аргинина по Сакагуши [3]. Количество отщепленного активированным плазминогеном аргинина определялось по калибровочной кривой, которая строилась с использованием в качестве стандарта препарата солянокислого аргинина. Активность выражалась в мкМ аргинина, отщепленного от протамина плазмином, образовавшимся вследствие активации плазминогена клетками холерного вибриона за 2 ч инкубации при 37 °С.
У холерного вибриона удалось обнаружить способность переводить плазминоген человека в плазмин (табл. 1). Инкубация суспензий большинства исследованных штаммов вибрионов О1 и клинических О139 серогрупп с плазминогеном резко повышала его протеолитическую активность в результате перехода из неактивного состояния в активное (плазмин). В целом активность была выше у штаммов вибрионов О1 серовара (20—78 мкг Арг/109 м.к.) по сравнению с вибрионами 0139 (0—22 мкг Арг/109 м.к.). Адекватно вели себя контрольные штаммы (Е. coli и Y. pestis), проявляя активность своих протеаз в отношении плазминогена человека (15,8 и 155,2 мкг Арг/199 м.к. соответственно). Исключение составили шесть выделенных из воды и лишенных, по данным ПЦР, гена OmpT штаммов вибрионов О139 серовара, у которых активность не регистрировалась. Возможно, это связано с обширными перестройками хромосомы в связи с их большей чувствительностью к пребыванию в водной среде по сравнению со штаммами О1 серогруппы, сохранивших способность к активации плазминогена. Не исключено, что у последних эта активность складывается из активностей нескольких протео-литических ферментов со своими особенностями регуляции и экспрессии. Высокая плазминоген-активирующая способность была обнаружена в препаратах наружных мембран из клеток штамма V. cholerae eltor 18950 OmpT AOmpU после осаждения при 105 000 g (центрифуга Beckman L5-50, ротор Sorvall AH 627) и солюбилизации интегрированных белков 1 %-м тритоном Х-100. В дальнейшем с помощью хроматографии на целлюлозе ДЕ-52 удалось получить нативный препарат OmpT белка с удельной активностью 933,3 мкг Арг/ мг белка и молекулярной массой около 40 кДа. Найдено, что он наделен протеолитической активностью, активирует плазминоген человека,
Таблица 1. Способность штаммов Vibrio cholerae активировать плазминоген человека в условиях in vitro
Штаммы, серовар Число штаммов Источник выделения Удельная активность мкгАрг/109 м.к/час
V. cholerae eltor О1 7 человек 30,45-78,0
V. cholerae eltor О1 6 вода 20,0-41,5
V. cholerae О139 6 человек 9,49-22,0
V. cholerae О139 6 вода 0
Yersinia pestis EV 1 — 155,2
Escherichia coli QD5003 1 — 15,8
апрель №4 (229)
19
расщепляет протамин, казеин, желатину?, коллаген, но не плазмин-специфичный пептидный хромогенный субстрат n-нитроанилид трипептида For — Ala — Phe — Lys- pNa.HBr (Ренам, Россия). Чувствителен к фенилметилсульфонилфлуориду, слабо реагирует на присутствие дитиотреитола, ЕДТА, р-хлормеркуриобензоата, ингибируется солями Zn2+ и Cu2+, £-аминокапроновой кислотой, мочевиной и SDS, что сближает его с сери-новыми протеазами. Белок OmpT проявил свою антигенность при подкожной иммунизации кроликов. Антитела к ОmpT обладали нейтрализующим действием, но не агглютинировали целые клетки V. cholerae eltor 5879 и V. cholerae O139 16064 (клинический вариант). Из представителей рода Vibrio, только V. choleraе choleraе, V. cholerae eltor и V. choleraе 0139 реагировали в реакции преципитации в геле с антисывороткой к белку OmpT из холерного вибриона. Представители энтеробактерий (возбудители чумы и псевдотуберкулеза, кишечная палочка) и других вибрионов (V.parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. furnissii) такой способностью не обладали.
Обнаруженная природная способность холерного вибриона активировать плазминоген в плаз-мин существенно усиливает патогенетические возможности возбудителя за счет увеличения его деструктивного потенциала, направленного против неспецифических защитных сил хозяина.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Abboud C.S., Ferreira C.E.S., Barbosa V.L.B., Ara-ujo D.A.C., Zandonadi E.C., Pasternak K.J. Septicemia caused by Vibrio cholerae Ol biotype El Tor, in San Paulo, Brazil //Brazil. J. Infect. Dis. 2007. Vol. 11. № 2. P. 300—301.
2. Deutsch D.G., Mertz E.T Plasminogen: purification from human plasma by affinity chromatography //Science. 1970. Vol. 170. P. 1095—1096.
3. Haiko J. M., Suomalainen М., Ojala T, Lahteenmaki K., Korhonen K. Invited review: Breaking barrier — attack on innate immune defences by omptin surface proteases of enterobacterial pathogens //Innate Immun. 2009. Vol. 15. № 2. P. 67—80.
4. Lahteenmaki K., Edelman S., Korhonen T.K Bacterial metastasis: the host plasminogen system in bacterial invasion //Trends in Microbiology. 2005. Vol. 13. № 2. P. 79—85.
5. Merrell D.S., Bailey C, Kaper J.B., CamilliA. The ToxR-mediated organic acid tolerance response of Vibrio cholerae requires OmpU //J. Bacteriol. 2001. Vol. 183. № 9. P. 2746—2754.
Контактная информация: Шипко Елена Сергеевна, тел.: 8 (863) 240-27-30
Contact information: Shipko Elena, phone: 8 (863) 240-27-30
