CC BY
1311. Покровский В.В. ВИЧ-инфекция и СПИД: национальное руководство. М., 2013.
12. Покровский В.В., Ладная Н.Н., Буравцова Е.В. ВИЧ-инфекция. Информационный бюллетень. М., 2010.
13. Покровский В.В., Юрин О.Г., Беляева В.В. и др. Клиническая диагностика и лечение ВИЧ-инфекции. М., 2001.
14. Рахманова А.Г., Виноградова Е.Н., Воронин Е.Е. и др. ВИЧ-инфекция. СПб, 2004.
Поступила 12.06.05
Контактная информация: Пузырева Лариса Владимировна, к.м.н., 644050,Омск, ул. Химиков, 8А, р.т. (3812) 40-45-20
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
О.В.Дуванова, Б.Н.Мишанькин, А.С.Водопьянов, В.М.Сорокин ^АЦЕТИЛ-р^-ГЛЮКОЗАМИНИДАЗА ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ Ростовский-на-Дону противочумный институт
Цель. Изучить ^ацетил-Р^-глюкозаминидазу (хитобиазу) (ЕС 3.2.1.30) у штаммов холерных вибрионов О1/неО1серогрупп различного происхождения, являющуюся составной частью хитинолитического комплекса с учетом объекта выделения и эпидемиологической значимости штаммов. Материалы и методы. Культуры штаммов Vibrio chole-rae О1/неО1серогрупп получены из музея живых культур Ростовского НИПЧИ. Анализ ферментативной активности проведен на флюоресцентном спектрофотометре Hitachi F-2500 с использованием лицензионного программного обеспечения FL Solutions. При характеристике фермента привлекали базы данных NCBI. Результаты. Обнаружена, очищена колоночной хроматографией, изучена и охарактеризована по ряду физико-химических и биологических свойств ^ацетил-Р^-глюкозаминидаза у штаммов Vibrio cholerae О1/неО1серогрупп. Сравнительный компьютерный анализ аминокислотной последовательности ^ацетил-Р^-глюкозаминидаз холерного вибриона (ген VC2217), Serratia marcescens и др. позволил отнести фермент из V.cholerae к гликозилгидролазам (хитобиазам) семейства 20 и классифицировать согласно номенклатуре ферментов как КФ 3.2.1.30. Заключение. Впервые изучена и охарактеризована N-ацетил-Р-D-глюкозаминидаза у холерных вибрионов О1/неО1серогрупп различного происхождения и эпидемиологической значимости, учавствующая в утилизации хитина, а также показана ее возможная роль в биологии возбудителя холеры.
Журн. микробиол., № 2, С. 41—48
Ключевые слова: Vibrio cholerae , штаммы, ^ацетил-Р^-глюкозаминидазная активность, 4-метилумбеллиферил^-ацетил-Р-глюкозаминид (4-MUF. GlcNAc)
O.V.Duvanova, B.N.Mishankin, A.S.Vodopianov, V.M.Sorokin N-ACETYL-p-D-GLUCOSAMINIDASE OF VIBRIO CHOLERAE Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control, Russia
Aim. Study N-acetyl-P-D-glucosaminidase (chitobiase) (EC 3.2.1.30) in strains of Vibrio cholerae of O1/non-O1 serogroups of various origin, that is a component of chitinolytic complex taking into account object of isolation and epidemiologic significance of strains. Materials and methods. Cultures of V.cholerae O1/non-O1 serogroup strains were obtained from the museum of live culture of Rostov RIPC. Enzymatic activity analysis was carried out in Hitachi F-2500 fluorescent spectrophotometer using FL Solutions licensed software. NCBI databases were used during enzyme characteristics. Results. N-acetyl-P-D-glucosaminidase in V.cholerae O1/non-O1 serogroup strains was detected, purified by column chromatography, studied and characterized by a number of physical-chemical and biological properties. Comparative computer analysis of
amino acid sequence of N-acetyl-P-D-glucosaminidases of V.cholerae (VC2217 gene), Serratia marcescens etc. has allowed to attribute the enzyme from V.cholerae to glycosyl-hydrolases (chi-tobiases) of family 20 and classify it according to enzyme nomenclature as EC 3.2.1.30. Conclusion. N-acetyl-P-D-glucosaminidase in V.cholerae of O1/non-O1 serogroups of various origin and epidemiologic significance, participating in chitin utilization was studied and characterized for the first time, and its possible role in biology of cholera causative agent was shown.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 2, P. 41-48
Key words: Vibrio cholerae, strains, N-acetyl-P-D-glucosaminidase activity, 4-methylumbellifero-ne-N-acetyl-P-D-glucosaminide (4-MUF. GlcNAc)
ВВЕДЕНИЕ
Возбудитель холеры даже в наше время продолжает представлять серьезную угрозу для здоровья человека. Особенности географического расположения России, глобализация и усиление интеграционных процессов с разными странами, интенсификация миграционных потоков населения являются предпосылками для возможного заноса холеры в Российскую Федерацию из стран с эндемичными очагами.
Учитывая ведущую роль водного фактора в распространении холеры, можно полагать, что продолжительность сохранения и свойства холерных вибрионов, включая их генотип, во многом зависят от состояния физико-химических и гидробиологических показателей воды открытых водоемов, качественной структуры и количественного содержания в них фито- и зоопланктона, факторов, определяющих особенности конкретной экосистемы. Для вибрионов характерна высокая адаптационная пластичность, которая связана с их жизненным циклом, с одной стороны, и функционированием мощного ферментативного хитинолитического комплекса — с другой [2]. В деградации хитина принимают участие, по крайней мере, шесть белков (три хитиназы, глюкозамин-связывающий белок, дезацетилаза олигосахаридов хитина, спиндолин-подобный хитин-связывающий белок) с использованием системы секреции второго типа и N-ацетилглюкозаминидазы, которая к настоящему времени у холерного вибриона не изучена и данные о ней носят предположительный характер, так как заимствованы из работ с использованием Vibrio harvey, Vibrio alginolyticus, Vibrio furnissii, Vibrio vulnificus и Vibrio parahaemolyticus. Тем не менее, сведения о ферменте могут оказаться полезными для выяснения механизма его действия, возможного участия в биологии и экологии холерных вибрионов.
Цель работы — изучить ^ацетил-Р^-глюкозаминидазу (хитобиазу) (ЕС 3.2.1.30) у штаммов холерных вибрионов О1/неО1серогрупп, являющуюся составной частью хитинолитического комплекса с учетом объекта выделения и эпидемиологической значимости штаммов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В зависимости от решаемой в работе задачи использовали разные группы штаммов: 6 штаммов V. cholerae O1 классического (ctx+ tcp+); 6 дефектных по синтезу токсина и токсинкорегулируемых пилей штаммов V. cholerae O1 эльтор (ActxAtcp), выделенных из воды поверхностных водоемов; 12 штаммов V. cholerae О139 серогруппы, из которых 6 (ctx+ tcp+) были выделены из клинического материала, а 6 атоксигенных (ActxAtcp) — из проб воды поверхностных водоемов; 6 штаммов V. cholerae non O1/nonO139 (ctx+ tcp+, Actx tcp+, ActxAtcp), выделенных из клинического материала; 6 атоксигенных
(ActxAtcp) — из органов рыб, выловленных в акватории Азовского моря. Штамм Р-5879 биовара эльтор (ctx+ tcp+) использовали в качестве положительного контроля, штамм Escherichia coli QD5003 — в качестве отрицательного при определении ^ацетил^^-глюкозаминидазы. Штаммы получали из музея живых культур Ростовского НИПЧИ, где их хранили в лиофилизи-рованном состоянии. Для культивирования микроорганизмов использовали агар Мартена (рН 7,6), Хоттингера (рН 7,2) и эритрит-агар (рН 7,2). Ферментативную активность у холерных вибрионов выявляли качественно [7] и количественно с применением флуорогенного субстрата 4-метил-умбеллиферил-^ацетил^^-глюкозаминида (4-MUF. GlcNAc, Serva). Результат реакции оценивали на флюоресцентном спектрофотометре Hitachi F-2500 с использованием лицензионной программы FL Solutions. Измерение флюоресценции опытной пробы относительно контроля (4-MUF. GlcNAc) проводили в кювете из кварцевого стекла объемом 1 см при эмиссии 495 и экстинкции 365 нм. Количество (мкг) образовавшегося 4-метилумбеллифе-рона в результате отщепления от субстрата (4-MUF. GlcNAc) находили по калибровочной кривой, которую строили с использованием коммерческого препарата — 4-метилумбеллиферона (Serva). Активность выражали в мкг метилумбеллиферона/109 м.к./мл/час, отщепленного от субстрата 4-MUF. GlcNAc клетками холерного вибриона за 1 час инкубации при 37 или 28°С. Антимикробную активность очищенного препарата N-ацетил^-D-глюкозаминидазы исследовали в отношении штаммов ряда гетерологичных микроорганизмов: Micrococcus luteus, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis EV, Escherichia coli HB101 и E.coli QD5003. Для этого на поверхность чашек с агаром Хоттингера (рН 7,2) и эритрит-агаром засевали 109 микробных клеток по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича и после распределения культуры шпателем устанавливали металлические колодцы диаметром 5 мм, в которые вносили испытуемый образец препарата в концентрации 0,05 — 0,7 мкг белка на пробу. Учет результатов проводили на 2 — 3 сутки роста при 37°C.
Для выделения и очистки фермента выращенные в течение 24 часов на агаре Мартена при 37оС и смытые физиологическим раствором клетки штамма V. cholerae eltor О1 18950 (ActxAtcp) осаждали центрифугированием на холоде при 6000 об/мин. Клетки разрушали механическим растиранием с песком, и после удаления детрита (10000 об/мин) лизаты центрифугировали при 105 000 х g 1 час при 4°C (ротор Sorvall AH 627, центрифуга модели Beckman L5-50В). Надосадочную жидкость концентрировали в 2 — 4 раза ультрафильтрацией (камера 10 РА, мембрана РМ 30) в системе Amicon. Полученный концентрат использовали для выделения и очистки ^ацетил^^-глюкозаминидазы с помощью гель-фильтрации через колонку с сефадексом G-100 (37х2 см) (Whatman, Англия), уравновешанную 0,01 М ацетатным буфером рН 6,0. Активные фракции объединяли и хроматографировали на фрактогеле TSK DEAE-650 (21х2 см) (Merck). Белок элюировали 0,2 М раствором NaCl, от которого избавлялись последующим диализом. Фракции собирали по 5 мл и проверяли на ферментативную активность, используя в качестве субстрата 4-метилумбеллиферил-^ацетил^-глюкозаминид (4-MUF. GlcNAc, Sigma). Белок определяли по методу Лоури или с использованием флюориметра Qubit TM фирмы Invitrogen (США).
Сыворотку получали четырехкратной внутримышечной иммунизацией кроликов по 0,05 мг белка в неполном адьюванте Фрейнда (Calbiochem) c двухнедельными интервалами.
Наличие гена ^ацетил-Р^-глюкозаминидазы у вибрионов тестировали в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью сконструированных прай-меров: For:GGTTAACCATAAAGCGCTGAAC; Rev:TTGACCATCCAGTG AGTATTGC, размер фрагмента составил 193 п.н. Отжиг праймеров проводили при 60°С, предварительная денатурация — при 94°С 2 минуты, 40 циклов 94°С — 20 секунд, 60°С — 20 секунд, 72°С — 20 секунд и заключительная элонгация при 72°С — 2 минуты. Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами [1] с использованием t-критерия Стьюдента и программы Statistica 6.0.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Известно, что большая группа генов, непосредственно участвующих в ре-минерализации хитина, образует так называемый хитинолитический комплекс. Часть генов этого комплекса мы охарактеризовали с помощью ПЦР с использованием оригинальных праймеров (это гены хитиназ, GlcNAc — связывающего белка, хитодекстриназы, хитопорина, хитинчувствительной гистидин-киназы и хитин-регулируемых пилей) [2], кроме одного гена VCA0140 (хитинсвязывающий белок), праймеры к которому взяты из [3]. Все штаммы О1 и О139 серогрупп клинического происхождения несли полный набор изучаемых генов хитиназного комплекса. Однако довольно пестрая картина результатов в ПЦР была выявлена у вибрионов водного происхождения. И хотя у всех исследованных водных штаммов V. cholerae O139 отсутствовали гены VC1073 (хитиназа), VC1952 (внеклеточная хитиназа, ChiA1), VCA0811 (GlcNAc-связывающий белок, glpA), VC0972 (хитопорин), VC2324 (ChiRP-хитин-регулируемые пили, ген PilA), тем не менее, это не отразилось на ПЦР-детек-ции ^ацетил-Р^-глюкозаминидазы, которая у них регистрировалась довольно четко.
Прежде чем приступить к выделению и характеристике ^ацетил-Р^-глюкозаминидазы, был проведен биоинформационный анализ. Поиск в GenBank показал, что в нем содержится информация о трех Р-гексозаминида-зах (гликозилгидролазах, К.Ф.3.2.1.52), находящихся на первой хромосоме холерного вибриона. Они наделены разным молекулярным весом, зарядом, принадлежат к разным семействам гликозилгидролаз, что указывает на их индивидуальность. Выяснено, что ген VС 2217 из штамма Vcholerae El Tor 16961, детерминировал белок из 883 аминокислотных остатков мол. массой 97,9 кДа. Продукт этого гена является гликозилгидролазой семейства 20, а домен 2 проявлял сходство на 57,2% с геном NghA, кодирующим N-ацетил-P-D-глюкозаминидазу Yersinia pseudotuberculosis 1123.
Среди различных модельных систем важное место занимает Serratia marc-escens, у которой осуществлено клонирование и секвенирование гена chb ^-ацетил-Р^-глюкозаминидазы). Тщательно проведенные исследования позволили Tews I. et al. [8] выявить в белке структурно-функциональные домены, широко используемые другими исследователями при анализе свойств и идентификации вновь выделяемых белков. Фермент является мономером, состоит из 885 аминокислотных остатков, имеет мол. массу около 98,1 кДа и лидерную последовательность из 27 аминокислот.
При сравнительном компьютерном анализе аминокислотных последовательностей ^ацетил-Р^-глюкозаминидазы S. marcescens и продукта гена VC2217 оказалось, что совпадение между ними составляет 54% и сходство 12,65%. Такая высокая степень близости (66, 65%) белков двух бактерий позволила идентифицировать у фермента из холерного вибриона активный центр
из двух консервативных аминокислот Asp539 и Glu54o. Обнаружены также консервативные для ß-N-глюкозаминидаз остатки Asp346, Arg349, Asp378, Asp379,Trp6i6, Trp685 и Trp737, участвующие в связывании субстрата в фермент-субстратном комплексе. Белок гена VC2217 — гликопротеин с тремя сайтами гликозилирования. Высокая степень сходства ферментов из Serratia marcescens и холерного вибриона проявилась и при изучении их структурных доменов. Выполненный биоинформационный анализ позволил заключить, что продукт гена VC2217 является ^ацетил^^-глюкозаминидазой (КФ 3.2.1.30), участвующей в гидролизе хитина, и определил направление наших усилий по ее выделению, очистке и изучению некоторых свойств.
Одна из задач состояла в обнаружении фермента у холерных вибрионов, выделенных из различных источников с разным генотипом. В результате проведенного исследования установлено, что у всех штаммов V. cholerae О1 классического и эльтор биоваров, V. cholerae О139, non O1/nonO139, выделенных из различных источников и с разным набором детерминант вирулентности (ctx+ tcp+, Actx tcp+, ActxAtcp), ^ацетил^^-глюкозаминидазная активность была четко зарегистрирована как качественным, так и количественным методами. Это позволило не только обнаружить фермент у всех штаммов, но и продемонстрировать вариабельность уровня ^ацетил^^-глюкозаминидаз-ной активности у штаммов в зависимости от объекта выделения и набора детерминант вирулентности. Обнаружено, что условия выращивания (температура) и индивидуальные особенности штаммов вибрионов влияли на уровень активности ^ацетил^^-глюкозаминидазы. Так, клетки, выращенные на агаре Мартена при 28°С, обладали более высокой активностью по сравнению с выращенными при 37°С. Выявленное увеличение активности ^ацетил^-D-глюкозаминидазы при понижении температуры культивирования у штаммов V. cholerae O1 и 0139 серогрупп, изолированных из воды, позволило предположить участие этого фермента в выживаемости/сохраняемости холерных вибрионов во внешней среде в условиях возможного контакта с хитинсо-держащими объектами. Полученные данные могут указывать на эволюционно сложившуюся важность этого энзима для вибрионов различного происхождения. Клетки штаммов V. cholerae O1 эльтор биовара и 0139 серогруппы (ActxAtcp), выделенные из объектов окружающей среды (вода поверхностных водоемов) и выращенные на агаре Мартена при 28°С, обладали большей ^ацетил^^-глюкозаминидазной активностью по сравнению со штаммами, выращенными при 37°С. Для штаммов V. cholerae O1, выращенных при 28°С, она составила в среднем 5,99±0,65 мкг 4-метилумбеллиферона/109 м.к./мл/ час, а для штаммов V. cholerae 0139 серогруппы —7,76±5,14 мкг 4-метилум-беллиферона/109 м.к./мл/час. В условиях культивирования при 37°С ферментативная активность для эльтор вибрионов (ActxAtcp) составила в среднем — 3,57±0,92 мкг 4-метилумбеллиферона/109 м.к./мл/час и для штаммов V. cholerae O139 — 4,75±2,73 мкг 4-метилумбеллиферона/109 м.к./мл/час соответственно (при р=0,05). Исключение составили штаммы Р-16072 (ctx+ tcp+) и Р-17781 (ActxAtcp), у которых отличий обнаружено не было, возможно, из-за индивидуальных особенностей штаммов. Подобная тенденция отсутствовала у штаммов вибрионов классического биовара (ctx+ tcp+), активность которых составила в среднем 7,81±3,22 при выращивании в условиях 28°С и 8,92±3,10 мкг 4-метилумбеллиферона/109 м.к./мл/час — при 37°С соответственно, что может свидетельствоват о большей экологической пластичности штаммов V. cholerae O1 эльтор и 0139 серогрупп в условиях водного биоценоза. Интересно отметить, что у штаммов V. cholerae O139 (ctx+ tcp+), изолированных из кли-
Этап очистки Белок, мг/мл Удельная активность, мкг мети-лумбеллиферона/ мг белка
Клеточный экстракт 2,6 16,0
Фракция после центрифу- 1,6 44,25
гирования при 105 000 g
Гель-фильтрация через 1,3 51,67
сефадекс G-100
Хроматография 0,5 53,0
на TSK-DEAE 650
нического материала и выращенных Очистка ^вдти^р^пгомтаттд^ыюкжт™ в условиях 28°С, было обнаружено штамма V cholerae 18950 увеличение ферментативной активности, что можно рассматривать как выработанный адаптационный механизм низкотемпературной регуляции метаболизма, направленный на реализацию стратегии выживания вибрионов в новых экологических условиях.
Не менее интересным объектом оказалась группа штаммов V. cholerae
non O1/nonOl39, часто выделяемых на различных территориях Российской Федерации. ^ацетил-Р^-глюкозаминидазная активность четко проявлялась у всех исследованных штаммов холерных вибрионов не О1/ не О139 серогрупп, выделенных из различных источников с разным набором детерминант вирулентности (ctx+ tcp+, Actx Atcp, Actx tcp+), а также у штаммов Actx tcp+ из клинического материала и содержащих профаг preCTX. В ходе анализа полученных результатов выявлено, что активность ^ацетил-Р^-глю-козаминидазы у штаммов V. cholerae non O1/non O139 из органов рыб, выловленных в акватории Азовского моря, составила в среднем 4,39±0,53 мкг метилумбеллиферона/109 м.к./мл/час. Данные были близки показателям этой активности у водных штаммов V. cholerae О139 серогруппы. Однако активность ^ацетил-Р^-глюкозаминидазы у штаммов V. cholerae non O1/non O139, выделенных от людей, оказалась выше и составила в среднем 19,7±7,35 мкг метилумбеллиферона/109м.к./мл/час (при р=0,05), что подчеркивает важность изучения роли этого фермента в биологии штаммов клинического происхождения.
Несмотря на нестабильность, ^ацетил-Р^-глюкозаминидазу удалось очистить в 4 раза с удельной активностью 53 мкг метилумбеллиферона/мг белка (табл.), что позволило охарактеризовать его некоторые физико-химические свойства. Согласно данным гель-электрофореза в 10% ПААГ геле (рис.), молекулярная масса очищенного мономера находилась в пределах 85 — 117 кДа, что было близко расчетным данным компьютерного анализа (97,9 кДа). При контакте с раствором субстрата 4-метилумбеллиферил-^ ацетил-Р-глюкозаминида регистрировали интенсивную флюоресценцию геля в районе расположения полосы фермента.
Оптимальным для действия фермента оказался рН, равный 6,0 и температура 37°C, однако прогревание энзима в течение 15 мин при 50°C сопровождалось снижением его активности на 78%. При определении чувствительности фермента к дей- Результаты гель-электрофореза в 10%
ствию реагентов различной химической nAAr-SDS Препарага очищенноГо белКа ^ ^ _ „ ^-ацетил-В^-глюкозаминидазы (лунка 2)
природы выявлено ингибирующее дей- холерного вибриона. В лунке 1 - маркеры
ствие ионов цинка, марганца, меди и же- молекулярных масс.
леза. Присутствие в пробе ЭДТА и SDS (1 мМ) значительно снижало активность фермента. Вещества, нарушающие конформацию молекулы белка (8М мочевина и азид Na), вызывали полную инактивацию фермента. В концентрациях 0,05 — 0,1 М NaCl активировал ферментативную активность на 20%, а в концентрации 2 М подавлял на 45%. Активность ^ацетил-ß-D-глюкозаминидазы ингибировалась на 50% после 15-минутной инкубации препарата с 1,5 мМ (250 мкг/мл) ацетилцистеина. Концентрация в 0,36 — 0,75 мМ подавляла активность на 25 — 30%, тогда как большая концентрация препарата (3 мМ и выше) полностью ингибировала активность фермента, что объясняется наличием в структуре его каталитического домена четырех остатков цистеина.
Константа Михаэлиса-Ментен (Km) составила 0,03 мкМ, а Vmax — 0,316 мкМ. При изучении субстратной специфичности очищенного препарата фермента использовали субстраты 4-метилумбеллиферил^^-глюкопиранозид, 4-метилумбеллиферил-№цетил^^-глюкозаминид, 4-метилумбеллиферил-ß-D-галактопиранозид. Активность была обнаружена только в отношении 4-MUF. GlcNAc, хотя на разных этапах очистки в пробах четко регистрировалась галактозидазная активность, что может указывать на присутствие ß-N-гексозаминидазы (КФ 3.2.1.52, ген VC0613). В результате очистки удалось получить препарат с активностью только ^ацетил^^-глюкозаминидазы. Полученная к ферменту кроличья антисыворотка образовывала линии преципитации с исходным препаратом фермента.
Анализ полученных результатов показал, что испытуемый препарат обладал антибактериальным действием, подавляя в низких концентрациях рост ряда лабораторных штаммов E.coli HB101, E.coli QD5003, M. luteus, S. typhimurium, Y.pestis EV. Диаметр зон ингибирования роста был различным (3 — 10 мм), максимально выраженный антибактериальный эффект проявлялся в отношении M. luteus и S. typhimurium. Можно полагать, что препарат ^ацетил^^-глюкозаминидазы может быть активен в отношении и других микроорганизмов.
ОБСУЖДЕНИ Е
В результате проведенного исследования у холерных вибрионов 01/не01 серогрупп различного происхождения независимо от набора детерминант патогенности обнаружена, изучена и охарактеризована ^ацетил^^-глюкозаминидаза (хитобиаза), являющаяся составной частью хитинолитиче-ского комплекса. Наиболее высокую активность при этом наблюдали у штаммов V. cholerae 01 и O139 серогрупп с генотипом Actx Atcp из объектов окружающей среды при культивировании в условиях 28°С. Полученные результаты могут указывать на значимость этого фермента для выживания и сохранения холерных вибрионов в объектах окружающей среды как в воде поверхностных водоемов, так и в морской рыбе в условиях контакта с хитин-содержащими объектами. У выделенных от людей штаммов V. cholerae non O1/ non O139, 01 классического биовара в условиях выращивания при 37°С наблюдали тенденцию к повышению активности фермента. Отдельно стоит вопрос о причинах неодинаковой активности у штаммов различного происхождения, которые могут быть связаны с особенностями регуляции синтеза или активности фермента, что предполагает необходимость изучения особенностей структуры генов и прилегающих к ним промотерных областей.
Выявленная антибактериальная способность фермента представляет интерес, так как перекликается с предположением Kaplan J.B. et al. [6] о возмож-
ном участии, например, N-ацетилглюкозаминидазы из Actinobacillus actino-mycetemcomitan в качестве фактора колонизации в явлении устранения биопленок других бактерий с целью освобождения поверхности для собственного укоренения в конкретной экологической нише. Найденное можно рассматривать в качестве материальной основы конкурентных возможностей холерных вибрионов в сложных механизмах их циркуляции в разнообразных природных условиях.
Проведен сравнительный компьютерный анализ аминокислотной последовательности ^ацетил-Р^-глюкозаминидазы холерного вибриона (ген VC2217), S. marcescens и др., который вместе с другими характеристиками позволил отнести фермент из V.cholerae к гликозилгидролазам (хитобиазам) семейства 20 и классифицировать согласно номенклатуре ферментов как КФ 3.2.1.30. Проведенное исследование позволило дополнить хитинолитический комплекс холерного вибриона ^ацетил-Р^-глюкозаминидазой, ферментом, играющим важную роль в сохранении, выживании, питании возбудителя во внешней среде. Полученные данные могут найти применение в прикладных и фундаментальных работах по изучению тонких механизмов колонизации кишечника, сохранения и формирования новых форм вибрионов в окружающей среде, лучше адаптированных в различных экологических нишах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., Медицинская литература, 1962.
2. Мишанькин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Водопьянов С.О., Романова Л.В., Водопьянов А.С., Дуванова О.В., Атарова Г.Т., Демьяненко С.В. Изучение хитинолитического комплекса холерного вибриона сероварианта О139. Биотехнология. 2010, 1: 32-40.
3. Bhowmick R., Ghosal A., Chatterjee N. S. Effect of environmental factors on expression and activity of chitinase genes ofvibrios with special reference to Vibrio choleraе. J. Appl. Microbiol. 2007, 103: 97-108.
4. Henrissat B., Bairoch A. New familities in the classification of glycosyl hydrolase based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 1993, 293:781-788.
5. Hunt D.E., Gevers D., Vahora N.M., Polz M.F. Conservation ofthe chitin utilization pathway in the Vibrionaceae. Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74 (1): 44-51.
6. Kaplan J.B., Ragunath C., Ramasubbu N., Fine D.H. Detachmеnt of Actinobacillus actino-mycetemcomitans biofilm cells by an endogenous в-hexosaminidase activity. J. Bacteriol. 2003, 185 (16): 4693-4698.
7. O'Brien M., Colwell R. A rapid test for chitinase activity that uses 4-methylumbelliferryl-N-acetyl-P-D-glucosaminide. Appl. Environ. Microbiol. 1987, 53 (7): 1718-1720.
8. Tews I., Vincentelli R., Vorgias C. N-acetylglucosaminidsae (chitobiase) from Serrata marcescens: gene sequence, and protein production and purification in Escherichia coli. Gene. 1996, 170: 63-67.
Поступила 10.08.15
Контактная информация: Дуванова Ольга Викторовна, к.б.н., 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького 117/40, р.т. (863)240-22-66
