CC BY
185
© коллектив авторов, 2012
УДК 579.881.3.083.3
Е. И. Бондаренко1, M. K. Иванов1' 2, B. B. Якименко3, A. K. Танцев3, в. в. Панов4, Т. И. Епихина5, в. А. Рар5
использование полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления днк возбудителей гранулоцитарного анаплазмоза и моноцитарного эрлихиоза человека
1ЗАО "вектор-Бест" Новосибирск; 2Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск; 3Омский НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора, 4Институт систематики и экологии животных СО РАН, Новосибирск; 5Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск
109 клещей рода Ixodes из Новосибирской области и Хабаровского края и образцы крови 111 мышевидных грызунов из Омской области исследованы на наличие ДНК возбудителей гранулоцитарного анаплазмоза (ГАЧ) и моноцитарного эрлихиоза человека (МЭЧ) методом ПНР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием набора реагентов "РеалБест ДНК Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia muris, Ehrlichia chaffeensis" (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск), а также с помощью двухраундовой ПЦР. ДНК возбудителя ГАЧ А. phagocytophilum и/или возбудителя МЭЧ Е. muris обнаружена в 21 клеще и в образцах крови 52 полевок с использованием обоих методов. В двух образцах от полевок и одном клеще ДНК A. phagocytophilum выявлена только при проведении ПЦР-РВ. Показано, что набор реагентов "РеалБест ДНК Anaplasma phagocytophilum/ Ehrlichia muris, Ehrlichia chaffeensis" позволяет выявлять ДНК изолятов А. phagocytophilum, относящихся к различным генетическим группам, и может быть использован для быстрой и эффективной детекции ДНК возбудителей ГАЧ и МЭЧ в суспензиях анализируемых клещей и образцах крови.
Ключевые слова: ПЦР в режиме реального времени, двухраундовая ПЦР, диагностика, гранулоцитарный анаплазмоз человека, моноцитарный эрлихиоз человека
Ye.I. Bondarenko, M.K. Ivanov, V.V. Yakimenko, A.K. Tantzev, V.V. Panov, T.I. Yepikhina, V.A. Rar THE APPLICATION OF POLYMERASE CHAIN REACTION IN REAL-TIME OPERATION MODE TO DETECT DNA OF AGENTS OF HUMAN GRANULOCYTIC ANAPLASMOSIS AND MONOCYTIC
ERLYCHIOsIs
The analysis was applied to detect DNA of agents of human granulocytic anaplasmosis and monocytic erlychiosis. The .sampling included 109 ticks of Ixodes species from Novosibirsk oblast and Khabarovsk kray and blood samples of 111 mouse-like rodents from Omsk oblast. The used techniques included polymerase chain reaction in real-time operation mode with set of reagents "RealBest DNA Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia muris, ehrlichia chaffeensis" ("Vector-Best" Novosibirsk) and double round polymerase chain reaction. The DNA of A. phagocytophilum, agent of granulocytic anaplasmosis and/or DNA ofE. muris, agent ofmonocytic erlychiosis was detected in 21 ticks and in blood samples of 52 voles. Both techniques were applied. The DNA of A. phagocytophilum was detected in samples of 2 voles and in 1 tick only after polymerase chain reaction in real-time operation mode was applied. It demonstrated that the set of reagents "RealBest DNA Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia muris, ehrlichia chaffeensis" permits to detect the DNA of isolates of A. phagocytophilum subsumed to different genetic groups. The set can be used for fast and effective detection of the DNA of agents of agents of human granulocytic anaplasmosis and monocytic erlychiosis in suspensions of analyzed ticks and blood samples.
Key words: polymerase chain, reactionreal-time operation mode, double round polymerase chain reaction, diagnostics, agents of human granulocytic anaplasmosis, human monocytic erlychiosis
Введение. Иксодовые клещи являются переносчиками не только возбудителей клещевого энцефалита, риккетсиоза и ик-содового клещевого боррелиоза, но и других менее известных инфекций, таких как эрлихиозы и анаплазмозы, вызываемые бактериями семейства Апар^та1асеае [10]. Широкий интерес к изучению данных заболеваний возник после обнаружения среди представителей семейства Апар^та1асеае патогенных для людей видов. Подавляющее большинство случаев эрли-хиозов и анаплазмозов (несколько тысяч) зарегистрировано в США, при этом летальность составляла 1-3% [14]. В России серологически подтвержденные случаи заболеваний были отмечены на территории различных областей [1, 4].
Жизненный цикл эрлихий и анаплазм включает стадии размножения в иксодовых клещах, служащих специфичными переносчиками, и позвоночных животных (в частности, мелких грызунах), являющихся резервуарными хозяевами
Для корреспонденции:
Бондаренко Евгений Иванович, канд. мед. наук, науч. сотр. лаб. ПЦР
Адрес: 630117, Новосибирск, а/я 492 Телефон: 8(913)370-59-81 E-mail: [email protected]
для данных патогенов [10]. На территории различных областей России в таежных клещах Ixodes persulcatus и в мелких млекопитающих была обнаружена ДНК возбудителя гранулоцитарного анаплазмоза человека (ГАЧ) Anaplasma phagocytophilum, предполагаемого возбудителя моноцитарного эрлихиоза человека (МЭЧ) на территории Евразии Ehrlichia muris и в единичных случаях еще одного патогенного для людей вида бактерий - Candidatus Neoehrlichia mikurensis [5, 7, 8].
Ранее нами было проведено исследование по выявлению и идентификации бактерий семейства Anaplasmataceae в клещах и мелких млекопитающих на территории Урала, Сибири и Дальнего Востока, основанное на проведении двухраундовой ПЦР из области гена 16S рРНК. Положительные образцы были охарактеризованы на основании определения нуклеотидных последовательностей гена 16s рРНК и оперо-на groESL. Данный подход позволил выявить ДНК как известных видов - A. phagocytophilum, Е. muris и Candidatus Neoehrichia mikurensis, так и новых генетических вариантов бактерий из семейства Anaplasmataceae [11]. Было также показано, что обнаруженные на территории России образцы A. phagocytophilum подразделяются на три генетические группы, различающиеся по тропизму к различным видам млекопитающих [12].
Следует, однако, отметить, что в диагностических лабораториях медицинских учреждений метод двухраундовой ПЦР применяется очень редко из-за высокой опасности контаминации исследуемых образцов продуктами амплификации и из-за значительного времени, необходимого для проведения анализа. Наиболее перспективным для использования в диагностических лабораториях является метод ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ), позволяющий получить результат анализа в течение нескольких часов с момента забора пробы. Достоинством ПЦР-РВ является высокая технологичность, снижение риска контаминации нуклеиновыми кислотами и возможность определения количества патогена в исследуемом материале.
В работе проведено выявление ДНК возбудителей ГАЧ и МЭЧ в образцах крови мелких млекопитающих и от клещей с помощью основанного на проведении ПЦР-РВ набора реагентов "РеалБест ДНК Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia chaffeensis", и сопоставление результатов, полученных с помощью ПЦР-РВ и двухраундовой ПЦР.
Материалы и методы. Сбор образцов. Для анализа использованы 105 взрослых клещей рода Ixodes (таежные клещи I. persulcatus и I. pavlovskyi), собранных с растительности на флаг в окрестностях Новосибирска в 2010 и 2011 гг., и образцы крови 111 мышевидных грызунов (107 лесных полевок рода Myodes, двух полевок родаMicrotus и двух полевых мышей Apodemus agrarius), отловленных в лесных биотопах на территории Омской области в 2011 г От каждого животного было взято по 200 мкл крови. Кровь собирали в стерильные пробирки, содержащие по 30 мкл 0,5 М ЭДТА, добавляли по 400 мкл буфера для лизиса (4 М гуанидин-тиоционат, 0,1 М трис-HCl рН 6,4, 0,045 М ЭДТА рН 8,0, 1,3% Тритон Х-100), перемешивали и хранили при температуре 40С. Для выделения ДНК использовали по 100 мкл полученного образца.
Выявление ДНК возбудителей ГАЧ и МЭЧ. Выделение ДНК из суспензий клещей и образцов крови проводили с использованием набора реагентов "РеалБест экстракция 100" (ЗАО "Вектор-Бест"), как описано ранее [2]. Для одного образца, содержащего ДНК A. phagocytophilum и Е. muris, готовили серию двукратных разведений образца в буфере ТЕ (10 мМ трис-HCl рН 8,0, 1 мМ ЭДТА).
Было использовано два варианта проведения ПЦР. 1. ДНК бактерий из семейства Anaplasmatacea выявляли методом двухраундовой ПЦР в присутствии родоспецифич-ных праймеров из области гена 16S рРНК, как описано ранее [6]. Для всех положительных образцов был проведен второй раунд ПЦР в присутствии праймеров, специфичных к A. phagocytophilum и E. muris. 2. Выявление ДНК A. phagocytophilum и E. chaffeensis/E. muris проводили на тер-моциклере с флюоресцентной детекцией в режиме реального времени CFX96 (Bio-Rad, США) с помощью набора реагентов "РеалБест ДНК Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia muris, Ehrlichia chaffiensis" (ЗАО "Вектор-Бест") в соответствии с инструкцией производителя. Для обработки результатов использовали сервисную программу "РеалБест диагностика". При этом образцы считались положительными, если значение Ct для них было меньше или равно 40.
Нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК и/или оперона groESL белков теплового шока длиной около 1230-1300 н.о. для 36 положительных образцов были определены, как описано ранее [6], в центре секвенирования ДНК СО РАН, Новосибирск (http:// sequest.niboch.nsc.ru). Сравнение нуклеотидных последовательностей проведено с использованием программы BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST).
Результаты и обсуждение. Набор реагентов "Реал-Бест ДНК Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia muris, Ehrlichia chaffeensis" позволяет одновременно выявить ДНК A. phagocytophilum, Е. chaffeensis и Е. muris. В случае детекции A. phagocytophilum используемые праймеры и зонды соответствуют нуклеотидным после-
довательностям многокопийного гена р44, кодирующего поверхностные белки, а в случае определения Е. chaffeensis и Е. muris - последовательностям уникального гена цитратсинта-зы [3]. Применяемый в данной работе метод двухраундовой ПЦР основан на выявлении специфичных последовательностей уникального гена 16S рРНК [6].
Выявление ДНК A. phagocytophilum и Е. muris в клещах. В 14 из 105 клещей Ixodes spp., собранных на территории Новосибирской области, методом двухраундовой ПЦР была обнаружена ДНК A. phagocytophilum, а в 7 клещах - ДНК Е. muris (табл. 1). Для подтверждения полученных результатов были определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК и/или оперона groESL у девяти случайно выбранных образцов А. phagocytophilum и четырех образцов Е. muris. Проанализированные образцы A. phagocytophilum существенно отличались друг от друга по нуклеотидным последовательностям оперона groESL и относились к двум разным генетическим группам (I и III группы по оперону groESL). При проведении ПЦР-РВ ДНК А. phagocytophilum и Е. muris была выявлена во всех образцах, которые были положительными на основании данных двух-раундовой ПЦР. При этом значения Ct варьировали от 22 до 33. Кроме того, в одном образце, содержащем ДНК Е. muris, была дополнительно обнаружена ДНК А. phagocytophilum со значением Ct 36.
ДНК возбудителя ГАЧ была успешно выявлена с помощью ПЦР-РВ также в четырех клещах, собранных на территории Хабаровского края, которые, как было показано ранее, содержали ДНК бактерий А. phagocytophilum, относящихся к двум разным генетическим группам (I и III группы по оперо-ну groESL) [6].
Выявление ДНК A. phagocytophilum и E. muris в образцах крови мышевидных грызунов. При анализе методом двухра-ундовой ПЦР образцов крови от 111 мышевидных грызунов в 33 образцах была обнаружена ДНК А. phagocytophilum, в 10 образцах - Е. muris и в 9 образцах - ДНК обоих возбудителей одновременно (см. табл. 1). При этом ДНК как A. phagocytophilum, так и E. muris была обнаружена только в образцах от полевок рода Myodes. Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и/или оперона groESL были определены для 19 случайно выбранных образцов А. phagocytophilum и 4 образцов E. muris и было показано, что образцы A. phagocytophilum относились к двум различным генетическим группам (I и II группы по оперону groESL). При проведении ПЦР-РВ ДНК возбудителей ГАЧ и МЭЧ была выявлена во всех образцах, которые были положительными на основании данных двухраундовой ПЦР, при этом величина Ct варьировалась в случае A. phagocytophilum от 23 до 40 и в случае возбудителей МЭЧ от 27 до 40. Кроме того, методом ПЦР-РВ ДНК A. phagocytophilum была обнаружена в двух образцах от лесных полевок, отрицательных на основании данных двухраундовой ПЦР, для одного образца величина Ct составляла 37, а для другого - 40.
Таблица 1
Выявление ДнК A. phagocytophilum и E. muris в клещах и грызунах методами двухраундовой ПЦР и ПЦР-РВ
Общее число Число (%) образцов, содержащих ДНК
Источник вы- A. phagocytophilum E. muris
деления ДНК образцов двухраун-довая ПЦР ПЦР-РВ двухра-ундовая ПЦР ПЦР-РВ
Ixodes spp., Новосибирская область 105 14 (13,3) 15 (14,3) 7(6,7) 7(6,7)
Грызуны, Омская область 111 42 (37,8) 44 (39,6) 19 (17,1) 19 (17,1)
Таблица 2
сравнение результатов ПЦр-рВ и двухраундовой ПЦр при проведении реакций на взятом в пошаговых серийных разведениях в 2 раза образце ДнК, выделенном из крови полевки рода Муа/1е1
A. phagocytophilum Е. muris
N* значения Ct при проведении ПЦР-РВ результаты двухраундовой ПЦР** значения Ct при проведении ПЦР-РВ результаты двухраундовой ПЦР**
1 33,3 33,5 34,1 34,2 + + + + 30 30,3 30 30,5 + + + +
2 35,1 34,9 34,9 35,0 + + + + 31,2 31,3 31,0 31,2 + + + +
3 35,6 36,1 35,6 36,4 + + + + 32,1 32,4 31,8 32,5 + + + +
4 36,6 36,7 37,4 36,6 + + + + 33,4 32,9 33,4 33 + + + +
5 38 37,9 38,2 38,8 + + + - 34,3 34,3 34,4 34,8 + + + +
6 39,2 - 39,3 39,4 + - - - 36 35,9 35,3 35,3 + + + +
7 39,1 39,3 - 39,9 + + + - 37 36,1 36,2 36,3 + + + +
8 - - - 39,5 + - - - 37,5 39 37,9 39 + + - -
9 - - - - - - - - 40 39,7 39,3 39,6 + - - -
10 - - - - - - - - 39,4 40 39,3 39,5 + + - -
11 - - - - - - - - 39,7 - - - + - - -
12 - - - - - - - - - - - - - - - -
Примечание. № - разведения исходной ДНК: 1 - использование в реакции 2 мкл исходной ДНК; 2 - разведение исходного образца ДНК в 2 раз, 3 - разведение образца в 4 раза и далее пошаговое разведение в 2 раза; ** - результаты двухраундовой ПЦР: + положительные результаты, - отрицательные. В таблице приведены данные четырех повторных исследований каждым методом.
Подтверждение специфичности выявления возбудителей ГАЧ и МЭЧ методом ПЦР-РВ. При разработке набора для детекции возбудителей МЭЧ были выбраны праймеры и зонды, соответствующие нуклеотидным последовательностям гена цитратсинтазы Е. chaffeensis и E. muris, но отличающиеся от соответствующих последовательностей других известных видов эрлихий [3]. Однако для обнаруженных на территории России новых генетических вариантов и кандидатных видов бактерий из семейства Anaplasmataceae нуклеотидные последовательности гена цитратсинтазы не определены. Поэтому для подтверждения специфичности применяемого набора были проведены ПЦР-РВ с использованием в качестве матрицы четырех образцов ДНК из клещей Haemaphysalis japonica, содержащих новый генетический вариант эрлихий Ehrlichia sp. Hj27, четырех образцов ДНК от полевок, содержащих другой генетический вариант эрлихий - Ehrlichia sp. Khabarovsk, а также трех образцов от таежных клещей, содержащих ДНК Candidatus Neoehrlichia mikurensis [11]. Ни для одного из взятых образцов не были зарегистрированы сигналы, соответствующие возбудителям ГАЧ или МЭЧ, что свидетельствует о высокой специфичности используемого в эксперименте набора реагентов "РеалБест ДНК Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia muris, Ehrlichia chaffeensis".
При разработке набора для детекции ДНК A. phagocytophilum были выбраны праймеры и зонды, соответствующие известным последовательностям высоковариабельного гена поверхностного белка р44. Следует отметить, что вариабельность распространенных в России изолятов A. phagocytophilum по данному локусу очень мало изучена [9]. На основании анализа нуклеотидных последовательностей других генетических локусов (гена 16S рРНК и оперона groESL) было показано, что генетические варианты A. phagocytophilum, обнаруженные в клещах и мелких млекопитающих на территории России, существенно отличаются от изолятов A. phagocytophilum, циркулирующих на территории других стран [12, 13, 15]. При проведении ПЦР-РВ с использованием набора реагентов "РеалБест ДНК Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia muris, Ehrlichia chaffeensis" были обнаружены положительные образцы, относящиеся ко всем трем генетическим группам A. phagocytophilum, выявленным ранее на
территории России. Следует подчеркнуть, что выявленные методом ПЦР-РВ образцы А. phagocytophilum были изолированы как из клещей, так и из мелких млекопитающих, отловленных на территории различных областей (Омская, Новосибирская области, Хабаровский край).
В двух образцах крови полевок и одном образце клеща ДНК А. phagocytophilum была обнаружена только при проведении ПЦР-РВ (во всех трех случаях полученный сигнал соответствовал низкому содержанию ДНК). Причиной несовпадения результатов двух методов могла являться их разная чувствительность. Для сравнения аналитической чувствительности обоих методов была проведена с их использованием детекция ДНК A. phagocytophilum и Е. muris в образце ДНК из крови полевки, содержащем оба маркера, взятом в пошаговых серийных разведениях в 2 раза (табл. 2). Анализ для каждого разведения выполняли в четырех повторах. При проведении ПЦР-РВ фиксировали значение порогового цикла Ct. Из табл. 2 видно, что несмотря на то что чувствительность обоих методов сравнима, при низкой концентрации ДНК выявляемых патогенов (начиная с разведения 24 для ДНК A. phagocytophilum и 27 ДНК Е. muris) метод ПЦР-РВ дает более воспроизводимые и стабильные разультаты. Из проведенных экспериментов можно заключить, что при низком содержании возбудителей ГАЧ и МЭЧ в пробах их ДНК может быть выявлена c помощью ПЦР-РВ с чувствительностью, как минимум не уступающей двух-раундовой ПЦР.
Таким образом, показано, что наборы реагентов "РеалБест ДНК Anaplasma phagocytophilum/Ehrlichia muris, Ehrlichia chaffeensis" могут быть использованы для быстрой и эффективной детекции ДНК возбудителей ГАЧ и МЭЧ (A. phagocytophilum и Е. muris) в суспензиях анализируемых клещей и образцах крови. Ни в ходе выполнения данной работы, ни в других исследованиях другой возбудитель МЭЧ, Е. chaffeensis, на территории России до настоящего времени не был обнаружен [3, 7, 11]. Следует подчеркнуть, что исследованные в данной работе наборы реагентов способны выявлять только ДНК возбудителей ГАЧ и МЭЧ; поэтому представляется перспективным разработка нового или модификация существующего набора реагентов для обнаружения других патогенных видов из семейства Anaplasmataceae, таких как Candidatus Neoehrlichia mikurensis.
ЛИТЕРАТУРА
1. АфанасьеваМ. B., ВоробьеваН. И., Коренберг Э.И. и др. // Ин-фекц. бол. - 2006. - Т. 4, № 2. - С. 24-28.
2. Бондаренко Е. И., Тимофеев Д. И., Иванов М. К. // Новости "Вектор-Бест". - 2010. - № 1 (55). - С. 2-7.
3. БондаренкоЕ. И., Титов С. Е., ИвановМ. К. // Новости "Вектор-Бест". - 2012. - № 1 (63). - С. 2-8.
4. Борисов В. А., Козлова И. В., Аитов К. А. и др. // Журн. инфекц. патол. - 2010. - Т. 17, № 3. - С. 35-37.
5. Нефедова В. В., Коренберг Э. И., Ковалевский Ю. В. и др. // Вестн. РАМН. - 2008. - № 7. - С. 47-50.
6. Рар В. А., Епихина Т. И., ЛивановаН. Н. и др. / Молекул. генетика. - 2011. - № 2. - С. 17-23.
7. Шпынов С. Н., Рудаков Н. В., Ястребов В. К. и др. // Мед. пара-зитол. - 2004. - № 2. - С. 10-14.
8. EremeevaМ. Е., Oliveira A., Robinson J. B. et al. // Ann. N. Y. Acad. Sei. - 2006. - Vol. 1078. - P. 291-298.
9. Masuzawa Т., Kharitonenkov I. G., Okamoto Y. et al. // J. Med. Microbiol. - 2008. - Vol. 57. - P. 986-991.
10. ParolaP., Davoust В., RaoultD. // Vet. Res. - 2005. - Vol. 36. - P. 469-492.
11. Rar V. A., LivanovaN. N., Panov V. V. et al. // Ticks and Tick-borne Dis. - 2010. - Vol. 1. - P. 57-65.
12. Rar V. A., Epikhina T. I., Livanova N. N. et al. // Vector-Borne and Zoonotic Dis. - 2011. - P. 1013-1021.
13. RymaszewskaA. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 27. - P. 1025-1036.
14. ThomasR. J., Dumler J. S., Carlyon J. A. // Expert Rev. Anti-Infect. Ther. - 2009. - Vol. 7. - P. 709-722.
15. vonLoewenichF. D., BaumgartenB. U., SchröppelK. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41. - P. 5033-5040.
Поступила 16.04.12
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2012 УДК 579.843.1:579.222].083.1
Е. С. Шипко, Б. Н. Мишанькин, О. в. Дуванова, Л. в. Романова, Н. Я. Шиманюк, С. О. водопьянов
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПОСОБНОСТИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ АКТИВИРОВАТЬ ПЛАЗМИНОГЕН ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ iN ViTRO
Лаборатория биохимии микробов ФГУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Предложена методика, позволяющая характеризовать штаммы возбудителя холеры по их способности переводить плаз-миноген человека в плазмин в условиях in vitro, которая может быть использована при проведении прикладных и фундаментальных исследований, связанных с изучением тонких механизмов патогенеза и колонизации кишечника при холере.
Ключевые слова: плазминоген, плазмин, холерные вибрионы, протамин, аргинин
Ye.S. Shypko, B.N. Mishankin, O.V. Duvanova, L.V. Romanova, N.Ya. Shimanyuk, S.O. Vodopyanov THE DETECTION OF CAPABILITY OF COMMA BACILLUS TO ACTIVATE HUMAN PLASMINOGEN IN
VITRO
The article discusses the technique of defining the strains of comma bacillus according their capability to convert human plasminogen into plasmin in vitro. This method can be implemented in applied and fundamental research concerning the study of subtle mechanisms ofpathogenesis and colonization of intestines under cholera.
Key words: plasminogen, plasmin, comma bacillus, protamine, arginine
Плазминоген - одноцепочечный гликопротеин с мол. массой 92 кДа. Он продуцируется в основном гепатоцитами печени, хотя известны и другие органы его синтеза, включая тонкую кишку [12]. Концентрация плазминогена в плазме крови и некоторых интерстициальных жидкостях достигает 180-200 мкг/мл. Будучи зимогеном, он превращается в свою активную форму (плазмин) под действием урокиназы (иАР) и тканевых (АР) активаторов плазминогена. Активация представляет собой следствие точечного гидролиза пептидной связи -А^-Уа1- в результате чего из одной молекулы плазминогена образуется молекула плазмина, состоящая из двух удерживаемых дисульфидной связью полипептидов [4]. Плазмин (КФ.3.4.21.7, фибринолизин) - трипсиноподобная протеаза с широкой субстратной специфичностью, участвующая в фибринолизе, гомеостазе, деградации внеклеточного матрикса и базальных мембран.
Для корреспонденции:
Шипко Елена Сергеевна, мл. науч. сотр.
Адрес: 344002, Ростов-на-Дону, ул. Максима Горького, 117
Телефон: 8(863)240-27-03
E-mail: [email protected]
Ряд микробных патогенов (Salmonella enterica, Helicobacter pylory, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Yersinia pestis) используют систему плазминоген-плазмин человека для преодоления тканевых барьеров во время так называемых бактериальных метастазов [9]. Некоторые из них (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis) экспрес-сируют на своей поверхности рецепторы для фиксации и последующей активации под влиянием иАР и tAP плазминогена хозяина другие для этого используют собственные протеазы, входящие в семейство омптинов. Известные омптины OmpT Е. coli, PgtE S. enterica и Pla Y. pestis атакуют врожденные защитные системы макроорганизма, активируют плазмино-ген, разрушают катионактивные антимикробные пептиды (дефензины, протамин), затрагивают системы коагуляции, фибринолиза, комплемента, усиливают адгезивность и ин-вазивность бактерий [8]. Сведения о способности холерных вибрионов активировать плазминоген в литературе отсутствуют.
Для оценки активности плазмина используют как природные (казеин, желатин, фибриноген и другие), так и синтетические (n-нитроанилид трипептида For-Ala-Phe-Lys-pNa. HBr или S-2251) белки [3]. И если первые отличаются низкой чувствительностью, то вторые - малой доступностью, нестабильностью и коммерческой дороговизной.
