CC BY
24
УДК 543.9
DOI: 10.15587/2313-8416.2015.45126
НОВИЙ ЕНЗИМАТИЧНИЙ МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ L-АРПШНУ ЗА ВИКОРИСТАННЯ АРГ1НАЗИ I ЛЮДИНИ ТА УРЕАЗИ
© Н. G. Стасюк, С. Р. Басс, Г. З. Гайда, Х. С. бпремян, М. В. Гончар
Розроблено чутливий та селективний метод кшьюсного анализу L-Аргiнiну 1з спектрофотометричним способом детектування продукту реакцИ (амонт) за допомогою о-фталевого альдегiду. Метод ба-зуеться на використант високоочищеног аргтази I та комерцшно'1 уреази. Новому методу властива ви-сока порогова чутливiсть визначення L-Аргiнiну, широкий дiапазон лiнiйностi, а також нечутливкть до ттерферуючого впливу широкого спектру амтокислот
Ключовi слова: ензиматичний аналiз, аргтаза I, уреаза, о-фталевий альдегiд, L-аргiнiн, сечовина, амонш, спектрофотометрiя
It is developed a sensitive and selective method for quantitative analysis of L-arginine with spectrophotometry method of detection of the reaction product (ammonium) using o-Phthalaldehyde. The method is based on the use of highly purified arginase I and commercial urease. The new method is highly sensitive for L-arginine determination, a wide range of linearity and insensitivity to interfering influence of wide range of amino acids Keywords: enzymatic assay, arginase I, urease, o-Phthalaldehyde, L-arginine, urea, ammonium, spectropho-tometry
1. Вступ
Ь-Арг1н1н (L-Арг) - нашвзамшна амшокис-лота, яка служить попередником для бюсинтезу ба-гатьох бюактивних сполук, включаючи NO, пол1а-мши, пептиди i бшки [1]. Визначення р1вня L-Арг в плазм1 кровi здшснюють при довенному введенш L-Арг в процеа дiагностики та експериментального дослщження захворювань ендокринно! системи [2]. Вщомо також, що визначення концентрацп L-Арг у сироватш кровi дозволяе дiагностувати та вивчати особливосп переб^ таких складних захворювань, як гепатокарцинама, меланоми шшри та колоректаль-ний рак [3, 4].
2. Постановка проблеми
На сьогодш визначення вмюту L-Арг в розчи-нах проводиться методами юнообмшно! хроматогра-фи, флуориметри, спектрофотометрп, катлярного електрофорезу, полярографп, проточно-iнжекцiйного аналiзу, ензиматичним методом, високоефективною рвдинною хроматографiею. Однак, б№шють вiдомих методiв визначення L-Арг мае низку недолЫв, осно-вш iз яких: низька селективнiсть, громiздкiсть та ко-штовнiсть апаратури i чутливiсть до iнтерферуючого впливу супутшх речовин. З огляду на це, розробка нових високоселективних та чутливих методiв визначення вмiсту L-Арг, зокрема ензиматичних, е надзви-чайно актуальною.
3. Лггературний огляд
L-Арг е важливим бiомаркером низки захворювань, пов'язаних iз порушенням обмiну, зокрема, гшерарпншемп, викликано! генетичним дефектом в геш ARG1 (дефiцит аргiнази I) [5]. Мотгоршг вмю-ту L-Арг в плазмi кровi здiйснюють при довенному введенш L-Арг в процеа дiaгностики та експериментального дослщження захворювань ендокринно! системи [2]. Рiвень L-Арг в сечi е маркером гомозиготно! цистинурп [6] та обструктивно! нефропaтi!
новонароджених [7]. 1снують дaнi, що визначення концентрaцi! L-Арг у сироватщ кровi дозволяе дiaг-ностувати та вивчати особливостi перебпу таких захворювань, як aртерiaльнa гiпертензiя, гестоз вапт-них та iншi акушерськ ускладнення [8], астма [9], обструктивш захворювання дихальних шляхiв та за-палення к1шк1вника [10], а також гепатокарцинома, меланома шшри та колоректальний рак [3, 4].
Визначення вмюту L-Арг проводиться методами юнообмшно! хроматографи, флуориметри, спектрофотометрп, катлярного електрофорезу, по-лярографи, проточно^нжекцшного aнaлiзу, високоефективною рiдинною хромaтогрaфiею (ВЕРХ) [11] та бiосенсорними методами [12-14].
Для шльшсного aнaлiзу L-Арг розроблено також i ензиматичш методи, зокрема за використання трьох ферментiв - aргiнaзи, уреази та глутаматдепд-рогенази [15] або октошндепдрогенази [16]. Недоль ком цих методiв е висока вaртiсть aнaлiзу, обумов-лена використанням к1лькох комерцiйних ферменпв. Тому пошук удосконалених ензиматичних методiв визначення L-Арг особливо в напрямку створення комерцiйно вигiдних ензиматичних тест-систем за використання ферменпв, селективних до те! амшо-кислоти е надзвичайно актуальним.
4. Мета дослiдження
Метою нашого дослiдження було розроблення ензиматичного методу aнaлiзу L-Арг на основi арп-нази I печiнки людини, видiлено! з клiтин рекомбь нантного штаму др1ждж1в H. polymorpha та комер-цiйно! уреази, а також ошнювання нового методу в порiвняннi з ввдомим хiмiчним методом aнaлiзу та iншими методами [17].
5. Матерiали та методи досл1дження
Як продуцент арпнази I печiнки людини ви-користовували рекомбiнaнтний штам др1ждж1в NCYC 495 H. polymorpha pGAP1#HsARG1 leu2car1:
h2n
//
HN
HN
HN'
LEU2(S. c). Штам мютить щльовий ген HsARGl шд контролем конститутивного промотора гена глщеральдепд-3-фосфатде-пдрогенази. Фермент вид1ляли i3 безклиин-ного екстракту штаму_продуцента шляхом афшно! колонково! хроматографи за розроб-леною нами схемою [17]. Актившсть арпна-зи визначали за швидшстю утворення сечо-вини [17]. Концентращю сечовини визначали в хiмiчнiй реакцп за iнструкцieю до набору для визначення сечовини виробництва НВФ «С1МКО», Львiв [18]. Розчин ферменту з питомою актившстю 600 мкмоль-хв--1 •мг-1 х х(600 Од./мг) було використано для розроб-ки ензиматичного методу анал1зу L-Арг.
Для приготування робочого реактиву: 5 г ОФА попередньо розведеного у 5 мл 96 % етанолу змiшували iз 100 мл боратного буфера, рН 10.5. Далi до отримано! сумiшi вносили 5 мг натрш сульфiту та штенсивно пе-ремiшували. Реагент зберiгали до викори-стання на темнотi при температурi +4 °С упродовж 1 доби.
Аналiз проводили за такою схемою: в скляш пробiрки вщбирали по 0,1 мл розведених в 30 мМ Трiс HCl, рН 8,8 (ТБ) дослвджуваних проб, а для по-будови градуювального графша - по 0,1 мл стан-дартних розчинiв L-Арг в 30 мМ ТБ, рН 8,8. Реакцш запускали додаванням 0,01 мл розчину аргiнази I в 30 мМ ТБ, рН 8,8 з вихвдними концентращями 16,5; 33,0; 49,5 та 66,0 Од./мл. 1нкубацшну сумiш пе-ремiшували та витримували при 37 °С протягом 15 хв. Далi до сумiшi вносили розчин уреази в 30 мМ ФБ, рН 7,5 з вихвдними концентращями 420; 210; 105; 50 та 25 Од./мл одержану сумш перемiшу-вали та витримували знову при 37 °С упродовж 15 хв. Далi в сумiш вносили 2.0 мл о-фталевого альдегиду (ОФА), прорвали на водянiй лазш при 60 °С протягом 15 хв та спектрофотометричним (при 360 нм) методом реестрували оптичну густину концевого кольорового продукту реакцп вщнос-но "слшоУ" проби (0,1 мл ТБ зашсть дослано! проби).
Визначення величини довжини хвил1 для за-безпечення максимуму поглинання реакцшно! сумiшi проводилось на спектрофотометрi SHIMADZU UV-1650 PC у широкому дiапазонi (250-700 нм) iз вико-ристанням стандартного програмного забезпечення "UVProbe 2.20". Результати дослвджень обробляли статистично.
6. Результати та Ух обговорення
Запропонований нами метод грунтуеться на ферментативному г1дрол1з1 L-Арг до L-орнiтину та сечовини (I стадiя реакцп, ензиматична) iз наступним пд-ролiзом утворено! сечовини до юшв амонiю пiд впли-вом уреази (II стадiя реакцп, ензиматична). Утворений амонш реагуе iз ОФА з утворенням продукту - 2Н-iзоiндол-l-тiолу, який к1льк1сно оцiнюеться спектрофо-тометрично (ОФА-СФ) при 360 нм [19]. Принципова схема реакцш, що лягли в основу методу визначення L-Арг, представлена на рис. 1.
NH
c—n—CH — CH — CH2~CH—COOH + H2O
HN
HN'
2
L-аргшш
:C=O + HN— CH
аргшаза, Стадiя 1
NH
CH—CH2—CH—COOH
сечовина
+
-C=O+2H„O + H
уреаза
Стадiя 2
L-орнiтин
2 NH + HCO,
сечовина
SH
о-фталевий альдегiд 2 Н -iзоiндол-1-тiол
Рис. 1. Схема реакцш при бьензимному визначенш L-Арг методом ОФА-СФ
Було встановлено, що максимум поглинання утвореного продукту хiмiчноl реакцп знаходиться в ультрафiолетовiй областi при 360 нм (рис. 2) [20].
OD
4.03.53.02.5-
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
300
400
600
700
500
нм
Рис. 2. Електронний спектр свгглопоглинання продукту взаемоди ОФА з 7 мМ КН4С1
Для розробки ензиматичного методу аналiзу Ь-Арг та забезпечення його надшносп, дослвджували умови проведення реакцп. З метою оптимiзацil умов першо! стадп експериментально змiнювали склад шкубацшно1 сумiшi та час проведення ензиматично! реакцп. Для оптимiзацil хiмiчноl стадп варшвали концентращю ОФА та умови для ефективного утворення продукту - тривалють на^вання. На основi отриманих даних визначено оптимальнi умови проведення ензиматично1 реакцп: 15 хв шкубацп iз обо-ма ферментами при 37 оС; концентрацiя арпнази I - 1,5 Од/мл; концентращя уреази - 35 Од/мл в шку-бацiйнiй сумiшi.
На хiмiчнiй стадп реакцп здiйснювали спек-трофотометричне визначення iонiв амонiю за ввдо-мим методом [19]. Нами дослвджено, що аналiтичний сигнал на амонш залежить ввд умов проведення
xiMiHHoi' peaKqii. 3MeHmeHHa KoHqeHTpaqii O®A Big 58 go 14,3 mm 3HanHO 36igbmyBago BeguHHHy ^gyopec-qeHqii, mo BaroMO BnguBago Ha pe3ygbTaT. -3k BugHo i3 puc. 3, giHiHHicTb BH3HaneHHH ioHiB aMoHiro go-cgig^yBaHHM C® MeTogoM 3HaxoguTbca b giana3oHi Big 0.7 ^M go 250 ^M. MigiMogapHHH Koe^iqieHT eK-CTHHKqii (§mM) O®A-C® MeTogy gga ioHiB aMoHiro CTa-
HoBHTb 6-10-6 MM-1
CM
D
360 2.52.0
1.0
0.0
0.1
0.2 0.3
NH CI, mM
0.4
0.5
4
a
D
360
1.81
1.6- A = 0,061±0,006
1.4- B = 0,006±1,15E-4
R=0,999
1.2- N=12
P<0.0001
1.0-
0.8- m.
0.6-
0.4-
0.2-
0.0- 1
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
NH CI, mkm
6
PHC. 3. OcHoBHi aHagiTHHHi napaMeTpu O®A-C®
MeTogy BH3HaneHHa aMoHiro: a -3age®Hicrb aHagiTHHHoro curaagy Big KoHqempami aMoHiro y ^oTOMeTpoBaHrn cyMimi; 6 - giana3oH gmiHHocri cneKTpo^oToMeTpHHHoro MeTogy BH3HaneHHa aMoHiro. Koe^imeHT B giHii perpecii BignoBigae ^mM npogyKTy peaKqii
Ha HacTynHin CTagii peaKqii - eH3HMaTHHHiH, 3a BHKopncTaHHH KoMepqiHHoi ypea3H - 3gmcHroBagu cneKipo^oTOMeTpHHHe KagiöpyBaHHa 3a KoHqempa-qiero cenoBHHH (puc. 4).
BugHo i3 puc. 4, ^mm gga O®A-C® — 9^10-6 mM-1 •cm- . HiHiHHicTb BH3HaneHHH cenoBHHH go-cgig^yBaHHM C® MeTogoM 3HaxoguTbca b giana3oHi Big 2 ^M go 250 ^M. nopiBHHHHH ^mM ioHiB aMoHiro (6-10-6 mM-1 •cm-1) Ta KapöaMigy (940-6 mM-1 •cm-1) cBig-
HHTb npo 80 %-Hy KoHBepciro KapöaMigy go npogyKTy eH3HMaTHHHoro rigpogi3y.
D,
360 3.0-,
2.5-
2.0-
0.0
100 200 300 400
cenobhha, mkm
500
D,
360 2.5-,
2.0-
1.5-
1.0-
0.5-
0.0
A = 0,043 ± 0,009 B = 0,009 ± 8,91E-5
R = 0,999 SD = 0,020 N = 8 P<0.0001
0 50 100 150 200 250
cenobhha, mkm
6
Phc. 4. OcHoBHi aHagiTHHHi napaMeTpu O®A-C® MeTogy BH3HaneHHa cenoBHHu: a - 3age®HicTb aHagiTHHHoro curHagy Big KoHqempami cenoBHHH y
^oTOMeTpoBaHrn cyMimi; 6 - giana3oH girnHHocri
eH3HMaTHHHo-cneKTpo$oToMeTpuHHoro O®A-C®
MeTogy BH3HaneHHa cenoBHHH. Koe^iqieHT B giHii perpecii BignoBigae ^mM npogyKTy peaKqii
Ha puc. 5. (a, 6) npegcraBgeHo pe3ygbTaTH no BHBneHHro 3age®HocTi omuHHoi rycruHH peaKqiHHoi cyMimi Big KoHqempami L-Apr Ta BcraHoBgeHHa giana-3oHy gmiHHocri gga O®A-C® MeTogy 3a onTHMi3oBa-hhx yMoB aHagi3y. HiHiÜHicTb KagiöpyBagbHoi KpuBoi gga aHagi3y L-Apr 36epiraeTbca b Me^ax 0,9 mkM -60 mkM L-Apr y ^oTOMeTpoBamn npoöi. noporoBa nyTguBicTb MeTogy - 850 hm. nopiBHaHHa ^mM cenoBH-hh (0.009 mM-1-cm-1) Ta L-Apr (0.017 mM-1 •cm-1) cBig-HHTb npo 94 %-Hy KoHBepciro L-Apr go npogyKTy eH-3HMaTHHHoro rigpogi3y.
,3ga HoBoro 6i-eH3HMHoro O®A-C® MeTogy go-cgig^yBagu cegeKTHBHicTb curHagy go pi3Hux aMiHo-KucgoT (3a KoHqempami 100 mkM).
1.5
0
a
0.5
0.0
D
360 2.5-,
1.5-
0.5-
D,
20 40 60 80
L-Арг, мкМ
A = 0,00425 ± 0,02 B = 0,017 ± 0.0001 R = 0.997 N = 7 P<0.0001
100
120
360 1.6-,
1.41.21.00.80.60.40.20.00 10 20 30 40 50 60
L-Арг, мкМ
б
Рис. 5. Основн1 аналиичш параметри ОФА-СФ методу визначення L-Арг: а - залежшсть аналп'ично-го сигналу ввд концентрацй' L-Арг у фотометрованш
сумш^ б - д1апазон лшшносп ензиматично-спектрофотометричного ОФА-СФ методу визначення L-Арг. Коефщент В лши регреси ввдповщае ^мМ продукту реакцй'
120-,
100-
80-
60-
40; I
20- ■
0 —I I r^^i1
0123456789 1011121314151617181920 Амiнокислоти
Рис. 6. Залежшсть свилопоглинання продукту взаемодп 0,1 мМ амшокислот з ОФА. Амшокислоти:
1 - L-Arg; 2 - Can; 3 - L-Glu; 4 - L-Gln; 5 - L-Lys; 6 - L-Pro; 7 - L-His; 8 - L-Ala; 9 - L-Cys; 10 - L-Leu;
11 - L-Tyr; 12 - L-Ser; 13 - L-Orn; 14 - L-Trp
Р1вень селективносп ензиматичного методу оцшювався у ввдносних одиницях (%) свилопогли-нання вщповщно до величини максимального сигналу, прийняту за 100 %. Як видно з рис. 6 спо-стертаеться значний штерферуючий вплив 0,1 мМ канавашну (90 %) та глютамшово! кислоти (38 %). 1нш1 амшокислоти не рееструвались запропоновани-ми методами, що можна пояснити високою селек-тившстю арпнази I до природного субстрату - L-Арг. Позитивний сигнал на канаванш пов'язаний 1з здатшстю г1дрол1зувати цю амшокислоту з утворен-ням сечовини. Цей факт е мало суттевим для анал1зу реальних зразк1в, оск1льки ця рщшсна амшокислота зустр1чаеться, як правило, пльки в насшш деяких рослин [21].
Таким чином, запропонований ензиматичний метод кшьшсного визначення L-Арг характеризуеть-ся б1льшою чутливютю (НМВ становить 850 нМ) у пор1внянн1 1з комерцшним набором "Ензим-тест" (НМВ становить 2,100 мкМ) та функцюнальшстю, що дозволяе визначати не лише один (L-Арг), а одра-зу три аналпи - L-Арг, сечовину та амонш (табл. 1).
0.0
0
а
Таблиця 1
Пор1вняльний анал1з ензиматичних метод1в визначення L-Арг
Метод
Аналгт Параметри ОФА-СФ Х=360 нм ''Ензим-тест" [22] Х=340 нм ДМО-ФЛ [14] Xex=380 нм ДМО-СФ [23] Xex=480 нм
[дана стаття] Xem=510 нм
L-Арг ЛД1 , йМ НМВ2, йМ 0,95-60 0,85 2,9-100 2,10 0,06-200 0,045 7-100 5
Сечовина ЛД, йМ НМВ, йМ 2,0-250 1.80 2,5-117 2,5 4,0-250 3,3 5,0-100 4,0
nh4+ ЛД, йМ НМВ, йМ 0,7-250 0,50 5,6-194,4 3,9 Н3 В н3 В
Примтка: ЛД- лттний diana30H, ¡M, НМВ - нижня межа визначення, ¡M, НВ - не визначали
Отже, у результат! проведених дослщжень при розробщ ензиматичного методу нами запропо-новано новий шдхвд для анал1зу L -Арг за викори-стання ферменлв (поеднання арпнази i уреази)
та спектрофотометричноЛ/флуоресцентно! детекцп кiнцевого продукту (амонiю), а також визначено оптимальний склад реакцшно! сумiшi та умови аналiзу.
7. Висновки
1. Розроблено чутливий та селективний метод к1льк1сного анал1зу L-Арг i3 спектрофотометричним способом детектування продукту реакцй' (амонiю) за допомогою ОФА. Метод базуеться на використанш високоочищено! аргiнази I, одержано! нами за влас-ною технологiею iз клiтин дрiжджового реком-бiнантного штама-надпродуцента.
2. Встановлено, що новому методу властива висока порогова чутливють визначення L-Арг (850 нМ), широкий дiапазон лiнiйностi - 0,95 мкМ -60 мкМ, а також нечутливють до штерферуючого впливу широкого спектру амшокислот.
3. Запропонована методика е простою у вико-наннi, не потребуе складно! пiдготовки зразк1в до аналiзу i може використовуватись для кшьшсного визначення вмiсту L-Арг в бюлопчних родинах та харчових продуктах.
Лiтература
1. Yokoro, M. Asymmetric dimethylarginine, an endogenous NOS inhibitor, metabolized in rat erythrocytes [Text] / M. Yokoro, M. Suzuki, K. Murota, C. Otsuka, H. Yam-ashita, Y. Takahashi et al. // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. - 2012. - Vol. 76, Issue 7. - P. 1334-1342. doi: 10.1271/bbb.120086
2. Rotondo, R. Arginase II is expressed by human lung cancer, but it neither induces immune suppression, nor affects disease progression [Text] / R. Rotondo, L. Mastracci, T. Piazza, G. Barisione, M. Fabbi, M. Cassanello et al. // International Journal of Cancer. - 2008. - Vol. 123, Issue 5. -P. 1108-1116. doi: 10.1002/ijc.23437
3. Lam, T. L. Recombinant human arginase inhibits the in vitro and in vivo proliferation of human melanoma by inducing cell cycle arrest and apoptosis [Text] / T. L. Lam, G. K. Wong, H. Y. Chow, H.-C. Chong, T.-L. Chow, S.-Y. Kwok et al. // Pigment Cell & Melanoma Research. -2011. - Vol. 24, Issue 2. - Р. 366-376. doi: 10.1111/j.1755-148x.2010.00798.x
4. Glazer, E. S. Bioengineered human arginase I with enhanced activity and stability controls hepatocellular and pancreatic carcinoma [Text] / E. S. Glazer, E. M. Stone, C. Zhu, K. L. Massey, A. N. Hamir, S. A. Curley // Translational Oncology. - 2011. - Vol. 4, Issue 3. - P. 138-146. doi: 10.1593/tlo.10265
5. Vynnytska-Myronovska, B. Single amino acid arginine starvation efficiently sensitizes cancer cells to canavanine treatment and irradiation [Text] / B. Vynnytska-Myronovska, Y. Bobak, Y. Garbe, C. Dittfeld, O. Stasyk, L. A. Kunz-Schughart // International Journal of Cancer. - 2012. -Vol. 130, Issue 9. - P. 2164-2175. doi: 10.1002/ijc.26221
6. Morales, S. M. Cystinuria: diagnosis and therapeutic approach [Text] / S. M. Morales // An. Sist. Sanit. Navar. -2011. - Vol. 34, Issue 3. - Р. 453-461.
7. Lacroix, C. Label-free quantitative urinary proteo-mics identifies the arginase pathway as a new player in congenital obstructive nephropathy [Text] / C. Lacroix, C. Caubet, A. Gonzalez-de-Peredo, B. Breuil, D. Bouyssie, A. Stella et al. // Molecular & Cellular Proteomics. -2014. - Vol. 13, Issue 12. -Р. 3421-3434. doi: 10.1074/mcp. m114.040121
8. Cohen, S. I. The determination of arginine released in human blood plasma after plasminogen activation. Use of a cation-exchange resin [Text] / S. I. Cohen // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 1960. - Vol. 86, Issue 2. -P. 166-168. doi: 10.1016/0003-9861(60)90397-0
9. Costin, J. Selective determination of amino acids using flow injection analyses coupled with chemiluminescence detection [Text] / J. Costin, F. Paul, S. Lewis // Anal. Chim. Acta. -2003. -Vol. 408, № 1. -P.67-77.
10. Fritz, J. H. Arginine cools the inflamed gut [Text] / J. H. Fritz // Infection and Immunity. - 2013. - Vol. 81, Issue 10. - P. 3500-3502. doi: 10.1128/iai.00789-13
11. Гайда, Г. З. Методи анатзу L-аргшшу ^кст] / Г. З. Гайда, Н. £. Стасюк, М. В. Гончар // Biotechnologia Acta. - 2014. - Vol. 7, Issue 1. - Р. 31-39. doi: 10.15407/ biotech7.01.031
12. Stasyuk, N. A new bi-enzyme potentiometric sensor for arginine analysis based on recombinant human arginase I and commercial urease [Text] / N. Stasyuk, O. Smutok, G. Gayda et al. // J. Mater. Sci. Eng. A. - 2011. - Vol. 1, Issue 6. -P. 819-827.
13. Stasyuk, N. Bi-enzyme L -arginine-selective ampe-rometric biosensor based on ammonium-sensing polyaniline-modified electrode [Text] / N. Stasyuk, O. Smutok, G. Gayda,
B. Vus, Y. Koval'chuk, M. Gonchar // Biosensors and Bioelectronics. - 2012. - Vol. 37, Issue 1. - P. 46-52. doi: 10. 1016/j.bios.2012.04.031
14. Stasyuk, N. L-arginine assay with the use of arginase I [Text] / N. Stasyuk, G. Gaida, M. Gonchar // Applied Biochemistry and Microbiology. -2013. - Vol. 49, Issue 5. -P. 529-534. doi: 10.1134/s000368381305013x
15. Mira O. R. Quantitative determination of L-arginine by enzymatic End-Point analysis [Text] / O. R. Mira // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2001. - Vol. 49, Issue 2. - P. 549-552. doi: 10.1021/jf000522y
16. Gaede, G. A rapid and specific enzymatic method for the estimation of L-arginine [Text] / G. Gaede, M. Grieshaber // Analytical Biochemistry. - 1975. - Vol. 66, Issue 2. - P. 393-399. doi: 10.1016/0003-2697(75)90606-5
17. Стасюк, Н. Синтез афшних сорбентш для очи-щення аргшази I людини iз рекомбшантних дрiжджiв Hansenula polymorpha [Tекст] / Н. Стасюк, Г. Гайда, А. Гайда та ш. // Пращ Н1Ш. Сер. "Хемiя i Бiохемiя" -2011. - T. 28. - С. 139-149.
18. Меньшиков, В. В. Лабораторные методы исследования в клинике [Tекст] / В. В. Меньшиков. - М. : Медицина, 1987. - C. 215-219.
19. Kuo, M. T. Targeted cellular metabolism for cancer chemotherapy with recombinant arginine-degrading enzymes [Text] / M. T. Kuo, N. Savaraj, L. G. Feun // Oncotarget. -2010. - Vol. 1, Issue 4. - P. 246-251.
20. Goyal, S. Determination of ammonium ion by fluorometry or spectrophotometry after on-line derivatization with o-phthalaldehyde [Text] / S. Goyal, D. Rains, R. Huffa-ker // Analytical Chemistry. - 1988. - Vol. 60, Issue 2. -P. 175-179. doi: 10.1021/ac00153a016
21. Ekanayake, S. Canavanine content in sword beans (Canavalia gladiata): analysis and effect of processing [Text] / S. Ekanayake, К. Skog, N. G. Asp // Food and Chemical Toxicology. - 2007. - Vol. 45, Issue 5. - P. 797-803.doi: 10. 1016/j.fct.2006.10.030
22. L-Arginine/Urea/Ammonia, UV method [Electronic resource]. - Available at: https://www.nzytech.com/products-services/analytical-test-kits/ak00171/
23. Стасюк, Н. £. Ензиматичний метод визначення вмюту L-аргшшу за використання рекомбшантно! аргшази I людини [Tекст] / Н. £. Стасюк, Г. З. Гайда, А. В. Гайда та ш. // Ukrainica Biorganica Acta. - 2012. - Vol. 1. - P. 31-37.
References
1. Yokoro, M., Suzuki, M., Murota, K., Otsuka,
C., Yamashita, H., Takahashi, Y. et. al. (2012). Asymmetric Dimethylarginine, an Endogenous NOS Inhibitor, Is Actively
Metabolized in Rat Erythrocytes. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 76 (7), 1334-1342. doi: 10.1271/bbb.120086
2. Rotondo, R., Mastracci, L., Piazza, T., Barisione,
G., Fabbi, M., Cassanello, M. et. al. (2008). Arginase 2 is expressed by human lung cancer, but it neither induces immune suppression, nor affects disease progression. International Journal of Cancer, 123 (5), 1108-1116. doi: 10.1002/ijc.23437
3. Lam, T.-L., Wong, G. K. Y., Chow, H.-Y., Chong,
H.-C., Chow, T.-L., Kwok, S.-Y. et. al. (2010). Recombinant human arginase inhibits the in vitro and in vivo proliferation of human melanoma by inducing cell cycle arrest and apoptosis. Pigment Cell & Melanoma Research, 24 (2), 366-376.
doi: 10.1111/j.1755-148x.2010.00798.x
4. Glazer, E. S., Stone, E. M., Zhu, C. et al. (2011). Bi-oengineered human arginase I with enhanced activity and stability controls hepatocellular and pancreatic carcinoma Transl. Oncol, 4 (3), 138-146.
5. Glazer, E. S., Stone, E. M., Zhu, C., Massey, K. L., Hamir, A. N., & Curley, S. A. (2011). Bioengineered Human Arginase I with Enhanced Activity and Stability Controls Hepatocellular and Pancreatic Carcinoma Xenografts. Tran-slational Oncology, 4(3), 138-146. doi:10.1593/ tlo.10265
6. Morales, S. M. Cystinuria: diagnosis and therapeutic approach. (2011). An. Sist. Sanit. Navar, 34 (3), 453-461.
7. Lacroix, C., Caubet, C., Gonzalez-de-Peredo, A., Breuil, B., Bouyssie, D., Stella, A. et. al. (2014). Label-free Quantitative Urinary Proteomics Identifies the Arginase Pathway as a New Player in Congenital Obstructive Nephropathy. Molecular & Cellular Proteomics, 13 (12), 3421-3434. doi: 10.1074/mcp.m114.040121
8. Cohen, S. I. (1960). The determination of arginine released in human blood plasma after plasminogen activation. Use of a cation-exchange resin. Archives of Biochemistry and Biophysics, 86 (2), 166-168. doi: 10.1016/0003-9861 (60)90397-0
9. Costin, J., Paul, F., Lewis, S. (2003). Selective determination of amino acids using flow injection analyses coupled with chemiluminescence detection, Anal. Chim. Acta., 408 (1), 67-77.
10. Fritz, J. H. (2013). Arginine Cools the Inflamed Gut. Infection and Immunity, 81 (10), 3500-3502.
doi: 10.1128/iai.00789-13
11. Gayda, G. Z., Stasyuk, N. Ye., Gonchar, M. V. (2014). The methods of L-Arginine analysis (Review), Biotechnologia Acta, 7 (1). 31-39. doi: 10.15407/biotech7.01.031
12. Stasyuk, N., Smutok, O., Gayda, G. et al. (2011). A new bi-enzyme potentiometric sensor for arginine analysis based on recombinant human arginase I and commercial urease. J. Mater. Sci. Eng. A., 1 (6), 819-827.
13. Stasyuk, N., Smutok, O., Gayda, G., Vus, B., Ko-val'chuk, Y., Gonchar, M. (2012). Bi-enzyme l-arginine-selective amperometric biosensor based on ammonium-sensing polyaniline-modified electrode. Biosensors and Bioelectronics, 37 (1), 46-52. doi: 10.1016/j.bios.2012.04.031
14. Stasyuk, N. E., Gaida, G. Z., Gonchar, M. V. (2013). L-arginine assay with the use of arginase I. Appl Biochem Microbiol, 49 (5), 529-534. doi: 10.1134/ s000368381305013x
15. Mira de Orduna, R. (2001). Quantitative Determination of l -Arginine by Enzymatic End-Point Analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49 (2), 549-552. doi: 10. 1021/jf000522y
16. Gaede, G., Grieshaber, M. (1975). A rapid and specific enzymatic method for the estimation of l-arginine. Analytical Biochemistry, 66 (2), 393-399. doi: 10.1016/0003-2697(75)90606-5
17. Stasyuk, N., Gayda, G., Gayda, A. et al. (2011). The synthesis of affinity sorbents for purification of human arginase I from the recombinant yeast Hansenula polymorpha. Proc. Shevchenko Sci. Soc. Ser. Biochem, 28, 139-149.
18. Menshykov, V. V. (1987). The methods of laboratory investigations in clinical diagnostics. Moscow: Medicine, 215-219.
19. Kuo, M. T., Savaraj, N., Feun, L. G. (2010). Targeted cellular metabolism for cancer chemotherapy with recombinant arginine-degrading enzymes. Oncotarget, 1 (4), 246-251.
20. Goyal, S. S., Rains, D. W., Huffaker, R. C. (1988). Determination of ammonium ion by fluorometry or spectro-photometry after on-line derivatization with o-phthalaldehy-de. Analytical Chemistry, 60 (2), 175-179. doi: 10.1021/ ac00153a016
21. Ekanayake, S., Skog, K., Asp, N.-G. (2007). Ca-navanine content in sword beans (Canavalia gladiata): Analysis and effect of processing. Food and Chemical Toxicology, 45 (5), 797-803. doi: 10.1016/j.fct.2006.10.030
22. L-Arginine/Urea/Ammonia, UV method. Available at: https://www.nzytech.com/products-services/analytical-test-kits/ak00171/
23. Stasyuk, N. Ye., Gayda, G. Z., Gayda, A. V. et al. (2012). Enzymatic assay of L-arginine by the use of recombinant human arginase I. Ukrainica Biorganica Acta, 1, 31-37.
ffama Hadxodwemn pyKonucy 22.05.2015
CTaeroK HaTa.iH CBremBHa, KaHgHgaT xiMiHHHx HayK, MogogmHH HayKoBHH cniBpo6iTHHK, Biggig AHagiTHHHOi 6ioTexHogorii, iHCTHTyT 6iogorii' KgiTHHH HAH yKpai'HH, Byg. flparoMaHOBa 14/16, m. .bBiB, yKpaiHa, 79005 E-mail: stasuk_natalia@ukr.net
Eacc Co^ia PoeTHcaBiBHa, .bBiBCbKHH Ha^oHagbHHH ymBepcmeT iM. iBaHa ®paHKa, Byg. TpymeBCbKoro 4, m. .bBiB, yKpaiHa, 79005 E-mail: bass8@ukr.net
Tafiga Ta.HHa 3y$apiBHa, KaHgHgaT xiMiHHHx HayK, CTapmHH HayKoBHH cniBpo6iTHHK, Biggig AHagrraHHoi 6ioTexHogorii, iHCTHTyT 6iogorii' KgiTHHH HAH yKpai'HH, Byg. ^paroMaHoBa 14/16, m. .bBiB, yKpaiHa, 79005 E-mail: galina.gayda@gmail.com
XacMiK CypeHiBHa CnpeMHH, KaHgHgaT xiMiHHHx HayK, crapmHH HayKoBHH cniBpo6iTHHK, HayKoBHH ^Hip «ApM6ioTexHogoria» HAH BipMeHia, Byg. TypiaH 14, m. GpeBaH, BipMeHia, 0056 E-mail: blackeye03@rumbler.ru
ToH^ap MHxafi.ro BacH.tOBHH, goKTop 6iogoriHHHx HayK, npo^ecop, 3aBigyBaH Biggigy AHagiTHHHoi 6io-TexHogorii', iHCTHTyT 6iogorii KgiTHHH HAH yKpai'HH, Byg. ^paroMaHoBa, 14/16, m. .bBiB, yKpaiHa, 79005 E-mail: mykhailo1952@gmail.com
