CC BY
146
УДК 543.94
МЕТОДИ АНАЛІЗУ L-АРГІНІНУ
Г. З. ГАЙДА1, Н. Є. СТАСЮК1, М. В. ГОНЧАР1, 2
1Інститут біології клітини НАН України, Львів
2Інститут прикладної біотехнології і фундаментальних наук,
Жешувський університет, Польща
E-mail: galina_gayda@yahoo.com
Отримано 24.05.2013
Розглянуто сучасні фізико-хімічні та ензиматичні методи кількісного визначення L-аргініну. Більшість відомих методів визначення L-аргініну мають низку недоліків, основні з яких: низька селективність (хімічні), громіздкість та висока вартість апаратури (фізико-хімічні), недостатня стабільність (операційна та під час зберігання — біосенсори), чутливість до інтерферуючого впливу супутніх речовин. Тому розроблення високоселективних і чутливих методів визначення вмісту L-аргініну, зокрема ензиматичних, з метою поліпшення системи моніторингу його рівня в медичній діагностиці та харчовій промисловості є актуальною проблемою.
Наведено результати власних досліджень щодо створення та апробації ефективних ензиматичних, зокрема біосенсорних, методів аналізу L-аргініну з використанням аргінази І печінки людини, виділеної з клітин рекомбінантних дріжджів Hansenula рolymorpha NCYC-495 pGAP1-HsARG1 (leu-2car1 Sc:LEU2). Аргіназа (КФ 3.5.3.1; L-аргінін-амідиногідролаза) відіграє вирішальну роль у гідролітичному розщепленні L-аргініну до L-орнітину та сечовини. Результати апробації створених на основі аргінази І амперометричних та потенціометричних біосенсорів, а також ензиматичних методів зі спектрофотометричною та флуоресцентною детекцією продукту свідчать про їхню ефективність для експрес-аналізу вмісту L-аргініну в фармацевтичних препаратах. Розроблені методи можуть бути перспективними для визначення L-аргініну в харчових продуктах (соках та винах), а також у сироватці крові для діагностики та контролю під час лікування деяких видів онкологічних захворювань. Висока селективність і простота запропонованих методів дадуть змогу істотно полегшити процедуру аналізу та замінити використовувані на цей час низькоселективні хімічні й дорогі хроматографічні методи.
Ключові слова: аналіз L-аргініну, біосенсори, аргіназа I.
Амінокислота аргінін: Ь-А^ (а-аміно-8-гуанідино-валеріанова кислота) — попередник Ь-орнітину, Ь-цитруліну, Ь-глутатіону, у-аміномасляної кислоти, спермітину та інших сполук — одна з найбільш поляризованих, позитивно заряджених амінокислот [1].
Метаболізм Ь-А^ здійснюється, щонайменше, двома альтернативними шляхами: 1) окисним (за участю КО-синтази) з утворенням Ь-цитруліну та N0; 2) неокисним (за участю аргінази І) з утворенням Ь-орнітину та сечовини. Можливий і одночасний перебіг цих двох процесів [2].
У біосистемах Ь-А^ відіграє важливу роль у синтезі низки анаболічних гормонів, поліамінів та оксиду азоту.
Практично весь ланцюг перетворень Ь-А^ на похідні (Ь-орнітин, путресцин, Ь-цитрулін, спермідин) відбувається в трьох органах — кишечнику, печінці та нирках [3].
Рівень Ь-А^ в плазмі крові визначають за внутрішньовенного введення Ь-А^ у процесі діагностики та експериментального дослі-
дження захворювань ендокринної системи [4]. Відомо також, що визначення концентрації Ь-А^ у сироватці крові уможливлює діагностику та вивчення особливостей перебігу таких складних захворювань, як гепатокар-цинома, меланоми шкіри та колоректальний рак [5-12]. Вимірювання концентрації Ь-А^ в сечі дає змогу діагностувати гомозиготну цистинурію [13].
У харчовій промисловості вміст Ь-А^ в амінокислотному складі сировини визначають з метою порівняння біохімічної цінності різних сортів м’яса та м’ясопродуктів [14]. Іншою важливою причиною моніторингу рівня Ь-А^ у харчових продуктах, зокрема у соках та винах, є принципова можливість утворення канцерогенного етилкарбамату — кінцевого продукту метаболізму Ь-А^ під дією мікроорганізмів [15].
На сьогодні визначення концентрації Ь-А^ в розчинах проводять методами: іонообмінної хроматографії [16, 17], флюори-метрії [18], спектрофотометрії [19-26],
капілярного [27], зонного електрофорезу [28], полярографії [29], проточно-інжекційного аналізу [30], високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) [31] та ензиматичними [32-34].
Перші спроби колориметричного (спектрофотометричного — СФ) визначення Ь-А^ обмежувались реакцією Сакагучі з а-наф-толом та натрію гіпохлоритом [20]. У подальших модифікаціях цього методу застосовували різноманітні хромогенні агенти, що містили: діацетил-а-нафтол [21], 2-ме-тил-а-нафтол [22], 5-хлоро-7-йодо-8-гідрокси-хінолін (5-хлоро-7-йодо-ГХ) [23], а-нафтол та 2,3-бутандіонмонооксим — метод Вогес-Про-скауера [24], тимол-(2-пропіл-5-метил)фенол
і натрію гіпоброміт (метод Састрі) [25]; 8-гід-роксихінолін (ГХ) та натрію гіпоброміт [26]; п-нітрофенілгліоксаль та натрію аскорбат [19]; 1,2,4 -тригідроксіантрахінон (ТГАХ) та гідрогену пероксид [35]. У табл. 1 наведено порівняльні характеристики найпоширеніших СФ-методів визначення Ь-А^. Застосування цих методів у біологічних рідинах (плазмі та сечі) обмежується їхньою низькою селективністю, спричиненою позитивною реакцією на гуанідинові сполуки, тобто на точність вимірювань можуть впливати відносно високі концентрації Ь-лізину, Ь-проліну, Ь-цитру-ліну тощо [20, 35]. Ь-А^ у реальних зразках можна відокремлювати від інтерферуючих сполук, застосовуючи іонообмінні смоли [36], проте це ускладнює процедуру аналізу.
Найбільшого поширення набули хроматографічні методи кількісного аналізу Ь-А^. Чутливий проточно-інжекційний хемілюмінесцентний (ХЛ) метод базується на взаємодії Ь-А^ з натрію гіпобромітом, однак критичним моментом реакції є низька стабільність цього реагенту [37]. Інший варіант проточно-інжекційного методу базується на
реакції L-Arg з трис-(2,2-біпіридил) рутенієм (III) за pH 10 з утворенням ХЛ-продукту. Недоліком цієї методики є неспецифічна взаємодія з іншими амінокислотами та необхідність попереднього відокремлення L-Arg на графітовому сорбенті С18 [38]. Застосування методу ВЕРХ із попередньою дериватизаці-єю L-Arg о-фталевим альдегідом дає змогу-досягти порогової чутливості до 0,3 мкг/мл (1,7 мкМ) [39].
Запропоновано визначення L-Arg за допомогою лазерної флуоресцентної спектроскопії [40], але цей підхід не набув широкого застосування на практиці, оскільки, як і більшість інших фізико-хімічних методів, потребує спеціального обладнання і операторів високої кваліфікації.
Для кількісного аналізу L-Arg розроблено ензиматичні методи з використанням трьох ензимів — аргінази, уреази та глутамат-дегідрогенази [33] або октопіндегідрогенази [34]. Чутливість мультиензимного методу —
2 мкМ L-Arg (0,35 мкг/мл), лінійний діапазон визначення — до 0,47 мМ (81,8 мкг/мл) [33]. Недоліком цих методів є висока вартість аналізу, зумовлена використанням кількох комерційних ензимів.
На сьогодні відомо кілька типів біосен-сорів на L-Arg, які відрізняються природою біоелемента (клітинний, ензимний), матеріалом електроду та характером перетворювача. Перші спроби визначення L-Arg клітинним біосенсором зробив Rechnitz [41], який закріпив шар клітин Streptococcus faecium на поверхні амонійселективного електрода (АСЕ). Згодом на поверхні газового чутливого електрода було іммобілізовано інші бактерії — Streptococcus lactis [42]. Розроблено інтегральні амперометричні біосенсори для визначення L-амінокислот, які конструктивно складаються з кисневого електрода та газо-
Таблиця 1. Порівняльний аналіз фізико-хімічних методів визначення L-Arg
Метод Amax, нм є, мМ ^см 1 Порогова чутливість Лінійний діапазон Час, хв
мкг/мл мМ мкг/мл мМ
СФ Сакагучі[20] 15,7 525 0,7 4,010-3 1,0-45 0,006-0,26 40
5-хлоро-7-йодо-ГХ [23] 57,4 440 0,9 5,210-3 1,0-100 0,006-0,57 10
Вогес-Проскауера [24] 3,07 535 0,8 4,610 3 1,0-100 0,006-0,57 30
Састрі [25] 13,0 440 0,3 1,710-3 - - 40
ГХ [26] 66,0 500 1,2 6,910 3 1,5-12 0,009-0,07 10
«-Нітрофенілгліоксаль [19] - 475 - - 0,03-0,33 (0,2-2,0)10 3 30
ТГАХ [35] - 540 1,5 8,610 3 4,4-87,5 0,03-0,50 5
ХЛ Натрію гіпоброміт [37] - - 0,02 0,110-3 0,52-21,1 0,003-0,12 40
Трис-(2,2-біпіридил)-
рутеній [38] - - 0,610 3 3,4-10 6 (0,8-1,5) '10 3 (4,5-8,6)-10 6 30
Зонний електрофорез [28] - - 3,0 0,02 6,0-1 000 0,03-5,74 60
ВЕРХ, дериватизація [39] - - 0,3 2,010-3 1,0-500 0,006-2,87 40
проникної мембрани. Для визначення Ь-А^ як біоселективний елемент такого сенсора застосовано аргініндекарбоксилазу [43].
У більшості ензимних біосенсорів як біо-селективний елемент на Ь-А^ застосовують ензими аргіназу та уреазу, що включені в желатинову мембрану та іммобілізовані на поверхні електрода. Для реєстрації сигналу використовують потенціометричні [41,
42, 44-49] (зазвичай на основі рН-залежних чутливих польових транзисторів та газових електродів), флуоресцентні оптоволоконні [50], кондуктометричні [51, 52] трансдуктори. Порівняльну характеристику відомих сенсорних систем для аналізу Ь-А^ наведено в табл. 2.
Потенціометричні ензимні сенсорні системи на основі АСЕ та кондуктометричні біосенсори характеризуються високою чутливістю, операційною стабільністю і швидким часом відгуку на аналіт [48-52], але їхнім недоліком є низька селективність до низки амінокислот, зокрема глютамінової кислоти та Ь-лізину. Надзвичайно висока чутливість (10-9 М) досягається, згідно з даними Каиг [50], для напівкількіс-ного варіанта методу оцінювання аргініну
з використанням нейлонових золь-гель-мемб-ран, кон’югованих з аргіназою та уреазою. За кількісної реєстрації сигналу амонійсе-лективним біоелектродом та модифікованим родаміном 60 оптоволоконним електродом (оптроном) чутливість оцінюється в нано- та пікомолях, відповідно [50].
Різновид кондуктометричної сенсорної системи із п’єзокристалом (SAW- або ПАХ-сенсор) функціонує завдяки явищам поверхневих акустичних хвиль і змін провідності [52]. Принцип дії такої системи полягає у вимірюванні частотного зсуву, який відбувається в результаті генерування іонів амонію в ході послідовних ензиматичних реакцій гідролізу L-Arg за участю аргінази та уреази.
Таким чином, більшість існуючих методів визначення концентрації L-Arg потребує значних витрат часу, високовартісного обладнання, додаткової пробопідготовки та високої кваліфікації персоналу. Показано, що більшість із них має низку недоліків, а саме: низьку селективність (хімічні), громіздкість та високу вартість апаратури (фізико-хіміч-ні), необхідність у використанні додаткових реагентів або ензимів (ензиматичні), недостатню стабільність (операційна та під час зберігання) і чутливість до інтерферуючого впливу супутніх речовин (більшість відомих біосенсорних методів). При цьому існуючі біосенсори та сенсорні системи характеризуються низькою чутливістю (10-4 М) [48], вузьким лінійним діапазоном вимірюваних концентрацій аналіту (0,01-4,0 мМ), а також низькою селективністю [51]. Створення біосенсорів для визначення L-Arg може спростити та поліпшити систему моніторингу концентрації цього аналіту в медицині та харчовій промисловості. Нами здійснено дослідження щодо розроблення
Таблиця 2. Порівняльна характеристика різних типів біосенсорів для аналізу Ь-А^ [53]
Спосіб реєстрації сигналу Біоелемент Нижня межа визначення, Мз Лінійний діапазон, мМ Час відгуку (95%), хв Стабільність, діб
Потенціометрія, АСЕ2 [41] Бактерійні клітини - 0,05-1,0 - -
Потенціометрія, N^3 газовий електрод[42] Бактерійні клітини - 0,008-1,0 - -
Потенціометрія, МН3 газовий електрод[44] У/A1 - 0,03-3,0 5,0 -
Потенціометрія, рН-електрод [45] У/A - 0,025-0,3 10,0 -
Потенціометрія, рН-електрод [46] У/A - 0,01-1,0 - -
Потенціометрія, рН-електрод [47] У/A - 0,1-1,0 - -
Потенціометрія, АСЕ [48] У/A 0,01 0,1-30,0 1,5-4,0 21
Потенціометрія, АСЕ [50] У/A 0,510-6 10-6-103 0,7-5,0 60
Флуорометрія, оптоволоконний оптрод[50] У/A 0,510-9 10-9-103 0,5-10,0 40
Кондуктометрія [51] У/A 0,0005 0,01-4,0 2,0 45
Кондуктометрія ПАХ-сенсор [52] У/A 0,002 0,002-0,4 1-13 -
Примітка. 1) У/A — уреаза і аргіназа; 2) АСЕ — амонійселективний електрод.
сенсорних систем для кількісного визначення Ь-А^ [53-55]. Основним біорозпізнаваль-ним елементом сконструйованих біосенсорів була високооочищена аргіназа І печінки людини (далі — аргіназа), виділена нами з клітин рекомбінантних дріжджів H. рolymorpha за власною технологією [56, 57]. Принцип дії запропонованих систем полягає у детектуванні амонійселективним електродом іонів амонію, які утворюються в результаті двох послідовних ензиматичних реакцій, каталізованих аргіназою та уреазою:
аргіназа
Ь-аргінін-------------> Ь-орнітин + МН2СОЫН2;
NH2CONH2 + H2O + H+
NH4+ + HCO3-
Сконструйований біоелемент потенціометричного біосенсора [54], що містив аргіназу (з активністю 900 Од-мг1) у комбінації з комерційною уреазою (КФ 3.5.1.5, тип IX із бобів, 26100 Од-мг-1), дає позитивний відгук на Ь-А^, причому спостерігається чітка лінійність (у напівлогарифмічній шкалі) потенціометричного сигналу в діапазоні концентрацій у межах від 0,50 до 10,0 мМ (рис. 1, а). Чутливість біосенсора становить 34,7 мВ на декаду (И = 0,994). 95% відгуку біосенсора досягається через 5 хв після внесення Ь-А^. Величина позірної константи Міхаеліса-Мен-тен (Кт) для Ь-А^ — 4,7±0,4 мМ (рис. 1, а).
Для дослідження можливості поліпшення деяких фізико-хімічних характеристик сконструйованого потенціометричного біо-сенсора аргіназу іммобілізували на золотих наночастинках (Аи-НЧ) [58, 59].
На рис. 1, б наведено лінійний діапазон біосенсора з архітектурою біоселективного шару: аргіназа-Аи-НЧ та уреаза [54]. Зафіксовано чітку лінійність потенціометричного відгуку в діапазоні концентрацій від 0,12
до 40,0 мМ. Чутливість біосенсора становить 26,2 мВ на декаду (И = 0,998), а величина позірної Кт для Ь-А^ — 1,1 ± 0,2 мМ (рис. 1, б). 95% відгуку біосенсора досягалось через 5 хв після внесення Ь-А^. Таким чином, формування біоселективного шару аргіназа-Аи-НЧ дало змогу знизити нижню межу визначення Ь-А^ від 0,5 мМ (рис. 1, а) до 0,12 мМ (рис.
1, б), підвищивши тим самим чутливість біосенсора в 4,2 раза. Ці результати свідчать про принципову можливість потенціометричного біосенсорного аналізу Ь-А^ за допомогою біензимного електрода, який складається
з аргінази, іммобілізованої на металевих НЧ, та уреази.
На основі аргінази, уреази та електро-осадженого поліаніліну (ПАн) нами вперше створено амперометричний біосенсор для кількісного визначення Ь-А^ та досліджено його фізико-хімічні характеристики [53]. Для конструювання чутливого до іонів амонію хемосенсора на ПАн-платформі використано ЫаАоп як компенсатор негативного заряду, що виникає в процесі анодної полімеризації ПАн. Оптимальну кількість циклів (11) електроосадження ПАн на поверхні Р^електрода з попередньо адсорбованим Ыайоп було обрано експериментально [60]. Створюючи біензимний амперометрич-ний сенсор на Ь-А^, біоселективний шар формували шляхом почергової іммобілізації комерційної уреази та аргінази на поверхні Р^електрода, модифікованого ПАн-Ыайоп [53]. Схематичне зображення принципу дії біосенсора подано на рис. 2. Принцип детектування Ь-А^ базувався на генеруванні в результаті послідовних ензиматичних реакцій іонів амонію, які прямують до поверхні шару ПАн-Ыайоп, спричинюючи відновлення плівки ПАн на поверхні Р^електрода та змінюючи при цьому редокс-потенціал.
я 180
Е
Ы
160
140
120 ч
Ъ-А-В*Х R = 0,985 Л = 147,52 ±2,15 В = 34,73 ± 2,01
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
180
170
160
OS 150
Е
-140
М
130
120
110
100
Y=A+B*X R = 0,995 А = 135,45 ±0,87 В = 26,23 ± 0,88
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
lg С (L-Arg), мМ lg С (L-Arg), мМ
Рис. 1. Залежність потенціометричного відгуку від концентрації L-Arg для біензимного електрода, отриманого шляхом включення в 2%-ну кальційальгінатну мембрану (ЗО мМ Хепес-буфер, рН 7,5; 24 °С): аргінази та уреази (а); aргiнaзи-Au-НЧ та уреази (б)
Рис. 2. Схема конверсії аналіту та перенесення електронів при функціонуванні амперометричного біосенсора на основі:
аргінази І, уреази та ПАн^аНои /Р^електрода
Результати хроноамперометричного дослідження відгуку біензимного сенсора з архітектурою селективного шару аргіназа-уре-аза-ПАн-ЫаАоп/Р'Ь-електрод на внесений Ь-Агд зображено на рис. 3. Лінійність відгуку сконструйованого біосенсора спостерігається в інтервалі концентрацій 0,07 мМ-0,6 мМ (И = 0,999). На основі концентраційної залежності, поданої на рис. 3, встановлено, що для біензимного сенсора максимальний струм насичення становить 1280 ± 160 нА (чутливість сконструйованого біосенсора — 110 ± 1,3 нА-мМ -1-мм-2) з нижньою межею визначення Ь-Агд 3,810-5 М.
Величина позірної Кт амперометричного біосенсора для Ь-Агд становить 1,28±0,29 мМ. Швидкість розвитку відгуку сенсора на ана-літ є високою: 50% відповіді в стаціонарному стані досягалася за 4 с, а 95% відповіді — на 10-ту секунду вимірювання. рН-оптимум створеного сенсора лежить в інтервалі 7,37,6. Біосенсор відзначається високою селективністю (позитивний сигнал, крім аргініну, лише на канаванін), широким діапазоном лінійності (0,07-0,6 мМ) та задовільною операційною стабільністю.
Рис. 3. Градуювальний графік залежності сили струму від концентрації Ь-А^ для аргіназа-уреаза-ПАн-КаАоп/Рі-електрода.
Умови хроноамперометричного дослідження: потенціал -200 мВ; 30 мМ ФБ; рН 7,5; 22 °С
Нами розроблено ензиматичний метод кількісного визначення вмісту Ь-Агд з використанням аргінази [61, 62]. Метод ґрунтується на ензиматичному гідролізі Ь-Агд до Ь-орнітину та карбаміду (І стадія реакції, ензиматична). Карбамід під час нагрівання в кислому середовищі взаємодіє з 2,3-бутан-діонмонооксидом (ІІ стадія, хімічна) з утворенням кольорового продукту. Як результат, кількісно оцінити вміст Ь-Агд можна спектрофотометрично (Е-СФ метод) за оптичною густиною при А = 480 нм [61] або ж флуоресцентно (Е-ФЛ метод) за інтенсивністю випромінювання при А = 510 нм [62].
Досліджено кількісний склад робочого реагенту для проведення реакції та оптимізо-вано умови аналізу. Визначено, що лінійність калібрувальної кривої для Е-СФ-методу зберігається в межах 7 мкМ — 0,1 мМ у фотометро-ваній пробі (рис. 4, а), нижня межа визначення Ь-Агд — 5 мкМ. Для Е-ФЛ-методу діапазон лінійності є набагато ширшим (57 нМ — 0,2 мМ у фотометрованій пробі), а нижня межа визначення Ь-Агд (45 нМ) є нижчою (рис. 4, б).
Можливість практичного застосування всіх розроблених методів з використанням аргінази вивчали на зразках промислових фармацевтичних препаратів: «Тивортину» (Т), «Цитраргініну» (Ц), «Аміноплазмалю» 10% Е (А). Як свідчить порівняльний аналіз результатів визначення вмісту Ь-Агд у цих зразках різними методами [62], запропоновані біосенсорні та ензиматичні методи дають результати, які добре корелюють з показниками виробника й даними, одержаними за допомогою референтного методу (рис. 5). Кореляційний зв’язок має лінійний характер, а відповідні коефіцієнти кореляції (И) між результатами визначення вмісту Ь-Агд різними методами і даними виробника є близькими до 1 за високої достовірності таких зв’язків (Р < 0,006). Відтворю-ваність результатів є високою під час аналізу всіх зразків методами 1-4: коефіцієнти варіації (КВ) не перевищують 2,2%, але є дещо нижчою, із КВ = 7,9%, у разі аналізу «Цитраргініну» потенціометричним біосенсором [61].
С (Ь-А^), мкМ С (Ь-А^), мкМ
Рис. 4. Залежність оптичної густини (а) та інтенсивності випромінювання (б) реакційної суміші від концентрації Ь-А^ і діапазони лінійності Е-СФ- та Е-ФЛ-методів (вставки).
Хвиля збудження флуоресценції — 380 нм. Концентрація аргінази І в кінцевій суміші — 1,5 Од/мл
Результати інших методів, мМ
Рис. 5. Кореляційний зв’язок між даними виробника і результатами визначення вмісту аргініну (мМ) різними методами у зразках фармацевтичних препаратів А, Т і Ц (позначення в тексті).
Методи: референтний хімічний (1); ензиматичні, із СФ- (2) та ФЛ- (3) детекцією продукту реакції; біосенсорні, амперометричний (4) і потенціометричний (5).
Параметри лінійної регресії наведено для методу 5
Запропоновані ензиматичні методи — із СФ- та ФЛ-детекцією продукту було застосовано для визначення Ь-Агд у реальних біологічних рідинах: соках, екстрактах чаїв, винах та інших алкогольних напоях, а також у крові (Гайда та ін., дані не опубліковано).
Таким чином, створені методи з використанням аргінази мають низку переваг, серед яких слід відзначити високу селективність та нечутливість до інтерферуючої дії багатьох сполук, зокрема амінокислот, а також простоту, економічність та нетривалість процедури аналізу [53, 54, 61, 62]. Отже, запропоновані сенсорні системи та ензиматичні методи можуть бути рекомендовані для розроблення відповідних державних стандартів визначення вмісту Ь-Агд і випуску комерційних тест-систем.
Роботу виконано за фінансової підтримки НАН України в рамках комплексної науково-технічної програми «Сенсорні прилади для медико-екологічних та промислово-технологічних потреб: метрологічне забезпечення та дослідна експлуатація» 5/3-2013, а також міжнародного індивідуального гранту РЕМ8 (иА-8МШ013-^авуик).
REFERENCES
1. Marini J. C. Arginine and ornithine are the main precursors for citrulline synthesis in mice. J. Nutr. 2012, 142(3), 572-580.
2. Yokoro M., Suzuki M., Murota K., Otsuka C, Yamashita H., Takahashi Y., Tsuji H., Kimoto M. Asymmetric dimethylarginine, an endogenous NOS inhibitor, metabolized in rat erythrocytes. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2012, 76(7), 1334-1342.
3. YanX., Takahara M., XieL., Gondo C., Setsu N., Oda Y., Takeuchi S., Tu Y., Moroi Y., Furue M. Arginine metabolism in soft tissue sarcoma. J. Dermatol. Sci. 2011, 61(3), 211-215.
4. Brusilow S. W., Horwich A. L., Scriver C. R. The metabolic and molecular bases of inherited disease. 8-th ed. New York: McGraw-Hill. 2001, P. 1909-1963.
5. Rotondo R., Mastracci L., Piazza T., Barisione G., Fabbi M., Cassanello M., Costa R., Morandi B, Astigiano .S, Cesario A., Sormani M. P., Ferlazzo G., Grossi F., Ratto G. B., Ferrini S., Frumento G. Arginase II is expressed by human lung cancer, but it neither induces immune suppression, nor affects disease progression. Int. J. Cancer. 2008, 123(5), 1108-1116.
6. Kotamtaju S., Williams C. L., Kalyanaraman B. Statin-induced breast cancer cell death: role of
inducible nitric oxide and arginase dependent pathways. Cancer Res. 2007, 67(15),
7386-7394.
7. Lam T. L., Wong G. K., Chong H. C., Cheng P. N., Choi S. C., Chow T. L., Kwok S. Y., Poon R. T., Wheatley D. N., Lo W. H., Leung Y. C. Recombinant human arginase inhibits proliferation of human hepatocellular carcinoma by inducing cell cycle arrest. Cancer Lett. 2009, 277(1), 91-100.
8. Glazer E. S., Stone E. M., Zhu C., Massey K. L.,
Hamir A. N., Curley S. A. Bioengineered human arginase I with enhanced activity and stability controls hepatocellular and pancreatic
carcinoma. Transl. Oncol. 2011, 4(3), 138-146.
9. Lam T. L., Wong G. K., Chow H. Y., Chong H. C., Chow T. L., Kwok S. Y., ChengP. N., Wheatley D.N., Lo W. H., Leung Y. C. Recombinant human arginase inhibits the in vitro and in vivo proliferation of human melanoma by inducing cell cycle arrest and apoptosis. Pigment Cell Melanoma Res. 2011, 24(2), 366-376.
10. Munder M. Arginase: an emerging key player in the mammalian system. Br. J. Pharmacol. 2009, 158(3), 638-651.
11. Hernandez C. P., Morrow K., Lopez-Bar-cons L. A., Zabaleta J., Sierra R., Velasco C., Cole J., Rodriguez P. C. Pegilated arginase I: a potential therapeutic approach in T-ALL. Blood. 2010, 115(25), 5214-5221.
12. Leu S. Y., Wang S. R. Clinical significance of arginase in colorectal cancer, Cancer. 1992, V. 70, P. 733-736.
13. Morales S. M. Cystinuria: diagnosis and therapeutic approach. An Sist. Sanit. Navar. 2011, 34(3), 453-461.
14. Zell J. A., Ignatenko N. A., Yerushalmi H. F., Ziogas A., Besselsen D. G., Gerner E. W., Anton-Culver H. Risk and risk reduction involving arginine intake and meat consumption in colorectal tumorigenesis and survival. Int. J. Cancer. 2007, 120(7), 459-468.
15. Uthurry C.A., Lepe J.A. S., Lombardero J., Del Hierro G. J. R. Ethyl carbamate production by selected yeasts and lactic acid bacteria in red wine. Food Chem. 2006, V. 94, P. 262-270.
16. Spayd S. E., Wample R. L., Evans R. G.,. Stevens R. G, Seymour B. J., Nagel C. W. Nitrogen fertilization of white Riesling grapes in Washington. Must and wine composition. Am. J. Enol Vitic. 1994, V. 45, P. 34-42.
17. Huang Z., Ough C. S. Effect of vineyard locations, varieties and rootstocks on the juice amino acid composition of several cultivars. Am. J. Enol. Vitic. 1989, V. 40, P. 135-139.
18. Parniak M. I., Lange G., Viswanatha T. Quantitative determination of monosubstituted guanidines: a comparative study of different procedures. J. Biochem. Biophys. Meth. 1983, 7(4), 267-276.
19. Yamasaki R. B., Shimer D. A., Feeney R. E. Colorimetric determination of arginine residues in proteins by p-nitrophenylglyoxal. Anal. Biochem. 1981, 111(2), 220-266.
20. Sakaguchi S. Colorimetric determination of arginine. J. Biochem. 1950, V. 5, P. 25-32.
21. Goldschmidt M. C., Lockhart B. M. Simplified rapid procedure for determination of agmatine and other guanidino containing compounds. Anal. Chem. 1971, V. 43, P. 1475-1479.
22. Casadebaig F., Dupin J. P., Mesnard P. The Sakaguchi reaction: Analytical developments and application to drug control. Ann. Pharm. Fr. 1979, 37(7-8), 313-324.
23. Khramov V. A., Petrova L. M., Binova E. Modification of Sakaguchi by using 5-chloro-7-iodo-8-hydroxy quinoline. Lab. Delo. 1980, V. 11, P. 651-653.
24. Micklus M. J., Stein I. M. The colorimetric determination of mono- and disubstituted guanidines. Anal. Biochem. 1973, V. 54, P. 545-553.
25. Sastry C. S. P., Tummuru M.K. Spectrophoto-metric determination of arginine in proteins. J. Food Chem. 1994, V. 15, P. 257-260.
26. Wang H., Liang X. H., Zhao R. X., Feng L. D., Li H. Spectrophotometric determination of arginine in grape juice using 8-hydroquinoline. Agric. Sci. China. 2008, 7(10), 1210-1215.
27. ZhangL., Liu Y., Chen G. Simultaneous determination of allantoin, choline and L-arginine in Rhizoma Dioscoreae by capillary electrophoresis. J. Chromatogr. A. 2004, 1043(2), 317-321.
28. Narezhnaya E. V., Askalepova O. I., Nikashi-na A. A., Krukier I. I., Pogorelova T. N. Determination of L-arginine in amniotic fluid by capillary disk electrophoresis. Zh. Anal. Chim., 2010, 65(12), 1309-1312. (In Russian).
29. Rong Y., Junru, H. Dayi C. Determination of L-arginine in drug by single sweep oscillo-polarography. J. Sichuan Containing Educ. Coll. Med. Sci. 1999, V. 12, P. 1219-1236.
30. Alonso A., Almendral M. J., Baez M. D., Por-ras M . J., Alonso C. Enzyme immobilization on an epoxy matrix. Determination of L-argi-nine by flow-injection techniques. Anal. Chim. Acta. 1995, 308(1-3), 164-169.
31. Chu K. M., Huang P. W., Pao Li H. Determination of arginine, asymmetrical dimethyl-arginine, and symmetrical dimethylarginine in human plasma by high performance liquid chromatography. J. Med. Sci. 2003, 23(4), 201-206.
32. Mayoral J. G., Alarcon F. J., Martinez T. F., Barranco P., Noriega F. An Improved End-point Fluorimetric Procedure for the determination of low amounts of trypsin activity in biological samples using rhoda-mine-110-based substrates. Appl. Biochem. Biotechnol. 2010, V. 160, P. 1-8.
33. Mira O. R. Quantitative determination of L-arginine by enzymatic End-Point analysis. J. Agric. Food Chem. 2001. 49(2), 549-552.
34. Gaede G., Grieshaber M. A rapid and specific enzymatic method for the estimation of L-argi-nine. Anal.Biochem. 1975, 66(2), 393-399.
35. MiticS.S.,Miletic G., Pavlovic A.N.,TosicS.B., Velimirovic D. S. Development and evaluation of a kinetic-spectrophotometric method for
determination of arginine. J. Chin. Chem. Soc. 2007, V. 54. P. 47-54.
36. Cohen S. I. The determination of arginine released in human blood plasma after plasminogen activation. Use of a cation-exchange resin. Arch. Biochem. Biophys. 1960, V. 86, P. 166-168.
37. Gange M. E., Francis P. S., Costin J. W., Barnett N. W., Lewis S. W. Determination of arginine in dietary supplements. J. Sci. Food Agric. 2005, V. 85, P. 1217-1221.
38. Costin J., Paul F., Lewis S. Selective determination of amino acids using flow injection analyses coupled with chemiluminescence detection. Anal. Chim.Acta. 2003,408(1), 67-77.
39. Lobenhoffer J. M., Krug O., Bode-Bogerh S. M. Determination of arginine and asymmetric dimethylarginine (ADMA) in human plasma by liquid chromatography/mass spectrometry with the isotope dilution technique. J. Mass Spectrom. 2004, V. 39, P. 1287-1294.
40. Notenboom C. D., Veerdonk F. C. G.,KamerJ. CA. A fluorescent modification of the Sakaguchi reaction on arginine. J. Histochem. 1967, V. 18, P.117-121.
41. Rechnitz G. A., Kobos R. K., Riechel S. J., Gebauer C. R. A bioselective membrane electrode prepared with living bacterial cells. Anal. Chim. Acta. 1977, V. 94, P. 357-365.
42. Grobler S. R., Basson N., Van Wyk C. W. Bacterial electrode for L-arginine. Talanta. 1982, V.29, P.49-51.
43. Botre F., Mazzey F. Interactions between carbonic anhydrase and some decarboxy-lating enzymes as studied by a new bioelectro chemical approach, Bioelectrochem. Bioenerg. 1999, 48(2), 463-467.
44. Nikolelis D. P., Hadjiioannou T. P. Construction of an arginine enzyme electrode and determination of arginine in biological materials. Anal. Chim. Acta. 1983, V. 147, P. 33-39.
45. Karacaoglu S., Timur S., Telefoncu A. Arginine selective biosensor based on arginase-urease immobilized in gelatin. Artif. Cells Blood Subst. Immob. Biotechnol. 2003, V. 31, P. 357-363.
46. Komaba S., Fujino Y., Matsuda T., Osaka K., Satoh I. Biological determination of Ag (I) ion and arginine by using the composite film of electroinactive polypyrrole and polyion complex. Sens. Actuator. B. Chem. 1998, V. 52, P. 78-83.
47. Ivnitskii D. M., Rishpon J. Biosensor based on direct detection of membrane potential induced by immobilized hydrolytic enzymes. Anal. Chim. Acta. 1993, V. 282, P. 517-525.
48. Koncki R., Walcerz I., Ruckruh F., Glab S. Bienzymatic potentiometric electrodes for creatine and L-arginine determination. Anal. Chim. Acta. 1996, V. 333, P. 215-222.
49. Lvova L., Legin A., Vlasov Y., Cha G. S., Nam H. Multicomponent analysis of Korean green tea by means of disposable all-solid-state po-tentiometric electronic tongue microsystem. Sens.Actuator.B: Chem. 2003, V. 95, P. 391-395.
50. Kaur G. http://hdl.handle.net/10603/2897
51. Saiapina O. Y., Dzyadevych S. V., Jaffrezic-Renault N., Soldatkin O. P. Development and optimization of a novel conductometric bi-enzyme biosensor for L-arginine determination. Talanta. 2012, V. 92, P. 58-64.
52. Liu D., Yin A., Ge K, Chen K, Nie L, Yao S. Enzymatic analysis of arginine with the SAW/conductance sensor system. Enzym. Microb. Tech. 1995, V. 17, P. 856-863.
53. Stasyuk N., Smutok O., Gayda G., Vus B., Gonchar M., Koval’chuk Ye. Bi-enzyme L-ar-gi ni ne-selective amperometric biosensor based on ammonium-sensing polyaniline-modified electrode. Biosens. Bioelectron. 2012, 37(1), P. 46-52.
54. Stasyuk N., Smutok O., Gayda G., Koval’chuk Y., Gonchar M. A new bi-enzyme potentiometric sensor for arginine analysis based on recombinant human arginase I and commercial urease. J. Mater. Sci. Eng. A. 2011, V. 1, P. 819-827.
55. Saiapina O. Y., Dzyadevych S. V., Soldat kin O. P., Stasyuk N. Ye., Gayda G. Z., Gonchar M. V. Conductometric biosensor system for L-arginine determination. Patent u201104302, MPK51 G01N 33/00 (2011.01). № 64025; declared 08.04.2011; published 25.10.2011; Bulletin № 20. (In Ukrainian).
56. Stasyuk N. Ye., Gayda G. Z., Koval’chuk Y. P., Gonchar M. V. Human arginase I from the recombinant yeast Hansenula polymorpha:
isolation and characterization. Ukr. Biochem. J. 2010, 82(6), 14-21. (In Ukrainian).
57. Stasyuk N., Gayda G., Gayda A., Stasyk O. V., Karpiak V. V., Koval’chuk Y. P., Gonchar M. V. The synthesis of affinity sorbents for purification of human arginase I from the recombinant yeast Hansenula polymorpha. Pratsi HTShA. Ser. “Khimiya i biokhimiya”, 2011, V. 28, P. 139-149. (In Ukrainian).
58. StasyukN., Serkiz R., Gayda G., Koval’chuk Y. P., Gonchar M. V. Synthesis and characteristics of silver and gold nanoparticles for immobilization of recombinant arginase Visn. Lviv. Univ. Ser. “Khim.”, 2011, V. 52, P. 261-267. (In Ukrainian).
59. Stasyuk N., Serkiz R., Mudry S., Gayda G., Zakalskiy A., Koval’chuk Y., Gonchar M., Nisnevich M. Recombinant human arginase I immobilized on gold and silver nanoparticles: preparation and properties. Nanotech. Develop. 2011, V. 1:e3, P. 11-15.
60. Stasyuk N. Ye., Gayda G. Z., Gonchar M. V., Koval’chuk Y. An amperometeric chemo-sensor for ammonium ions detection. Visnik Kharkiv. Nats.Un-tu. Ser. “Khim”. 2012, 21 (44), N 1026, P. 258-263. (In Ukrainian).
61. Stasyuk N. Ye., Gayda G. Z., Gayda A. V., Gonchar M.V. A new enzymatic method for L-arginine assay. Ukr. Biorg. Acta. 2012, V. 1, P. 31-37. (In Ukrainian).
62. Stasyuk N., Gaida G., Gonchar M. L-arginine assay with the use of arginase I. Prikladnaya Biochem. i Microbiol. 2013, 49(5), 529-534. (In Russian).
МЕТОДЫ АНАЛИЗА L-АРГИНИНА
Г. З. Гайда1, Н. Е. Стасюк1, М. В. Гончар1’ 2
1Институт биологии клетки НАН Украины, Львов
2Институт прикладной биотехнологии и фундаментальных наук, Жешувский университет, Польша
E-mail: galina_gayda@yahoo.com_
Охарактеризованы современные физикохимические и энзиматические методы количественного определения L-аргинина. У большинства известных методов анализа L-аргинина есть недостатки: низкая селективность (химические), громоздкость и высокая стоимость оборудования (физико-химические), недостаточная стабильность (операционная и при хранении — биосенсоры), чувствительность к интерферирующему влиянию сопутствующих веществ. Поэтому разработка высокоселективных и чувствительных методов определения концентрации L-аргинина, в частности энзиматических, для усовершенствования системы мониторинга его уровня в клинической диагностике и пищевой промышленности является актуальной проблемой.
Представлены результаты собственных исследований по разработке и апробации эффективных энзиматических, в том числе биосенсорных, методов анализа L-аргинина с использованием аргиназы I печени человека, выделенной из клеток рекомбинантных дрожжей Hansenula polymorpha NCYC-495 pGAP1-HsARG1 (leu2car1 Sc:LEU2). Аргиназа (КФ 3.5.3.1; L-аргинин-амидиногидролаза) играет решающую роль в гидролитическом расщеплении L-аргинина до L-орнитина и мочевины. Результаты апробации предложенных амперометрического и потенциометрического биосенсоров на основе аргиназы I, а также энзиматических методов со спектрофотометрической и флуоресцентной детекцией продукта продемонстрировали их эффективность для экспресс-анализа L-аргинина в фармацевтических препаратах. Разработанные методы могут быть перспективными для определения L-аргинина в пищевых продуктах (соках и винах), а также в сыворотке крови для диагностики и контроля при лечении некоторых видов онкологических заболеваний. Высокая селективность и простота предложенных методов позволят существенно упростить процедуру анализа и заменить используемые в настоящее время низкоселективные химические и дорогостоящие хроматографические методы.
Ключевые слова: анализ L-аргинина, биосенсоры, аргиназа I.
THE METHODS OF L-ARGININE ANALYSIS
G. Z. Gayda1, N. E. Stasyuk1, M. V. Gonchar1, 2
1Institute of Cell Biology of National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv
2Insitute of Applied Biotechnology and Basic Sciences, Rzeszow University, Poland
E-mail: galina_gayda@yahoo.com
Physicochemical and enzymatic methods of quantitative L-arginine estimation are described. A variety of detection procedures for L-arginine analysis have been developed. The majority of the frequently used approaches are marked by poor precision, low sensitivity and selectivity. These methods are time-consuming, expensive and require skilful labor techniques, so it needs to develop novel highly selective and sensitive ones for improvement of L-arginine monitoring in clinical diagnostics and food industry.
Experimental data concerning development and testing of effective enzymatic methods of L-arginine determination, including biosensors, are presented. All proposed methods are based on human liver arginase I isolated from the recombinant yeast strain Hansenula polymorpha NCYC-495 pGAP1-HsARG1 (leu2car1 Sc:LEU2). Arginase I (EC 3.5.3.1; L-arginine amidinohydrolase), a key enzyme of the urea cycle, catalyses the conversion of L-arginine to ornithine and urea.
An effectiveness of the proposed enzymatic methods for L-arginine assay, as amperometric and potentiometric biosensors so as enzymatic methods with spectrophotometric and fluorometric detection of the product, was demonstrated on the samples of commercial pharmaceuticals.
These methods seem to be prospective for L-arginine analyses in food industry (juices and wines) and in medicine, for diagnostics and drug control in blood serum under treatment of cancer malignances. Hence, the proposed L-Arg selective and simple methods would be convenient and useful in the future for routine clinical analysis and food quality control.
Key words: L-arginine analyses, biosensors, arginase I.
