CC BY
391
химический анализ проб почвы и воды, взятых в исследуемых точках, показал определенную взаимосвязь между степенью загрязнения и величиной генетических нарушений.
Проводимый эколого-генетическиймониторинг показывает, что используемые виды ракообразных непосредственно в природе могут служить в качестве биоиндикаторов для раннего выявления экологической напряженности. Такая экспресс оценка состояния окружающей среды является важнейшим элементом поддержания генетического здоровья человека.
Литература
1. Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены: скрининг и фармакологическая профилактика воздействий. М., Медицина, 1998. 328 C.
2. Биологический контроль окружающей среды: генетический мониторинг. Учебное пособие для студентов высш. проф. образования / Гераськин С.А., Са-рапульцева Е.И., Цаценко Л.В. и др., под ред. Гераськина С.А. и Сарапульцевой Е.И., М., Издательский центр «Академия», 2010. 208 c.
3. Барабанова Л.В., Даев Е.В., Дукельская А.В. Состояние генетического аппарата ракообразных как показатель загрязнения водной среды при ранней диагностике антропогенной нагрузки. Сборник материалов международной конференции «Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем II». СПб.: Любавич. 2011.c. 31-35.
4. Даев Е.В., Дукельская А.В., Барабанова Л.В. Цитогенетические методы индикации экологической напряженности в водных и наземных биосистемах. Экологическая генетика. 2014. T. XII. № 2. c.3-10.
УДК 612-092.4
1 7 1
Л.В. Громова , Е.И. Ермоленко , А.С. Алексеева ,
1 7 1
Ю.В. Дмитриева , М.П.Котылева ,Ю.Ю. Борщев ,
1 7
А.А. Груздков , А.Н. Суворов
ВЛИЯНИЕ ДВУХ ШТАММОВ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ЛАКТОБАКТЕРИЙ НА МИКРОБИОТУ И ПИЩЕВАРИТЕЛЬНУЮ ФУНКЦИЮ КИШЕЧНИКА ПРИ КОРРЕКЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИСБИОЗА У КРЫС2
2L.V. Gromova1, E.I. Ermolenko2, A.S. Alekseeva1, Y.V. Dmitrieva1, MP. Kotyleva2, J.J. Bor-
1 12
schev , A.A. Gruzdkov , A.N. Suvorov Influence of two strains of probiotic lactobacilli on the intestinal microbiota and digestive function in the correction of experimental dysbiosis in rats / 1I.P. Pavlov Institute of Physiology, RAS, Institute of Experimental Medicine, RAS, St. Petersburg
1 2 ФГБУН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, ФГБУ Институт
экспериментальной медицины РАН, Санкт-Петербург, lvgromo-
va@pavlov. infran. ru
Кишечная микробиота играет важную роль в функционировании организма человека и животных, участвуя, в частности, в защите организма от антигенов и токсических веществ, а также в его питании [1-6]. В последнее время широкое применение в клинической практике находят пробиотические препараты и лечебно-профилактические продуктына основе различных штаммов молочнокислых бактерий, выделенных из резидентной микрофлоры кишечника человека или животных или из некоторых пищевых продуктов [3,4,7,8]. Они способствуют быстрому восстановлению состава кишечной микробиоты и, как следствие, её функций, нарушенных при дисбиозах различного происхождения, в том числе, после применения антимикробных препаратов [2,3,4,7].
Цель настоящей работы состояла в том, чтобы на модели экспериментального дисбиоза у крыс сопоставить эффекты двух штаммов молочнокислых бактерий: Enterococcus faecium L3 и Lactobacillus fermentum Z в отношении коррекции кишечной микробиоты и мембранных пищеварительных ферментов, участвующих в углеводном и жировом обмене (мальтаза, щелочная фосфатаза).
Материал и методы
Работа выполнена на четырёх группах крыс-самцов Вистар (масса тела 180 - 220 г, n = 4 - 6 в каждой группе). Содержание, питание и уход за животными осуществляли в соответствии с требованиями Комиссии по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных при ФГБУН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН.
В ходе экспериментов крысам опытных групп (О1 и О2) ежедневно в течение 3 дней вводили внутрижелудочно антимикробные препараты, растворенные в 0.5 мл дистиллированной воды, а затем в течение 5 дней - пробиотики в таком же объёме. Животным первой контрольной группы (К1) тем же способом сначала вводили дистиллированную воду (вместо антибиотиков), а затем молоко. Во второй контрольной группе (К2) крысам сначала вводили антибиотики, а затем молоко.
В качестве антимикробных препаратов использовались ампициллин и мет-ронидазол, обладающие широким спектром действия. Препараты вводились одновременно в количестве: 15 мг (ампициллин) и 10 мг (метронидазол) на од-
745
но животное. Используемые дозы были нетоксичными.
В качестве пробиотиков применялись молочнокислые бактерии Enterococcus faecium L3 (патент РФ № 2220199) и Lactobacillus fermentum Z (патент РФ № 2412239), предназначенные для производства молочнокислых пищевых продуктов, а также для лечения и профилактики различных заболеваний. Пробиотики готовились в виде молочнокислых заквасок и вводились в дозе 8^КОЕ/мл, которая в пересчёте на массу тела крысы соответствует максимальной дозе, применяемой на людях в клинике.
В конце экспериментов у крыс отбирали пробы фекалий для бактериологического анализа, а после декапитации животных - пробы химуса и слизистой оболочки из различных отделов тонкой кишки (без двенадцатиперстной) и из толстой кишки для определения в них активности кишечных пищеварительных ферментов.
В гомогенатах слизистой оболочки участков кишечника определяли активность мальтазы (НФ 3.2.1.20), используя глюкозооксидазный метод [9], и активность щелочной фосфатазы (НФ 3.1.3.1), используя ^-нитрофенилфосфат натрия (0.6 мМ) в качестве субстрата и раствор Рингера в качестве буфера (рН 7.2). Активность ферментов выражали в мкмоль/мин на г влажного веса ткани (удельная активность) и в мкмоль/мин на участок кишки (интегральная активность). По удельной активности судили о ферментативной активности усредненного энтероцита, а по интегральной активности - о суммарной ферментативной активности, приходящейся на данный участок кишечника.
Состав кишечной микробиоты анализировался бактериологическими методами [9,10].
Статистическая обработка проводилась с использованием t-критерия Стъюдента. Для каждого из определяемых показателей рассчитывалось среднее значение (M) и среднеквадратичная ошибка среднего (±m). Достоверными считались изменения при уровне значимости P<0.05.
Результаты и их обсуждение
В ходе введения антимикробных препаратов и на ранних сроках после их отмены у животных групп О1 и О2 (с пробиотиком), а также у крыс контрольной группы К2 (без пробиотика после антибиотиков), наблюдались признаки диспепсии: маслянистая консистенция фекалий, в некоторых случаях понос или полифекалия. Введение в течение 5 суток пробиотиков крысам в группах О1 и
О2 ускоряло устранение симптомов диспепсии по сравнению с животными в группе К2.
В группе О1 (с лактобациллами), так же как в группе К2 (без пробиотика), в ходе опытов не менялся прирост массы тела крыс по сравнению с таковым в контрольной группе К1 (без антибиотиков и пробиотика). Вместе с тем в группе О2 (с энтерококками) этот показатель увеличился на 9% (Р< 0.01).
При бактериологическом исследовании фекалий обнаружено увеличение количества резидентных представителей нормальной микрофлоры (лактоба-циллы, бифидобактерии, энтерококки) и снижение количества условно- патогенных бактерий (эшерихии, протей, клебсиеллы) в группах О1 и О2 (с пробио-тиками) по сравнению с контролем К2 (рис. 1). При этом энтерококки проявляли более сильный эффект, чем лактобациллы. Таким образом, использованные нами пробиотические лактобациллы и энтерококки были эффективны в отношении восстановления содержания полезных представителей нормальной микрофлоры и подавления роста условно- патогенных бактерий. Эти данные хорошо согласуются с результатами нашей предшествующей работы, в которой оценивалась эффективность пробиотических энтерококков в коррекции экспериментального дисбиоза у крыс [9,10].
Рис. 1. Изменение содержания бактерий в фекалиях крыс после введения
пробиотиков (группы О1 и О2) или молока (группа К2) крысам с экспериментальным дисбиозом кишечника.
По вертикали: изменение количества бактерий по отношению к их уровню после введения антибиотиков. Обозначения: О1 - введение антибиотиков (3 дня) и затем лактобацилл (5 дней); О2 - введение антибиотиков (3 дня) и затем энтерококков (5 дней); К1 - введение воды (3 дня) и затем молока (5 дней); К2 -введение антибиотиков (3 дня) и затем молока (5 дней).
Масса слизистой оболочки, определённая в конце опытов у животных группы О1 (с лактобациллами), не менялась в различных участках кишечника по сравнению с таковой в контроле К1 (без антибиотиков и пробиотика), а в группе О2 (с энтерококками) она была несколько выше (в проксимальном участке тонкой кишки - на 15%, Р<0.01) (рис. 2). В отличие от групп с пробиоти-ками, в группе К2 (без пробиотика) масса слизистой оболочки была увеличенной по сравнению с группой К1 сразу в двух участках кишечника (в медиальном - на 19%, Р<0.01, и в дистальном - на 21%, Р<0.05). Таким образом, исследованные пробиотические бактерии были эффективными в отношении коррекции морфометрических показателей кишечной слизистой оболочки.
Слизистая оболочка Химус
Проксим. Медиа.!. Диет, толстая Проксим. Медиа7. Диет. Слепая Толстая
Участки тонкой кишки кишка Участки тонкой кишки кишка кишка
Рис. 2. Масса слизистой оболочки и химуса в различных участках кишечника крыс опытных и контрольных групп.
Обозначения какие же, как в подписи к рис. 1. *Р<0.05; ** Р<0.02; ***Р<0.01.
Однако при проведенном в конце опытов анализе массы химуса было обнаружено, что в группах О1 и О2 (с пробиотиками), как и в контроле К2 (без пробиотика), этот показатель был повышенным во всех отделах кишечника по сравнению с уровнем в контроле К1 (рис. 2). Таким образом, в наших экспериментальных условиях введение пробиотических бактерий после отмены антибиотиков не устраняло полностью нарушений в процессах, протекающих в полости кишечника с участием бактериальной флоры.
В настоящей работе определялись активности двух собственно кишечных мембранных ферментов: мальтазы (ключевой фермент на заключительном этапе расщепления крахмала) и щелочной фосфатазаы (расщепляет эфиры фосфорной кислоты и участвует в регуляции всасывания липидов) [1, 11, 12].
Рис. 3. Активность мальтазы (слева) и щелочной фосфазаты (справа) в слизистой оболочке различных участков кишечника крыс.
По вертикалям: интегральные активности ферментов (мкмоль/мин на участок кишки).
Обозначения какие же, как в подписи к рис. 1. * P<0.05; ** P<0.02; **** P<0.0027 по отношению контролю К1.
В группе О1 (с лактобациллами) наблюдалось повышение по сравнению с контролем К1(Р<0.05) удельной активности мальтазы в слизистой оболочке медиального участка тонкой кишки. При этом интегральная активность мальтазы в данном участке кишки характеризовалась тенденцией к повышению (рис. 3).
Вместе с тем в группе О2 (с энтерококками) удельная и интегральная активности мальтазы в различных отделах кишечника не отличались от таковых в контроле К1. Однако в группе К2 (без пробиотика) уровни удельной и интегральной активности мальтазы были повышенными по сравнению с контролем К1. В случае интегральной активности - в медиальном участке на 22% (Р<0.05), в дистальном участке на 30% (Р<0.02). Учитывая наши данные по изменению массы слизистой оболочки в различных участках кишечника, можно заключить, что наблюдаемое нами повышение интегральной активности мальтазы в слизистой оболочке указанных участков кишечника в группе К2 достигается за счет увеличения как удельной активности мальтазы (то есть её активности в энтеро-цитах), так и массы слизистой оболочки. Таким образом, исследованные нами пробиотические бактерии способствуют эффективной коррекции удельной и интегральной активности мальтазы в слизистой оболочке тонкой кишки. Эти данные хорошо согласуются с представлением о том, что восстановление мик-робиоты под влиянием пробиотиков влечёт за собой восстановление её функций (в нашем случае наблюдается восстановление пищеварительной функции кишечника в отношении углеводов). В этом случае организм хозяина может частично компенсировать свои энергетические затраты за счёт субстратов, получаемых в ходе метаболических процессов с участием микробиоты. В итоге, это позволит ему экономить на синтезе собственных белков-ферментов, в частности, мальтазы, которая участвует в заключительной стадии гидролиза пищевых углеводов [1, 11, 12].
Что касается щелочной фосфатазы, то в группе О1 (с лактобациллами), ка-ки в группе К2 (без пробиотика), отмечена тенденция к повышению удельной активности этого фермента в проксимальном и медиальном участках тонкой кишки. При этом в группе О1 интегральная активность щелочной фосфатазы оказалась заметно (на 31%, Р<0.0027) повышенной в медиальном участке тонкой кишки, а в группе К2 она характеризовалась тенденцией к повышению в проксимальном и медиальном участках тонкой кишки (рис. 3). В группе О2 (с энтерококками) удельные и интегральные активности щелочной фосфатазы в различных отделах кишечника достоверно не отличались от таковых в контроле К1. В свете последних данных о важной роли щелочной фосфатазы в интоксикации бактериального токсина - липополисахарида [13-15] можно предположить следующее. Повышение удельной и интегральной активности щелочной
фосфатазы в тонкой кишке в группах Ol (с лактобациллами) и К2 (без пробио-тика) скорее всего обусловлено необходимостью купирования воспалительного процесса, имеющего место у крыс этих групп в кишечной слизистой оболочке и вызванного присутствием на поверхности и в полости кишечника условно-патогенных микроорганизмов.
Заключение
В работе показано: l) пробиотические молочнокислые бактерии Enterococcus faecium L3 и Lactobacillusf ermentum Z эффективны в отношении коррекции кишечной микробиоты и структурно-функциональных параметров кишечника, нарушенных вследствие дисбиоза кишечника; 2) влияние указанных штаммов бактерий на перечисленные показатели имеет как сходные черты, так и специфические особенности, которые следует учитывать при выборе про-биотиков в случае персонифицированной терапии или для разработки новых лекарственных средств.
Литература
1. Уголев А.М. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций: Элементы современного функционализма // Л.: Наука. - 19S5.- 544 с.
2. Уголев А.М. Теория адекватного питания и трофология // Л.: Наука. - 1991. -272 с.
3. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. l. Микрофлора человека и животных и ее функция / Б.А. Шендеров. М.: Издательство Грантъ. - 199S. - 288 с.
4. Ткаченко Е.И., Успенский Ю.П. Питание, микробиоценоз и интеллект человека // СП-б. 2006.- 560 с.
5. Cani P.D., Delzenne N.M. The role of the gut microbiota in energy metabolism and metabolic disease // Current Pharmaceutical Design. 2009. V. 15. P. - 1546-155S.
6. Claus S.P., Ellero S.L., Berger B. et al., Colonization-induced host-gut mi-crobal metabolic interaction// MBio. - 2011. -V. 2(2): e00271-10.
7. Бельмер С. В., Гасилина Т. В. Кишечная микрофлора и антибактериальная терапия. // ConsiliumMedicum / Педиатрия.-2005.- № l.- С.14-16.
S. Goldin B.R., Gorbach S.L. Clinical indication for probiotics: An Overwiew // Clinical Infectious Diseases. - 200S.- V. 46. - Р. 96-100.
9. Ермоленко Е.И., Донец В.Н., Дмитриева Ю.В., Ильясов Ю.Ю., Суворова М.А., Громова Л.В. Влияние пробиотических энтерококков на функциональные
характеристики кишечника крыс при дисбиозе, индуцированном антибиотиками // Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 11. Медицина.2009.-Вып.1.- C. 157 - 167.
10. Ermolenko E., Gromova L.,. Borshchov Yu, Voeikova A., Karaseva A., Ermo-lenko K., Gruzdkov A., Suvorov A. Influence of different probiotic lactic acid bacteria on microbiotaand metabolism of rats withdisbiosis. // Bioscience of Microbiota, Food and Health. - 2013. V. - 32(2). - P. 41-49.
11. Тимофеева Н.М.,Иезуитова Н.Н., Громова Л.В. Современные представления о всасывании моносахаридов, аминокислот и пептидов в тонкой кишке млекопитающих // Успехи физиологических наук.- 2000.- Т. 31. № 4.- С. 24 - 37.
12. Lin A.N., Nichiols B.L., Quezada-Calvillo R., Avery S.E., Sim L., Rose D.R., Naim H.Y., Hamaker B.R. Unexpected high digestion rate of cooked starch by the Ct-maltase-glucoamylase small intestine mucosal a-glucosidase subunit // PLos One. 2012. 7(5): e35473.
13. Geddes K., Philpott D.J. A new role for intestinal alkaline phosphatase in gut barrier maintenance. // Gastroenterology. 2008. 135(1):8-12.
14. Tuin A., Poelstra K., de Jager-Krikken A. et al. Role of alkaline phosphatase in colitis in man and rats // Gut, 2009. 58 (3). С. 379-387.
15. Lei W., Ni H., Herington J., Reese J., Paria B.C.Alkaline phosphatase protects lipopolysaccharide-induced early pregnancy defects in mice // PLoS One. 2015. 10(4): e0123243. doi: 10.1371/journal.pone.0123243. eCollection 2015.
Ключевые слова: кишечник, пищеварительные ферменты, микробиота, Ente-rococcus faecium L3,Lactobacillus fermentum Z.
Key words: intestine, digestive enzymes, microbiota, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus fermentum Z.
