CC BY
36
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 616.981.452:576.8
С.В.Дентовская, М.Е.Платонов, И.В.Бахтеева, А.П.Анисимов
НАЛИЧИЕ ПОЛНОЙ СТРУКТУРЫ КОРА ЛИПОПОЛИСАХАРИДА НЕОБХОДИМО ДЛЯ АКТИВАЦИИ ПЛАЗМИНОГЕНА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск
Ранее установлено, что S-форма липополисахарида (ЛПС) ингибирует активность активатора плазминогена (Pla) Yersinia pestis. В настоящей работе мы оценивали фибринолитическую и плазмокоагулазную активности Pla у штаммов Y. pestis с мутациями в генах, ответственных за биосинтез ЛПС, по сравнению с таковыми у исходного штамма. Показано, что укорочение коровой части ЛПС ведет к исчезновению обеих активностей, тогда как снижение степени ацилирования липида А не влияет на фибринолитическую и плазмокоагулазную способности.
Ключевые слова: Y. pestis, фибринолитическая и плазмокоагулазная активности, ЛПС.
Для постоянной циркуляции в природных очагах возбудитель чумы должен проникнуть в организм, противодействовать защитным бактерицидным системам грызуна и размножиться для обеспечения бактериемии, необходимой для дальнейшей передачи блохами новому хозяину. Каждый из этапов циклического существования Yersinia pestis обеспечивается множеством факторов, действующих совместно или индивидуально на различных стадиях инфекционного процесса или трансмиссии. Но только в совокупности эти факторы обеспечивают циркуляцию возбудителя чумы в природных очагах, каким бы значительным или незначительным не был их индивидуальный эффект. Среди них следует отметить два полифункциональных фактора патогенности: липополисахарид (ЛПС) и активатор плазминогена (Pla), каждый из которых оказывает плейотропное противодействие защитным механизмам хозяина и переносчика. ЛПС Y. pestis определяет устойчивость к бактерицидному действию катионных пептидов и сыворотки, а также индуцирует развитие эндотоксического шока [1].
Pla обладает плазмокоагулазной активностью. В то же время, активируя плазминоген, он обеспечивает локальный фибринолиз в очагах воспаления,
что способствует генерализации инфекции. Коагу-лазная активность проявляется при температуре ниже 25 °С, а фибринолитическая - выше 30 °С. За счет способности связываться с экстрацеллюляр-ным матриксом Pla обладает адгезивной активностью в отношении ряда эукариотических клеток. Установлена способность активатора плазминогена обеспечивать инвазивность бактерий в отношении нефагоцитирующих эукариотических клеток. Про-теазная активность обеспечивает способность Pla гидролизовать C3 компонент комплемента и цито-кины такие, как фактор некроза опухолей а, интерферон у интерлейкин 8 и протеин 1 хемотаксиса моноцитов, а также посттрансляционную деградацию белков Yops [1, 10].
Недавно было показано, что для проявления способности Pla активировать плазминоген [9, 12] необходимо взаимодействие с R-формой ЛПС, образуемой клетками Y. pestis [7], а O-боковые полисахаридные цепи, характерные для S-формы ЛПС, синтезируемой Yersinia pseudotuberculosis и Salmonella enterica, ингибируют активаторную способность [9, 12]. В то же время показано, что изменение собственной структуры ЛПС Y. pestis - различный состав кора (олигосахарида) по терминальным остаткам са-
Использованные в работе штаммы и плазмиды
Таблица 1
Штамм I нлазмида
Характеристика
Источник I ссылка
Y. pestis EV линии НИИЭГ
Y. pestis EVAYPO0054: :kan Y. pestis EVAYPO0057::kan Y. pestis EVAYPO2063: :kan
Y. pestis EV11M
Y. pestis EV11MpKP pKP
pFra+, pCD+, pPst+, Apgm; вакцинный штамм с типичной структурой ЛПС
pFra+, pCD+, pPst+, Apgm, Кт11; мутант вакцинного штамма EV, дефектный по гену, кодирующему LD-гептозилтрансферазу I
pFra+, pCD+, pPst+, Apgm, Кт11; мутант вакцинного штамма Е^ дефектный по гену, кодирующему LD-гептозилтрансферазу II
pFra+, pCD+, pPst+, Apgm, Кт11; мутант вакцинного штамма Е^ дефектный по гену 1рхМ, также обозначаемому как msbB или ^ааЫ и кодирующему ацилтрансферазу LpxM, отвечающую за включение в липид А шестого жирно-кислотного остатка - лауриновой кислоты
pFra~ pCD~, рРзГ, Apgm; «глубокий Я-мутант» вакцинного штамма EV с предполагаемой мутацией по гену, кодирующему LD-гептозилтрансферазу I Производный от штамма EV11, несущий плазмиду рКР
р1а+, pst+, ріт+, тоЬ+; плазмида pPst из штамма EV с ген-блоком KmR из плазмиды риС4К, встроенным по сайту рестрикции PstI
Вакцина живая чумная (Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт, Россия) Авторская коллекция
Авторская коллекция
Авторская коллекция
[4, 7]
Настоящее исследование Авторская коллекция
II
I
^-D-GlcpNAc-(l ^3)-L-a-D-Hepp-(l ^3)-L-a-D-Hepp-(l ^5)-a-Kdop-(2^ |липид Л )
7 4 4
t t t
l l 2
Sugp2-(l ^7)-L-a-D-Hepp ^-D-Glcp Sugpl
III
Схематическое изображение структуры ЛПС Y. pestis:
8^2 - б-Б-галактоза или Б-глицеро-а-Б-манно-гептоза; б-Б-ОІсКЛе - б-Б-глюкозамин; б-Б-ОІе - б-Б-глюкоза; ь-а-Б-Ыер - ь-глицеро-а-Б-манно-гептоза; I, II или III - номера гептоз в коре; 8^1 - 3-деокси-а-Б-манно-окт-2-улозоновая кислота (а-Ыо) или Б-глицеро-а-Б-тало-окт-2-улозоновая кислота (а-Ко); | липид А~1 - у штаммов с ЛПС «дикого» типа представлен тетра-, пента-и гексаацильными формами, а у lpxM мутанта гексаацильные формы липида А не образуются
харов - может влиять на проявление целого ряда биологических свойств возбудителя чумы, например, на изменение способности противостоять защитным факторам врожденного иммунитета [4].
Целью настоящего исследования было выяснение возможного влияния структуры кора и липида А ЛПС Y. pestis на плазмокоагулазную и фибри-нолитическую активности Р1а.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. Использованные в работе штаммы Y. pestis и плазмиды представлены в табл. 1.
Электростимулируемую трансформацию плазмиды рКР в клетки Y. pestis ЁУ11М проводили в модификации С.А.Еремина с соавт. [2].
Определение фибринолитической и плазмокоа-гулазной активностей Y. pestis проводили с использованием донорской плазмы человеческой крови в соответствии с рекомендациями [3] при температуре 37 и 28 °С соответственно.
Результаты и обсуждение
Целый ряд патогенных бактерий взаимодействует с протеолитической плазминоген-плазмин системой млекопитающих. У многих из них на клеточной поверхности присутствуют рецепторы, иммобилизующие плазмин(оген), что способствует активации последнего активаторами плазминогена млекопитающего. Другие бактерии способны влиять на регуляцию системы млекопитающих путем деградации циркулирующих ингибиторов плазмина, а также изменения уровня экспрессии активаторов плазминогена и активации его ингибиторов. Установлено, что воздействие на систему плазминогена приводит к повреждению экстрацеллюлярного матрикса и последующей диссеминации бактерий [8, 10]. До последнего времени при изучении взаимодействия бактерий с системой плазминоген-плаз-мин млекопитающих основное внимание уделяли каскаду взаимодействий отдельных факторов системы. Показано, что активность Р1а модулируется структурой ЛПС штамма продуцента. В случае присоединения к кору О-боковых полисахаридных цепей Р1а теряет способность активировать плазмино-ген [9, 12]. Влияние отдельных структурных компонентов собственного ЛПС возбудителя чумы на плазмокоагулазную и фибринолитическую актив-
ности не изучено.
Результаты оценки влияния структуры кора и липида Л ЛПC (рисунок) на плазмокоагулазную и фибринолитическую способности возбудителя чумы представлены в табл. 2.
^особносте возбудителя чумы «дикого» типа образовывать различные сочетания тетра-гексааци-льных форм ЛПC в зависимости от условий культивирования [б, 7] позволяет предположить, что изменение степени ацилирования в этих пределах не должно оказывать угнетающее влияние на биологическую активность Pla. Действительно, результаты экспериментов (табл. 2) свидетельствуют, что снижение степени ацилирования липида Л в результате мутации по гену lpxM не влияет на плазмокоагулаз-ную и фибринолитическую активности Pla.
C другой стороны, редуцированные формы кора, образуемые использованными в нашем исследовании мутантами, несвойственны клеткам Y. pestis «дикого» типа [7]. Показано, что у R-мутантов Escherichia coli меняется процесс тримеризации по-ринов, расположенных на поверхности микробной клетки [ll], а фолдинг ряда белков внешних мембран является ЛПC-зависимым [5]. Pla же является одним из представителей омпинов - белков внешних мембран энтеробактерий с функциями проте-аз/адгезинов [8], и логично предположить, что зна-
Таблица 2
Взаимосвязь структуры ЛПС с плазмокоагулазной и фибринолитической активностями
Плазмо- Фибрино-
Єтруктура ЛПЄ коагулазная литическая
активность активность
Sug2lGlcNAClGlClHepзSug1lKdOl-липид Д^б ++++ ++++
Sug2lGlcNAclGlClHepзSug1lKdOl-липид Л4.5 ++++ ++++
GlClHeplSugllKdol-липид Л^б - -
SugllKdol-липид Л4_б - -
Примечания: 1. Подстрочные цифры указывают количество остатков сахаров в коре или жирных кислот в липиде А. Тетраациль-ные формы липида А содержат по четыре остатка 3-гидроксимиристиновой кислоты [4 х 14:0(3-OH)], пентаацильные -дополнительно содержат остаток лауриновой кислоты (тетраацильная форма + 12:0), а гексаацильные - пальмитолеиновой кислоты (тетраа-цильная форма + 12:0 + 16:1) [7].
2. Sug2 - ^-Б-галактоза или Б-глицеро-а-Б-манно-гептоза;
GlcNAc - б-Б-глюкозамин; Glc - б-Б-глюкоза; Hep - L-глицеро-а-Б-манно-гептоза; Sugl - 3-деокси-а-Б-манно-окт-2-улозоновая кислота или Б-глицеро-а-Б-тало-окт-2-улозоновая кислота; Kdo - 3-деокси-а-Б-манно-окт-2-улозоновая кислота.
чительное изменение размера (структуры) ЛПC не только в сторону увеличения [9, 12], но и уменьшения может изменить фолдинг и, соответственно, биологические свойства Pla. Как мы и предполагали, редукция кора ЛПC Y. pestis приводила к исчезновению плазмокоагулазной и фибринолитической активностей у мутантов с нарушениями сборки олигосахарида на стадии присоединения первой и второй L-a-D-Hep.
Таким образом установлено, что укорочение коровой части ЛПC Y. pestis ведет к исчезновению фибринолитической и плазмокоагулазной активностей, тогда как снижение степени ацилирования липида Л не влияет на эти свойства.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 0б-04-49280-а.
шигаК литерлтуры
1. Анисимов Л.П. // Мол. генет. - 2002. - № 3. - C. 323. - 2. Еремин C.A., Дроздов И.Г., Ежов И.Н. и др. // Генет., микробиол. и совершенствование методов лаб. диагн. особо опасных инф. - Cаратов, 1991. - C. 55-б2. - 3. Руковод -ство по профилактике чумы / Под ред. Н.И.Николаева. - Cара-тов, 1972. - 200 с. - 4. Anisimov A.P., Dentovskaya S.V., Titareva G.M. et al. // Infect. Immun. - 2005. - Vol. 73. -P. 7324-7331. - 5. De Cock H., Brandenburg K., Wiese A. et al. // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - P. 5114-5119. - б. Ka-wahara K., Tsukano H., Watanabe H. et al. // Infect. Immun. - 2002. - Vol. 70. - P. 4092-4098. - 7. Knirel Y.A., Lind-
ner B., Vinogradov E.V. et al. // Biochemistry. - 2005. -Vol. 45. - P. 1731-1743. - 8. Kukkonen M., Korhonen T.K. // Int. J. Med. Microbiol. - 2004. - Vol. 294. - P. 7-14. -9. Kukkonen M., Suomalainen M., Kyllonen P. et al. // Mol. Microbiol. - 2004. - Vol. 51. - P. 215-225. - 10. Lah teen-maki K., Kuusela P., Korhonen T.K. // FEMS Microbiol. Rev. - 2001. - Vol. 25. - P. 531-552. - 11. Laird M.W., Klo-ser A.W., Misra R. // J. Bacteriol. - 1994. - Vol. 176. -P. 2259-2264. - 12. Pouillot F., Derbise A., Kukkonen M. et al. // Microbiology. - 2005. - Vol. 151 (Pt 11). - P. 3759-3768.
S.V^entovskaya, M.E.Platonov, I.V.Bakhteyeva, A.P.Anissimov
The Presence of the Complete Lipipolysaccharide Core Structure is Necessary for the Activation of Yersinia pestis Plasminogen
State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk
Lipopolysaccharide (LPS) S-form has previously been shown to inhibit plasminogen activator (Pla) potency in Yersinia pestis. We tried to comparatively estimate the fibrinolytic and plasmocoagulase Pla activities in Y. pestis isolates carrying mutations in the genes responsible for LPS biosynthesis as contrasted to those of the original strain. Shortening of the core LPS was shown to result in the loss of the activities while reduced levels of lipid A acylation produced no effect on the fibrinolytic and plasmocoagulase activities.
Key words: Y. pestis, fibrinolytic and plasmocoagulase activities,
LPS.
Поступила 14.09.06.
УДК 616.932:616-097
С.П.Заднова, О.А.Волох, И.М.Крепостнова, Е.Ю.Щелканова, Л.Ф.Ливанова, Т.Л.Захарова,
И.А.Шепелев, С.А.Еремин, Н.И.Смирнова
ИЗУЧЕНИЕ ПРОДУКЦИИ ОСНОВНЫХ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ И ИММУНОГЕННОСТИ РАЗЛИЧНЫМИ ШТАММАМИ VIBRIO CHOLERAE ПРИ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Для получения в очищенном виде основных факторов патогенности и иммуногенности - холерных токсинов I и II типов, В-субъединицы холерного токсина II типа, токсин-корегулируемых пилей адгезии, а также О1 и О139 антигенов было проведено малообъемное культивирование сконструированных ранее штаммов V. cholerae О1 (классического и эльтор биоваров), О139, не О1/не О139 серогрупп в условиях производства. В результате отобраны штаммы-продуценты протективных антигенов, предпочтительные для производства и определены оптимальные условия их культивирования для активной экспрессии указанных белков и липополисахаридов, которые будут использованы при создании многокомпонентной диагностической тест-системы.
Ключевые слова: штаммы-продуценты V. cholerae, протективные антигены, малообъемное культивирование.
Холера - острое инфекционное заболевание, вызываемое Vibrio cholerae и широко распространенное в различных странах Азии и Африки. В настоящее время в связи с интенсивным развитием туризма и миграцией населения существует реальная возможность ее завоза на территорию Российской Федерации, о чем свидетельствуют вспышки заболевания в различных регионах страны (Дагестан и Чеченская Республика, 1994; Дагестан, 1998; Приморский край и Cаxалинская область, 1999; Астраханская область, Челябинск, 2000; Республика Татарстан, 2001; Краснодарский край, Башкорто-
стан, 2004 и т. д.) [3].
Как известно, в процессе эволюции V. cholerae сформировалось три эпидемически опасных варианта - холерные вибрионы О1 серогруппы классического и эльтор биоваров (сероваров Инаба, Огава, Гикошима) и холерные вибрионы О139 серогруппы [9]. Основными факторами патогенности и иммуно-генности холерных вибрионов являются секретируе-мый в среду выращивания или наружу холерный токсин (ХТ), состоящий из А-субъединицы, отвечающей за токсическую активность молекулы, и пяти иммуногенных В-субъединиц, а также располо-
