CC BY
44
ЛИТЕРАТУРА
1. АфанасьеваМ. B., ВоробьеваН. И., Коренберг Э.И. и др. // Ин-фекц. бол. - 2006. - Т. 4, № 2. - С. 24-28.
2. Бондаренко Е. И., Тимофеев Д. И., Иванов М. К. // Новости "Вектор-Бест". - 2010. - № 1 (55). - С. 2-7.
3. БондаренкоЕ. И., Титов С. Е., ИвановМ. К. // Новости "Вектор-Бест". - 2012. - № 1 (63). - С. 2-8.
4. Борисов В. А., Козлова И. В., Аитов К. А. и др. // Журн. инфекц. патол. - 2010. - Т. 17, № 3. - С. 35-37.
5. Нефедова В. В., Коренберг Э. И., Ковалевский Ю. В. и др. // Вестн. РАМН. - 2008. - № 7. - С. 47-50.
6. Рар В. А., Епихина Т. И., ЛивановаН. Н. и др. / Молекул. генетика. - 2011. - № 2. - С. 17-23.
7. Шпынов С. Н., Рудаков Н. В., Ястребов В. К. и др. // Мед. пара-зитол. - 2004. - № 2. - С. 10-14.
8. EremeevaМ. Е., Oliveira A., Robinson J. B. et al. // Ann. N. Y. Acad. Sei. - 2006. - Vol. 1078. - P. 291-298.
9. Masuzawa Т., Kharitonenkov I. G., Okamoto Y. et al. // J. Med. Microbiol. - 2008. - Vol. 57. - P. 986-991.
10. ParolaP., Davoust В., RaoultD. // Vet. Res. - 2005. - Vol. 36. - P. 469-492.
11. Rar V. A., LivanovaN. N., Panov V. V. et al. // Ticks and Tick-borne Dis. - 2010. - Vol. 1. - P. 57-65.
12. Rar V. A., Epikhina T. I., Livanova N. N. et al. // Vector-Borne and Zoonotic Dis. - 2011. - P. 1013-1021.
13. RymaszewskaA. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 27. - P. 1025-1036.
14. ThomasR. J., Dumler J. S., Carlyon J. A. // Expert Rev. Anti-Infect. Ther. - 2009. - Vol. 7. - P. 709-722.
15. vonLoewenichF. D., BaumgartenB. U., SchröppelK. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41. - P. 5033-5040.
Поступила 16.04.12
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2012 УДК 579.843.1:579.222].083.1
Е. С. Шипко, Б. Н. Мишанькин, О. в. Дуванова, Л. в. Романова, Н. Я. Шиманюк, С. О. водопьянов
определение способности холерных вибрионов активировать плазминоген человека в условиях iN viTRo
Лаборатория биохимии микробов ФГУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Предложена методика, позволяющая характеризовать штаммы возбудителя холеры по их способности переводить плазминоген человека в плазмин в условиях in vitro, которая может быть использована при проведении прикладных и фундаментальных исследований, связанных с изучением тонких механизмов патогенеза и колонизации кишечника при холере.
Ключевые слова: плазминоген, плазмин, холерные вибрионы, протамин, аргинин
Ye.S. Shypko, B.N. Mishankin, O.V. Duvanova, L.V. Romanova, N.Ya. Shimanyuk, S.O. Vodopyanov THE DETECTION OF CAPABILITY OF COMMA BACILLUS TO ACTIVATE HUMAN PLASMINOGEN IN
VITRO
The article discusses the technique of defining the strains of comma bacillus according their capability to convert human plasminogen into plasmin in vitro. This method can be implemented in applied and fundamental research concerning the study of subtle mechanisms ofpathogenesis and colonization of intestines under cholera.
Key words: plasminogen, plasmin, comma bacillus, protamine, arginine
Плазминоген - одноцепочечный гликопротеин с мол. массой 92 кДа. Он продуцируется в основном гепатоцитами печени, хотя известны и другие органы его синтеза, включая тонкую кишку [12]. Концентрация плазминогена в плазме крови и некоторых интерстициальных жидкостях достигает 180-200 мкг/мл. Будучи зимогеном, он превращается в свою активную форму (плазмин) под действием урокиназы (иАР) и тканевых (АР) активаторов плазминогена. Активация представляет собой следствие точечного гидролиза пептидной связи -А^-Уа1- в результате чего из одной молекулы плазминогена образуется молекула плазмина, состоящая из двух удерживаемых дисульфидной связью полипептидов [4]. Плазмин (КФ.3.4.21.7, фибринолизин) - трипсиноподобная протеаза с широкой субстратной специфичностью, участвующая в фибринолизе, гомеостазе, деградации внеклеточного матрикса и базальных мембран.
Для корреспонденции:
Шипко Елена Сергеевна, мл. науч. сотр.
Адрес: 344002, Ростов-на-Дону, ул. Максима Горького, 117
Телефон: 8(863)240-27-03
E-mail: [email protected]
Ряд микробных патогенов (Salmonella enterica, Helicobacter pylory, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Yersinia pestis) используют систему плазминоген-плазмин человека для преодоления тканевых барьеров во время так называемых бактериальных метастазов [9]. Некоторые из них (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis) экспрес-сируют на своей поверхности рецепторы для фиксации и последующей активации под влиянием иАР и tAP плазминогена хозяина другие для этого используют собственные протеазы, входящие в семейство омптинов. Известные омптины OmpT Е. coli, PgtE S. enterica и Pla Y. pestis атакуют врожденные защитные системы макроорганизма, активируют плазмино-ген, разрушают катионактивные антимикробные пептиды (дефензины, протамин), затрагивают системы коагуляции, фибринолиза, комплемента, усиливают адгезивность и ин-вазивность бактерий [8]. Сведения о способности холерных вибрионов активировать плазминоген в литературе отсутствуют.
Для оценки активности плазмина используют как природные (казеин, желатин, фибриноген и другие), так и синтетические (n-нитроанилид трипептида For-Ala-Phe-Lys-pNa. НВг или S-2251) белки [3]. И если первые отличаются низкой чувствительностью, то вторые - малой доступностью, нестабильностью и коммерческой дороговизной.
Действие плазмина предпочтительно направлено на пептидные связи, образованные остатками L-аргинина и L-лизина. Предлагаем использовать для количественной оценки активированного плазминогена (плазмина) протамин, на 60% состоящий из аргининовых остатков, который по своей результативности близок к хромогенному трипептиду, тем более что, по данным К. Н. Веремеенко и Л. М. Погореловой [1], протамин может расщепляться плазмином, активированным в сыворотке крови стрептокиназой.
Способность активированного плазминогена (плазмина) расщеплять протамин продемонстрирована на штаммах возбудителя холеры, выделенных от человека и из проб воды. В качестве эталона способности активировать плазминоген использован штамм Y. pestis EV Pla+.
Материалы и методы. Реактивы: агар Мартена (рН 7,4); мертиолат натрия (Loba-Chemie, Wien-Fischmed); 0,2 М фосфатный буфер рН 8,0; 20% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (Вектон); 0,02М L-аргинин солянокислый (Serva).
Субстраты: плазминоген человека, полученный аффинной хроматографией на лизин-сефарозе 4В (Pharmacia, Швеция) по D. Deutsch и E. Mertz [6], протамин (Calbiochem), n-нитроанилид трипептида For-Ala-Phe-Lys-pNa.HBr (НПО "Ренам", Россия).
В работе использовали 26 штаммов Vibrio cholerae се-рогрупп Ol и 0139 из музея живых культур Ростовского-на-Дону НИПЧИ, где их хранили в лиофилизированном состоянии. Исследованные культуры V. cholerae включали группу из 13 штаммов клинического происхождения, представленную изолятами из России, Киргизии, Японии, Индии и Франции, и 13 культур, выделенных в 1997-2000 гг. из воды рек Дон, Темерник, Москва, Ока, Ангара, Обь, Иня и очистительного коллектора Новосибирска. В работе также использовали вакцинный штамм Y. pestis EV Pla+ и 9 штаммов V. parahaemolyticus.
Вибрионы выращивали на агаре Мартена (рН 7,6) при 37oC в течение суток, готовили суспензии (5 • 109 м.к/мл), которые обеззараживали добавлением мертиолата натрия (1:10 000) и использовали в дальнейшей работе.
Реакцию с клетками исследуемой культуры проводили в пластиковых пробирках Eppendorf вместимостью 2 мл. Для реакции готовили инкубационную смесь (0,2 M фосфатный буфер рН 8,0, 5 • 109 м.к/мл, 15 мкг плазминогена) в объеме 1 мл. В первую контрольную пробирку вносили все ингредиенты - кроме суспензии клеток (контроль плазминогена), во вторую - только буфер (контроль протамина). Инкубацию вели в течение 1 ч при 37oC, после чего клетки осаждали центрифугированием (11 000 об/мин Heareus) в течение 5 мин. Супернатант переносили в чистую пробирку. В опытные и контрольные пробы вносили по 100 мкг протамина. Пробы инкубировали в течение 2 ч при 37oC. После инкубации белок осаждали добавлением 1 мл 20% ТХУ. Осветленный центрифугированием супернатант переносили в стеклянные пробирки, которые помещали в ледяную баню и использовали для определения содержания аргинина методом Сакагуши
[7].
Количество отщепленного активированным плазминоге-ном аргинина определяли по калибровочной кривой, которую строили с использованием в качестве стандарта препарата солянокислого аргинина. Активность выражали в микромолях аргинина, отщепленного от протамина плазмином, образовавшимся вследствие активации плазминогена клетками холерного вибриона за 2 ч инкубации при 37oC.
Активность плазмина с использованием плазминспеци-фичного хромогенного субстрата n-нитроанилида трипепти-да For-Ala-Phe-Lys-pNa.HBr определяли согласно рекомендациям фирмы-производителя [3].
К 500 мкл суспензии клеток (109 м.к/мл) в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) добавляли 30 мкл (50 мкг по белку) плазминогена, инкубировали в течение 1 ч при 37oC и отмывали центрифугированием (при 6000 об/мин в течение
5 мин). Осадки переносили в микрокюветы, объем пробы доводили до прежнего уровня и вносили 20 мкл (120 мкг) хромогенного субстрата. Закрытые крышками микрокюветы инкубировали при 37oC, периодически замеряя оптическую плотность при 405 нм в течение определенного отрезка времени. Контролем служила проба, в которую вместо плазминогена вносили физиологический раствор. О результатах реакции судили по данным спектрофотометрии (модель DU 730 Beckman Coulter) при 405 нм по отщепившемуся pNa и выражали в цифрах экстинкции: Д А405 = ^ - t0 [8].
Результаты и обсуждение. Предприняты усилия по выявлению у холерных вибрионов структур, предположительно участвующих в его распространении в организме хозяина. Этому способствовали описанные случаи выделения вибрионов из крови людей [5], обсуждение возможности транслокации V. cholerae через слизистую оболочку с последующей бактериемией, опосредованной М-клетками пейеровых бляшек тонкой кишки [11], демонстрация способности к диссемина-ции во внутренние органы холерных вибрионов серогрупп О1 и О139 при внутрижелудочном заражении кроликов-сосунков [2]. Эксперименты показали, что все штаммы холерного вибриона, принадлежавшие к серогруппе О1, вне зависимости
Таблица 1
Активация плазминогена человека суспензиями штаммов V. cholerae серогрупп O1 и O139, выделенных из проб воды и от человека
Штамм Серотип, источник выделения Аргинин, мкг на 109 м.к за 1 ч
Плазминоген - 0
Y. pestis EV - 155,19
V. cholera 18826 О1, человек 34,75
15443 О1, человек 37,45
18418 О1, человек 40,65
18374 О1, человек 30,45
569В О1, человек 48,0
14190 О1, человек 78,0
1603 О1, человек 48,0
17259 О139, человек 22,0
16073 О139, человек 16,72
16064 О139, человек 9,49
16068 О139, человек 11,77
16067 О139, человек 17,85
16072 О139, человек 16,9
18392 О1, вода 33,0
18804 О1, вода 41,5
17504 О1, вода 41,45
18948 О1, вода 33,9
18774 О1, вода 20,0
17572 О1, вода 30,95
18950 О1, вода 33,65
17625 О139, вода 0
17779 О139, вода 0
17470 О139, вода 0
17907 О139, вода 0
18772 О139, вода 0
18162 О139, вода 0
Таблица 2
способность клеток штаммов холерных вибрионов активировать сорбировавшийся на них плазминоген человека при использовании в качестве субстрата хромогенного трипептида
Штаммы V. cholerae Серовар, происхождение ^ А А405 = t, - Î0
17259 О139, человек 0,153
14280 О1, вода 0
14172 О1, вода 0
17781 О139, вода 0
18950 О1, вода 0,146
17907 О139, вода 0
17572 О1, вода 0
18774 О1, вода 0
18948 О1, вода 0,018
5879 01, человек 0,022
569В О1, человек 0,028
17793 О139, вода 0
16072 О139, человек 0,030
17625 О139, вода 0
от места и объекта выделения обладали способностью активировать плазминоген путем перевода его из неактивного состояния в активное (плазмин; 20-78 мкг аргинина на 109 м.к за 1 ч). Штаммы холерного вибриона серогруппы О139 оказались неоднородными: клинические штаммы активировали плазминоген, тогда как водные такой способностью не обладали. Результаты представлены в табл. 1.
Штаммы галофильных вибрионов V. parahaemolyticus, обитающих в соленых водоемах, также способны активировать плазминоген (от 2,9 до 18,9 мкмоль аргинина на 109 м.к за 1 ч).
Для оценки достоверности предлагаемой методики проверены некоторые штаммы вибрионов с использованием коммерческого синтетического субстрата n-нитроанилида
трипептида For-Ala-Phe-Lys-pNa.HBr. Полученные при использовании в качестве субстрата для плазмина протамина и хромогенного трипептида результаты коррелировали между собой. Количественные различия, касающиеся отдельных штаммов, могут быть объяснены индивидуальными особенностями этих штаммов (табл. 2).
С помощью предложенной методики у представителей рода Vibrio показано наличие системы активации плазмино-гена, что расширило представления о патогенетических возможностях холерного вибриона.
Заключение. Предлагаемый способ определения активации плазминогена отличается простотой, высокой чувствительностью, не требует дорогостоящих реактивов и оборудования. Его можно применять для исследования плазминогенактивирующей способности широкого круга микроорганизмов (Y pestis, Francisella tularensis, E. coli и др.).
ЛИТЕРАТУРА
1. Веремеенко К. H., ПогореловаЛ. М. // Лаб. дело. - 1973. - № 5. -С. 287-289.
2. Миронова А. В., Меньшикова Е. А. // Журн. микробиол. - 2002. -№ 3. - С. 58-60.
3. Момот А. П., Мамаев А. Н., Баркаган З. С. и др. // Клин. лаб. диагн. - 2000. - № 3. - С. 21-24.
4. Мосолов В. В. Протеолитические ферменты. - М.: Наука, 1971. -С. 190.
5. Abboud C. S., Ferreira C. E. S., Barbosa V. L. B. et al. // Brazil J. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 11, N 2. - P. 300-301.
6. Deutsch D. G., MertzE. T. // Science. - 1970. - Vol. 170. - P. 10951096.
7. Gilboe D. D., Williams J. N. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1956. -Vol. 91, N 4. - P. 535-536.
8. Haiko J., SuomalainenM., Ojala T. et al. // Innate Immun. - 2009. -Vol. 15, N 2. - P. 67-80.
9. Lahteenmaki K., Edelman S., Korhonen Т. K. // Trends Microbiol. -1984. - Vol. 13, N 2. - P. 79-85.
10. Lahteenmaki K., Kuusela P., Korhonen Т. K. // FEMS Microbiol. Rev. - 2001. - Vol. 25. - P. 531-552.
11. Owen R. L., Pierce N. F., Apple R. T., Cray W. C. // J. Infect. Dis. -1986. - Vol. 153. - P. 1108-1118.
12. ZhangL., Seiffert D., FowlerB. J. et al. Tromb. Haemost. - 2002. -Vol. 87, N 3. - P. 493-501.
Поступила 28.07.11
Уважаемые читатели!
Приглашаем Вас посетить сайт издательства «Медицина» в Интернете Наш адрес:
www.medlit.ru
ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ СЛУЖБЫ
© коллектив авторов, 2012
УДК 616-074/-078:615.471
Л. в. Сочкова1, М. Г. Морозова1, B. С Берестовская2, Е. С. Ларичева2, Л. Р. Захарова3
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ УПРАВЛЕНИЯ ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫМИ ПОТОКАМИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ВРЕМЕНИ ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
1ГБУЗ Городская поликлиника № 87 Невского района, Санкт-Петербург; 2ГБОУ СЗГМУ им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург; 3ГБОУ вПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова, Москва
Определено время получения результата (ТАТ) биохимических и иммунохимических исследований на отдельно стоящих анализаторах, составных частях модульной системы, виртуально и реально консолидированных системах. Установлено, что наименьшее ТАТ характерно для исследований, выполненных на модульной системе cobas 6000. Информация о времени получения результата, базирующаяся на записях в лабораторной информационной системе (ЛИС), может использоваться для оптимизации управления потоками внутри лаборатории.
Ключевые слова: время выполнения исследования, внутрилабораторные потоки, эффективность
L.V. Sotchkova, M.G. Morozova, VS. Berestovskaya, Ye.S. Laritcheva, L.R. Zakharova THE EVALUATION OF EFFECTIVENESS OF MANAGEMENT OF INTRA-LABORATORY FLOWS ON THE
BASIS OF TURNAROUND TIME The turnaroud time was established for biochemical and immunochemical analyses using .separately .standing analyzers, component parts of module system, virtually and really consolidated systems. It is discovered that the least time of results receiving is typical for analyses implemented at the module system cobas 6000. The information about turnaroud time based on records of laboratory information system, can be applied in optimizing the management of intra-laboratory flows.
Key words: turnaround time, intra-laboratory flows, effectiveness
Централизация лабораторных исследований явилась стимулом для оснащения и совершенствования диагностической службы страны. Базовые принципы централизованной диагностики с анализом медицинских, организационных и экономических рисков, возникающих при реализации проекта, приводятся в отечественной литературе [1, 2]. В этих публикациях обращается внимание на то, что основными параметрами, определяющими эффективность клинико-диагностической лаборатории, являются системность преобразовании, экономическая целесообразность, обеспечение доступности исследований, а также время получения результатов исследования (turnaround time - TAT). При этом последний параметр часто рассматривается как один из индикаторов качества лабораторной медицины [7]. В доступной нам отечественной литературе мы также обнаружили применение аббревиатуры TAT для описания времени получения результатов [3].
Целью нашей работы явилось определение времени получения результатов биохимических и иммунохимических исследований в централизованной клинико-диагностической лаборатории, а также сравнение времени получения результатов на отдельно стоящих анализаторах и консолидированной модульной системе, состоящей из биохимического и им-мунохимического модулей.
Для корреспонденции:
Берестовская Виктория Станиславовна, канд. мед. наук, доц. каф. клин. лаб. диагн.
Адрес: 191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, дом 41 Телефон: (8-964) 396-11-38 E-mail: [email protected]
Материалы и методы. Было проанализировано время получения результата 229 556 исследований (29 162 заказов в лабораторной информационной системе (ЛИС), соответствующих количеству пациентов), проведенных в период с 8 декабря 2011 г. по 2 марта 2012 г. в межрайонной клинико-диагностической лаборатории городской поликлиники N° 87 Невского района Санкт-Петербурга на аналитических системах производства Roche Diagnostics. В качестве отдельно стоящих аналитических систем рассматривались биохимический анализатор cobas Integra 800 (135 624 теста, 16 642 пациента) и иммунохимический анализатор Elecsys 2010 (836 тестов, 462 пациента). Консолидированная модульная система была представлена анализатором cobas 6000 (21 718 тестов, 2066 пациентов), состоящим из биохимического модуля с501 и иммунохимического модуля е601. Также были выделены заказы, выполнение которых требовало проведения только биохимических или только имму-нохимических исследований, направленных ЛИС на части модульной системы с501 (62 414 тестов, 8181 пациент) и e601 (2441 теста, 1142 пациента) соответственно. Кроме того, в случаях, когда пациенту требовалось выполнение биохимических и иммунохимических исследований в качестве виртуальной консолидации (соединение через ЛИС) рассматривалась модель cobas Integra 800 - Elecsys 2010 (6523 теста, 649 пациентов).
Для расчета TAT использовали общий интервал проведения исследования в минутах, фиксирующийся в ЛИС "PSM-АКЛ клиническая лаборатория" (Roche - Акросс Инжиниринг), функционирующей в лаборатории с 2007 г.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакетов программ Statistica for Windows (версия 10), "StatSoft Inc" (США) и MedCal (версия 11.5.1) "MedCalc Software" (Бельгия). Использовали методы описательной статистики с оценкой нормальности распреде-
