CC BY
8
4. Доброчаева, Д. Н. Определитель высших расте- 2. Zyman, S. M. (2004). Iljustrovanyj dovidnyk z mor-ний Украины [Текст] / Д. Н. Доброчаева, М. И. Котов и fologiji kvitkovyh roslyn. Uzhgorod: Medium, 165.
др. - К.: Наукова думка, 1987. - 548 с. 3. Grodzinskyi, A. M. (1987). Enstyklopedia likarskykh
5. Визначник рослин Украшських Карпат [Текст] / roslyn. Kyiv: Naukova dumka, 560.
за ред. В. I. Чопика. - К.: Наук. думка, 1977. - 435с. 4. Dobrochaeva, D. N., Kotov, M. I. et. al. (1987).
6. Григора, I. М. Геоботанжа [Текст]: навч. пос. / Opredelitel vysshykh rasteniy Ukrainy. Kyiv: Naykova dum-I. М. Григора, Б. £. Якубенко, М. Д. Мельничук. - К.: Аргс- ka, 548.
тей, 2006. - 448 с. 5. Chopyk, V. I. (1977). Vyznachnyk Roslyn
7. Червона книга Укра!ни. Рослинний свгг [Текст] / Ukrayinskykh Karpat. Kyiv: Naukova dumka, 435.
за ред. Я. П. Дщуха. - К.: Глобалконсалтинг, 2009. - 912 с. 6. Hryhora, I. M., Yakubenko, B. Ye., Melnychuk, M. D.
(2006). Heobotanika. Kyiv: Aristey, 448. References 7. Didukh, Ja. P. (2009). Chervona knyga Ukrainy.
1. Takhtadjan, A. L. (1981). Zhyzn rastenij. Moscow: Roslynnyj svit. Kyiv: Globalkonsaltyng, 912. Prosvjeshchenije.
Рекомендовано до публгкаци д-р бюл. наук, професор Парпан В. I.
Дата надходження рукопису 22.10.2015
Буняк Bipa 1вашвна, кандидат бюлопчних наук, доцент, кафедра бюлогп та екологи, 1нститут природ-ничих наук ДВЗН «Прикарпатський нацюнальний ушверситет 1мен1 Василя Стефаника», вул. Галицька, 201, м. 1вано-Франшвськ, Украша, 76018
Гмездшова Вiкторiя 1ю|)1вна, кандидат бюлопчних наук, доцент, кафедра бюлогп та екологи 1нституту природничих наук, 1нститут природничих наук ДВЗН "Прикарпатський нацюнальний ушверситет 1м. Василя Стефаника", вул. Галицька, 201, м. 1вано-Франшвськ, Украша, 76018 E-mail: victoria1975@bigmir.net
УДК 543.9
DOI: 10.15587/2313-8416.2015.54486
ВИЗНАЧЕННЯ L-АРГШШУ У КРОВ1 ЩУР1В ЕНЗИМАТИЧНИМ МЕТОДОМ © Г. З. Гайда, Н. е. Стасюк, Н. О. Сиб1рма, М. В. Гончар
Здшснено опрацювання ензиматично-х1м1чного методу ктъюсного анал1зу L-Аргтну (Арг) на реальних зразках кров1 щур1в. Розроблений метод Трунтуетъся на використанш рекомбтантноi аргтази I та 2,3-бутандюнмонооксиму (ДМО). Продукт реакци (сечовина) рееструетъся флуорометрично. Показано придатнгстъ нового методу для визначення Арг в б1олог1чнихргдинах ссавцгв
Ключовi слова: Аргтн, сечовина, кров щур1в, ензиматично-хгмгчний анализ, аргтаза, 2,3-бутан-дюнмонооксим
The study of enzymatic-chemical method of L-Arginine (Arg) assay on the real samples of rat blood was done. The developed method is based on the usage of recombinant arginase I and 2,3-butandion monooxim. Urea, the final product of the reaction, is detected by fluorometry. The new method was shown to be suitable for Arg assay in biological liquids of mammalians
Keywords: А^тж, urea, rat blood, enzymatic-chemical assay, arginase, 2,3-butandion monooxim
1. Вступ
Рiвень L-арпншу (Арг) e важливим бюмарке-ром багатьох захворювань [1, 2], тому надшне визначення концентраци ще! амшокнслоти у бюлопчних рщинах людини е запорукою правильно! дiагностики та адекватного лшування.
Бшьшють вщомих методiв визначення Арг мае низку недолЫв, головш iз яких: низька селектив-шсть, громiздкiсть та коштовшсть апаратури i чутли-вють до штерферуючого впливу супутшх речовин. Тому розробка нових високоселективних, чутливих i економiчно випдних методiв шльшсного аналiзу Арг е надзвичайно актуальною.
У попереднiх дослщженнях нами розроблено та охарактеризовано ензиматично-хiмiчний метод визначення Арг за використання рекомбшантно! ар-гiнази I печшки людини та 2,3-бутандiонмонооксиму (ДМО) [1, 3, 4]. Метод грунтусться на ензиматичному гiдролiзi Арг до L-орнiтину та сечовини (карбамiду). Останнiй пвд час нагрiвання в кислому середовищi взаeмодie з 2,3-бутандiонмонооксимом (ДМО) з ут-воренням продукту, який кшькюно оцiнюeться спек-трофотометрично або флуоресцентно.
Можливють практичного застосування ро-зробленого методу визначення вмюту Арг за використання арпнази i ДМО вивчали на зразках промисло-
вих фармацевтичних препарапв [3] та комерцшних вин [1, 5]. Як сввдчить пор1вняльний анал1з резуль-тапв у цих зразках р1зними методами [3], новий ен-зиматично-х1м1чний метод «арпназа-ДМО» дае ре-зультати, яш добре корелюють з показниками вироб-ника й даними, одержаними за допомогою референт-них метод1в. Арпназа-ДМО-метод не потребуе попе-реднього вщокремлення Арг з дослщжуваних зразшв, е простим у виконанш, високо- селективним, надш-ним i комерцшно доступним. Розроблений метод може бути перспективним для створення економiчно вигiдних тест-систем на Арг та застосування !х у ла-бораторiях харчово! та фармацевтично! промисло-востi. Наступним необхвдним кроком на шляху ви-пробування запропонованого методу е дослiдження його придатносп для аналiзу Арг в реальних зразках бюлопчних рвдин, зокрема кровi та сечi.
2. Постановка проблеми
Застосування вщомих методiв визначення концентрацй Арг у клiнiчнiй дiагностицi обмежуеть-ся !х низькою селектившстю, спричиненою позитивною реакцiею на гуанiдиновi сполуки, тобто на точ-нiсть вимiрювань можуть впливати ввдносно висок1 концентрацй' L-лiзину, L-пролiну, L-цитрулшу тощо [5-8]. Арг у бюлопчних рщинах зазвичай вщокрем-люють ввд iнтерферуючих сполук, застосовуючи iонообмiннi смоли [9], проте це ускладнюе процедуру аналiзу. В Украш вщсутш вiтчизнянi ензиматичнi тест-системи для визначення Арг. Щодо кра!н за-рубiжжя, то так1 аналiтичнi набори юнують, проте вони досить дорогi. З огляду на це, актуальним зав-данням було дослiдити придатнiсть розробленого арпназа-ДМО-методу, як1й не потребуе попередньо-го вiдокремлення Арг з дослвджуваних зразкiв, для визначення вмiсту Арг в бюлопчних рвдинах, зокрема, в кровi ссавцiв.
3. Лггературний огляд
Арг - глюкогенна нашвзамшна амiнокислота, важливий метаболiт циклу сечовини [10, 11]. Арг бере участь у численних бiохiмiчних процесах, що мають мiсце в органiзмi ссавщв, включаючи деток-сикацш амiаку, секрецш гормонiв i т. iн. Арг е попе-редником оксиду азоту (NO), який продукуеться кль тинами ендотелш i е головною судинорозширюваль-ною речовиною. Бiологiчна активнiсть NO суттево знижуеться при серцево-судинних захворюваннях, що супроводжуються порушенням ендотелшзалежно! релаксацй' судин i пiдвищеною адгезившстю ендоте-лiальноl вистiлки. Зниження активносп NO (i, вщпо-вiдно, зниження концентрацй' Арг) асоцшеться з факторами ризику iшемiчноl хвороби серця, прогресу-ванням атеросклеротичного ураження артерш. Завча-сна дiагностика таких порушень вiдкривае додатковi можливостi своечасного виявлення станiв, що пере-дують виникненню гострого коронарного синдрому. Таку дiагностику можна здiйснювати шляхом визначення концентрацй' Арг у кровi та шших бiологiчних рiдинах.
З шшого боку, Арг, як джерело NO, може бути використаним в якосп лшувального засобу в терапй'
стенокардп, коронарно! серцево! недостатностi, при гшертошчнш хворобi, iшемiчнiй хворобi серця, прее-клампс^', еректильнiй дисфункцй', цукровому дiабетi та iнших захворюваннях [12]. Зрозумшо, що при такому лшуванш потрiбно ретельно контролювати рi-вень Арг у кровi та сеч^ Аналогiчний монiторинг е необх1дним при ензимотерапп деяких видiв раку (ме-ланоми, гепатокарциноми i пухлин шдшлунково! залози) аргiназою I печiнки людини [9-11].
Арг е попередником симетричних та несимет-ричних диметильованих похвдних гуанiдину, а також гомоаргiнiну. Як субстрати NO-синтази, Арг та його сполуки можуть бути важливими бюмаркерами у клiнiчнiй дiагностицi не тшьки серцево-судинних [12], але i нейродегенеративних, легеневих [11], ауто-iмунних захворювань [2], сепсису, гiпераргiнiнемil (аргiнiнемiя) i гiперамонiемiя (амонiемiя) [2, 10-12].
Аргiнiнемiя i амонеiмiя викликанi дефiцитом аргшази I (L-Арг амiдогiдролаза, ЕС 3.5.3.1), остан-нього ферменту циклу сечовини, що каталiзуе гiд-ролiз Арг до сечовини [1]. На вiдмiну вщ iнших де-фектiв циклу сечовини, дефщит аргiнази I, зумовле-ний мутацiею в вiдповiдному геш, зазвичай не ви-кликае катастрофiчноl амонiемil новонароджених. Але цей дефщит проявляеться у прогресуючих нев-ролопчних симптомах, включаючи судоми, в першi роки життя та важк1 печiнковi патолог^' новонароджених, зокрема, холестаз, гостру печшкову недо-статнiсть або фiброз печiнки [1]. Для виявлення ар-гiнiнемil у немовлят, у деяких економiчно розвину-тих крашах уряди фiнансують програми для здшс-нення монiторингу кровi новонароджених на вмют Арг. Встановлено, що своечасна дiагностика дозво-ляе розпочати адекватне лiкування i зупинити роз-виток цього рщшсного, але вкрай небезпечного ге-нетичного захворювання [1].
Таким чином, розробка та опрацювання високо-чутливого, над1йного, швидкого та зручного експрес-методу для мониторингу Арг у бiологiчних родинах, е актуальним завданням аналiтичноl бiотехнологii.
4. Мета дослщження
Метою нашого дослвдження було апробува-ти на кровi щурiв розроблений нами ензиматично-хiмiчний метод кiлькiсного аналiзу Арг за викори-стання рекомбiнантноl аргiнази I печшки людини та ДМО.
5. Матерiали та методи дослiдження
Концентрацш Арг визначали за допомогою Арпназа-ДМО-методу [3]. Як продуцент аргшази I печшки людини (далi - арпназа) використовували рекомбiнантний штам дрiжджiв NCYC 495 H. Poly-morpha [1]. Фермент видшяли iз безклiтинного екс-тракту штаму-продуцента шляхом афiнноi колонко-во! хроматографй' за розробленою нами схемою, ак-тивнiсть аргiнази визначали за швидшстю утворення сечовини за шструкщею до набору для визначення сечовини (НВФ «ОМКО», Львiв, Укра!на) [13].
Для приготування зразк1в до аналiзу, цитратну плазму кровi декаттованих щурiв центрифугували (ЦФ) 10 хв при 10000 об./хв. До одержаного суперна-
танту (освилена плазма, об'емом V:) додавали 50 % розчин трихлороцтово! кислоти (ТХОК) до шнцево! концентраци 5 %, перемiшували, витримували 30 хв при 0 °С та центрифугували 10 хв при 10000 об./хв. Безбшкову надосадову родину (БНР, об'емом V2) вiдбирали i зберiгали до початку аналiзу при -20 °С. З формених елементiв кровi [13] (еритроцитiв та лей-коципв) одержували лiзати, додавали рiвний об'ем охолодженого ацетону з наступним ЦФ. В надосадо-вих рщинах визначали Арг i сечовину.
Дослiджували оптимальш умови ензиматично! реакци для зв№нення БНР вiд нативно! сечовини: нейтралiзували БНР додаванням розчину 2МТрiсОН до рН 7,0, вносили уреазу та шкубували упродовж 50 хв при 37°С. Концентрацiю залишково! сечовини у БНР-нс (розчин БНР без нативно! сечовини, об'емом Vз) контролювали за допомогою набору «С1МКО».
Дослвджували оптимальш умови ензиматично-го перетворення нативного Арг у сечовину: спочатку iнгiбували уреазу шляхом шдлужнювання розчину БНР-нс до рН 9, додаючи 2 М розчин ТркОН, потiм вносили аргiназу та шкубували упродовж 40 хв при 37 °С. Зразок БНР-нАрг ((БНР-нс без нативного Арг, об'емом V4) мiстив сечовину - продукт перетворен-ня нативного Арг за ди аргiнази.
На етапi хiмiчно! стади реакцi! 0.5 мл розчину БНР-нАрг змiшували з 3 мл реагенту на сечовину -розчину ДМО та кип'ятили 50 хв на водянш банi. Кiнцевий продукт реакци сечовина-ДМО рееструва-ли проти «слшо!» проби флуориметрично. «Слiпу» пробу готували додаванням вiдповiдних к1лькостей уреази i аргiнази до 5 % розчину ТХУ у водi з наступними кип'ятшням iз ДМО. Концентращю Арг у фшальному аналiзованому зразку визначали методом порiвняння iз двома калiбрувальними пробами -0,4 та 0,8 мМ розчинами Арг у 30 мМ Трiс-НСI буфер^ рН 8,8.
Результати дослвджень обробляли статистич-но. При розрахунку брали до уваги середне арифме-тичне показiв цих проб.
6. Результати дослвджень та \х обговорення
Приготування зразк1в кровi для аналiзу Арг у плазмi здiйснювали за схемою, зображеною на рис. 1
Для ошгашзацп умов ензиматично! стади аналiзу Арг у реальних зразках плазми кровi та за-безпечення його надшносп, експериментально визначали концентрацш ферменпв та час проведен-ня ензиматичних реакцi! (рис. 2). Як видно з рис. 2, а, залишкова концентрашя карбамиду у зразку БНР-нс пропорцiйно зменшуеться при збiльшеннi концентраци уреази в шкубацшнш сумiшi i часу iнкубацi!. На рис. 2, б наведено даш по залежносп ефектив-ностi гiдролiзу Арг за ди аргiнази у зразку БНР-нАрг вiд активностi аргiнази I у шкубацшнш сумшг
На основi отриманих даних (рис. 2) вибрано оптимальш умови проведения ензиматичних стадш реакцш. Для повного усунення нативно! сечовини (перетворення !! у юни амонш за дi! уреази при 37 °С) оптимальним часом шкубаци iз ферментом е 50 хв, а концентрашя уреази в шкубацшнш сумiшi становить 40 Од./мл. Для повного перетворення на-
тивного Арг у сечовину при 37 °C, концентра^ ар-пнази I в шкубацшнш сумiшi повиннi бути не менше як 3 Од./мл, час шкубацп 40 хв.
Запропонована методика була апробована на зразках кровi 10 здорових щурiв.
Проби аналiзували при довжиш хвилi емiсi! 520 нм, довжиш хвилi збудження - 360 нм на спект-рофлуориметрi HITACHI MPV-4 проти вiдповiдних «слших» проб. Розрахунок концентрацi!' Арг у кш-цевiй дослiднiй пробi проводили за методом порiвняння iз калiбрувальними пробами (стандарт-ними розчинами Арг iз концентрацiями 0,4 та 8 мМ):
C = -
C Арг
E„
- C„
Е_
де САрг - концентрац1я Арг (САрг) у кiнцевiй npo6i, Едосл i Екл - показники штенсивностей випромiню-вання в дослiднiй та кал1брувальнш пробах; Скл -концентрашя Арг в калiбрувальнiй пробi, мМ.
БНР"нс (БНР без НЭТИВН01 сечовини). V3 БНРнАрг (БНР-0 без нативного Apr). V4
Продукт реакцн «Сечов1ша-ДМО»
Рис. 1. Етапи приготування зразкiв плазми кровi для аналiзу Арг
Для перерахунку концентрацiй Арг у до-сл1дних пробах на концентрац1ю Арг у вихщнш плазмi, необх1дно врахувати сумарний фактор розве-дення (ФРс), якiй е добутком ФР кожного етапу приготування зразка для аналiзу (рис. 1). ФР на кожному еташ визначаеться як величина сшвввдношення об'eмiв зразкiв - наступного до попереднього. Так, ФР1=V2/V1, ФР2^3/^, ФРз=V4/Vз. Таким чином, для визначення концентрацi! Арг в плазмi, необхвдно САрг, розраховану за формулою, перемножити на до-буток величин ФР1, ФР2, ФР3.
Одержанi значення Арг у зразках плазми добре корелюють iз даними лiтератури (табл. 1). Вмкт Арг у лiзатах еритроцилв складае 38 мкМ, враховуючi об'ем лiзатiв еритроцитiв (в наших дослщах складае 0,1 мл), сумарна кшьысть Арг становить менше, нiж 9 % ввд кiлькостi Арг у плазма Слiд також зазначити, що при аналiзi лiзатiв лейкоцитiв не виявлено навиь слiдових кiлькостей Арг.
6
Phc. 2. Bu6ip onTHManbHHx yMOB npoBegeHHa eH3HMaTHHHHx peaKqin: a - 3ane®HicTb e^eKTHBHocri rigponi3y HarHBHoi* cenoBHHH y 3pa3Ky BHP-HC (npuHHHTo 3a 100 %) 3a gii ypea3H Big aKTHBHocTi ^epMemy b iHKy6aqiHHm cyMimi Ta nacy iHKyöa^i (xb): 15 (1) i 50 (2); 6 - 3ane®HicTb imeHCHBHocTi ^nyopec^H^i ^rnanbHoro npogyKTy xiMinHoi pea^i! Big KoH^mpaum Apr Ta apriHa3H b iHKy6a^HHin cyMimi (Og./Mn): 1,5 (1); 3, 0 (2) i 4,5 (3)
Ta6nHua 1
.a6opaTopHi noKa3HHKH 3HaneHb Apr Ta cenoBHHH, BH3Hanem y nna3Mi Ta ^opMeHHx eneMemax KpoBi ^ypiB (n=10)
06'eKT nna3Ma Еpнтpoцнтн .Пeнкoцнтн
AHaniT Apr CenoBHHa Apr CenoBHHa Apr CenoBHHa
KoH^mpa^a, mm 0,050-0,140 1,8-8,1 0,034-0,044 1,5-2,7 0 0,08-0,12
HopMa, mm 0,100 2,5-8,3 - - - -
nocHnaHHa 14 15 - - - -
y Ta6n. 1 HaBegeHo TaKo® pe3ynbTam no BH3Ha-neHHM KoH^mpa^i cenoBHHH y eneMemax KpoBi. BcTaHoB^eHo, ^o piBeHb cenoBHHH y nna3Mi KpoBi ^y-piB 3HaxogHTbca b Me®ax HopMH [15, 16], Togi m nire-
paTypHHx gaHHx BigHocHo piBHa cenoBHHH y ni3arax epнтpoцнтiв Ta fleнкoцнтiв ^ypiB HaMH He 3HangeHo.
TaKHM hhhom, b pe3ynbTari npoBegeHHx go-cnig®eHb HaMH 3anponoHoBaHo omuManbHHH Kinb-
шсний склад реакцшнш сумiшi для визначення Арг у KpoBi щурiв ензиматичним та умови виконання аналiзу.
7. Висновки
1. Апробовано на зразках KpoBi щуpiв ензима-тичнo-хiмiчний метод кiлькiснoгo аналiзу L-Арг i3 флуорометричним способом детектування продукту реакци (сечовини). Метод базуеться на використант високоочищено! аpгiнази I, одержано! нами за влас-ною технoлoгiею iз клiтин др1жджового рекомбь нантного штама-надпродуцента i ДМО.
2. Запропонована методика е простою у вико-нанш, не потребуе складно! пiдгoтoвки зразшв до аналiзу i може використовуватись для кшьшсного визначення вмiсту L-Арг в бюлопчних рщинах, зокрема, кровь
Подяка
Роботу виконано за фшансово! пвдтримки НАН Укра!ни в рамках науково-техшчного проекту № 29/2015 «Розробка, тестування та випуск пробно! серп ензиматичного набору "Аргггест" для аналiзу аpгiнiну в клiнiчних зразках. Роздш 1. Оптимiзацiя складу набору, умов проведення аналiзу та розробка науково-технично! документаци».
Лiтература
1. Гайда, Г. З. Методи аналiзу L-аргшшу [Текст] / Г. З. Гайда, Н. £. Стасюк, М. В. Гончар // Biotechnologia Acta. - 2014. - Т. 7, № 1. - С. 31-39. doi: 10.15407/ biotech7.01.031
2. Стасюк, Н. £. Новий ензиматичний метод визначення L-аргшшу за використання аргшази i людини та уреази [Текст] / Н. £. Стасюк, С. Р. Басс, Г. З. Гайда, Х. С. Спремян, М. В. Гончар // ScienceRise. - 2015. - T. 6, № 1 (11). - С. 43-48. doi: 10.15587/2313-8416.2015.45126
3. Stasyuk, N. L-arginine assay with the use of arginase I [Text] / N. Stasyuk, G. Gaida, M. Gonchar // Applied Biochemistry and Microbiology. -2013. - Vol. 49, Issue 5. -P. 529-534. doi: 10.1134/s000368381305013x
4. Стасюк, Н. С. Ензиматичний метод визначення вмюту L-аpгiнiну за використання рекомбшантног аргшази I людини [Текст] / Н. С. Стасюк, Г. З. Гайда, А. В. Гайда та ш. // Ukrainica Biorganica Acta. - 2012. - T. 1. - С. 31-37.
5. Gayda, G. Arginase-based electrochemical sensors to L-arginine assay for prediction of ethyl carbamate formation in fermented beverages [Text] / G. Gayda, N. Stasyuk, H. Klepach et. al. - In the Book "Living Organisms and Bioanalytical Approaches for Detoxification and Monitoring of Toxic Compounds", 2015. - P. 73-88.
6. Costin, J. Selective determination of amino acids using flow injection analyses coupled with chemiluminescence detection [Text] / J. Costin, F. Paul, S. Lewis // Analytica Chimica Acta. -2003. - Vol. 408, Issue 1. - P. 67-77. doi: 10.1016/s0003-2670 (02)01645-8
7. Mira de Orduna, R. Quantitative determination of L-arginine by enzymatic End-Point analysis ^ext] / R. Mira de Orduna // Journal of Agricultural and Food Chemistry. -2001. - Vol. 49, Issue 2. - P. 549-552. doi: 10.1021/jf000522y
8. Gaede, G. A rapid and specific enzymatic method for the estimation of L-arginine ^ext] / G. Gaede, M. Grieshaber // Analytical Biochemistry. - 1975. - Vol. 66, Issue 2. - P. 393399. doi: 10.1016/0003-2697(75)90606-5
9. Cohen, S. I. The determination of arginine released in human blood plasma after plasminogen activation. Use of a
cation-exchange resin ^ext] / S. I. Cohen // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 1960. - Vol. 86, Issue 2. -P. 166-168. doi: 10.1016/0003-9861(60)90397-0
10. Yokoro, M. Asymmetric dimethylarginine, an endogenous NOS inhibitor, metabolized in rat erythrocytes ^ext] / M. Yokoro, M. Suzuki, K. Murota, C. Otsuka, H. Yamashita, Y. Takahashi, H. Tsuji et. al // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. - 2012. - Vol. 76, Issue 7. - P. 1334-1342. doi: 10.1271/bbb.120086
11. Lacroix, C. Label-free quantitative urinary prote-omics identifies the arginase pathway as a new player in congenital obstructive nephropathy ^ext] / C. Lacroix, C. Caubet, A. Gonzalez-de-Peredo, B. Breuil, D. Bouyssie, A. Stella et. al // Molecular & Cellular Proteomics. -2014. - Vol. 13, Issue 12. - Р. 3421-3434. doi: 10.1074/mcp.m114.040121
12. Сибipна, Н. О. Молекулярш мехашзми депону-вання оксиду азоту в еритроцитах [Текст] / Н. О. Сибipна, М. Я. Люта, Н. I. Климишин // Бюлопчш Студи / Studia Biologica. - 2010. - Т. 4, № 1. - С. 143-160.
13. Меньшиков, В. В. Лабораторные методы исследования в клинике [Текст] / В. В. Меньшиков. - М.: Медицина, 1987. - 215-219 с.
14. Miczke, A. Effect of L-arginine supplementation on insulin resistance and serum adiponectin concentration in rats with fat diet ^ext] / A. Miczke, J. Suliburska, D. Pupek-Musialik et. al // Int. J. Clin. Exp. Med. - 2015. - Vol. 8, Issue 7. -P. 10358-10366.
15. Liu, J. Acute Cd MT injection is not a good model to study chronic Cd nephropathy: comparison of chronic CdCl2 and CdMT exposure with acute CdMT injection in rats ^ext] / J. Liu, S. S. Habeebu, Y. Liu, C. D. Klaassen // Toxicology and Applied Pharmacology. Pharmacol. - 1998. - Vol. 153, Issue 1. -Р. 48-58. doi: 10.1006/taap.1998.8506
16. Enzytech [Electronic resource]. - Available at: https:// www.enzytech.com/products-services/analytical-test-kits/ak00171/
References
1. Gayda, G. Z., Stasyuk, N. E., Gonchar, M. V. (2014). The methods OF L-Arginine analysis. Biotechnologia Acta, 7 (1), 31-39. doi: 10.15407/biotech7.01.031
2. Stasjuk, N. Je., Bass, S. R., Gajda, G. Z., Jeprjem-jan, H. S., Gonchar, M. V. (2015). New enzymatic method for l-arginine determination based on use of human arginase i and urease. ScienceRise, 6/1 (11), 43-48. doi: 10.15587/2313-8416. 2015.45126
3. Stasyuk, N. E., Gaida, G. Z., Gonchar, M. V. (2013). L-arginine assay with the use of arginase I. Applied Biochemistry and Microbiology, 49 (5), 529-534. doi: 10.1134/s0003 68381305013x
4. Stasyuk, N. Ye., Gayda, G. Z., Gayda, A. V. et. al (2012). Enzymatic assay of L-arginine by the use of recombinant human arginase I. Ukrainica Biorganica Acta, 1, 31-37.
5. Gayda, G., Stasyuk, N., Klepach, H. et. al (2015). Arginase-based electrochemical sensors to L-arginine assay for prediction of ethyl carbamate formation in fermented beverages. In the Book "Living Organisms and Bioanalytical Approaches for Detoxification and Monitoring of Toxic Compounds", 73-88.
6. Costin, J. W., Francis, P. S., Lewis, S. W. (2003). Selective determination of amino acids using flow injection analysis coupled with chemiluminescence detection. Analytica Chimica Acta, 480 (1), 67-77. doi: 10.1016/s0003-2670(02) 01645-8
7. Mira de Orduna, R. (2001). Quantitative Determination of l -Arginine by Enzymatic End-Point Analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49 (2), 549-552. doi: 10. 1021/jf000522y
8. Gaede, G., Grieshaber, M. (1975). A rapid and specific enzymatic method for the estimation of l-arginine. Analyt-
ical Biochemistry, 66 (2), 393-399. doi: 10.1016/0003-2697(75)90606-5
9. Cohen, S. I. (1960). The determination of arginine released in human blood plasma after plasminogen activation. Use of a cation-exchange resin. Archives of Biochemistry and Biophysics, 86 (2), 166-168. doi: 10.1016/0003-9861(60)90397-0
10. Yokoro, M., Suzuki, M., Murota, K., Otsuka, C., Yamashita, H., Takahashi, Y. et. al (2012). Asymmetric Dime-thylarginine, an Endogenous NOS Inhibitor, Is Actively Metabolized in Rat Erythrocytes. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 76 (7), 1334-1342. doi: 10.1271/bbb.120086
11. Lacroix, C., Caubet, C., Gonzalez-de-Peredo, A., Breuil, B., Bouyssie, D., Stella, A. et. al (2014). Label-free Quantitative Urinary Proteomics Identifies the Arginase Pathway as a New Player in Congenital Obstructive Nephropathy. Molecular & Cellular Proteomics, 13 (12), 3421-3434. doi: 10.1074/mcp.m114.040121
12. Sybirna, N. O., Ljuta, M. Ja., Klymyshyn, N. I. (2010). Molekuljarni mehanizmy deponuvannja oksydu azotu v erytrocy-tah. Biologichni Studii' / Studia Biologica, 4 (1), 143-160.
13. Menshykov, V. V. (1987). The methods of laboratory investigations in clinical diagnostics. Мoscow: Ме<!гсте, 215-219.
14. Miczke, A., Suliburska, J., Pupek-Musialik, D. et. al (2015). Effect of L-arginine supplementation on insulin resistance and serum adiponectin concentration in rats with fat diet. Int. J. Clin. Exp. Med., 8 (7), 10358-10366.
15. Liu, J., Habeebu, S. S., Liu, Y., Klaassen, C. D. (1998). Acute CdMT Injection Is Not a Good Model to Study Chronic Cd Nephropathy: Comparison of Chronic CdCl2and CdMT Exposure with Acute CdMT Injection in Rats. Toxicology and Applied Pharmacology, 153 (1), 48-58. doi: 10.1006/ taap.1998.8506
16. Enzytech. Available at: https://www.enzytech.com/ products-services/analytical-test-kits/ak00171/
Дата надходження рукопису 15.10.2015
Гайда Галина Зуфаpiвна, кандидат хiмiчних наук, старший науковий сшвробгтник, старший науковий сшвробгтник В^вдлу Аналгтично1 бютехнологи, 1нститут бюлоги клггани НАН Укра1ни, вул. Драгома-нова, 14/16, м. Львiв, Укра1на, 79005 E-mail: galina.gayda@gmail.com
Стасюк Наталiя Свгешвна, кандидат хiмiчних наук, молодший науковий спiвробiтник Вiддiлу Аналь тично! бютехнологи. 1нститут бюлоги клггани НАН Укра1ни. вул. Драгоманова, 14/16, м. Львiв, Украша, 79005
E-mail: stasuk_natalia@ukr.net
C^ipra Наталiя Олександрiвна, доктор бюлопчних наук, професор, заввдувач кафедри БюхГмн Бюло-пчного факультету, ЛьвГвський нацiональний унiверситет iменi 1вана Франка, вул. Ушверситетська, 1, ЛьвГв, Укра1на, 79000 E-mail: sybirna_natalia@yahoo.com
Гончар Михайло Васильович, доктор бюлопчних наук, професор, заввдувач вщдшу Аналгтично! бютехнологи, 1нститут бюлоги клгтини НАН Украши, вул. Драгоманова, 14/16, м. ЛьвГв, Украша, 79005 E-mail: mykhailo1952@gmail.com
