CC BY
5
УДК 632.4: 630*4
СС BY-NC 4.0
> М.А. Шеллер и соавт. ФНИ «XXI век»
ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ HETEROBASIDION ANNOSUM (FR.) BREF. В ОЧАГАХ УСЫХАНИЯ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ НА ТЕРРИТОРИИ НАЦИОНАЛЬНОГО ПАРКА «ШУШЕНСКИЙ БОР» М.А. Шеллер1*, А.И. Татаринцев1, Т.В. Сухих2, А.А. Ибе2,
П.В. Михайлов
1
1 Сибирский государственный университет науки и технологии имени академика М.Ф. Решетнева и 2 Центр защиты леса Красноярского края, Красноярск, Россия
* Эл. почта: [email protected] Статья поступила вредакцию 30.03.2023; принята к печати 18.05.2023
Представлены результаты молекулярно-генетической идентификации корневого патогена в очагах усыхания древостоев сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) на территории национального парка «Шушенский бор» (Шушенский район Красноярского края). Образцы плодовых тел были отобраны с пораженных деревьев в шести кварталах Перовского лесничества, расположенного в пределах Минусинской котловины. Выявлено, что возбудителем корневой гнили в сосняках является макромицет Heterobasidion annosum (Fr.) Bref., относящийся к комплексу H. annosum s. l. (корневая губка). Полученные результаты молекулярно-генетического анализа могут быть использованы в лесопатологическом мониторинге лесов Сибири.
Ключевые слова: Heterobasidion annosum (Fr.) Bref., корневая гниль, Шушенский бор, молекулярно-генетический анализ, секеенироеание.
IDENTIFICATION OF THE FUNGAL SPECIES HETEROBASIDION ANNOSUM (FR.) BREF. IN THE FOCI OF DRYING OF PINUS SYLVESTRIS PINES IN SHUSHENSKIY BOR
NATIONAL PARK
M.A. Sheller1*, A.I. Tatarintsev1, T.V. Sukhikh2, A.A. Ibe2, P.V. Mikhaylov1
1 M.F. Reshetnev Siberian State University of Science and Technology and 2 Krasnoyarsk Regional Center of Forest Protection, Krasnoyarsk, Russia
* Email: [email protected]
The molecular-genetic identification of the root pest found in the foci of drying of the pine Pinus sylvestris L. in the national park Shushenskiy Bor (Shushenskiy District of Krasnoyarsk Region, Russia) was carried out using samples collected from lesioned tees in six plots of Petrovkoye Forestry located in Minusinsk Depression. The causative agent of root rot was identified as the macromycete Heterobasidion annosum (Fr.) Bref., referred to the complex H. annosum s. l. (root sponge). The results are useful for forest pathology monitoring in Siberia.
Keywords: Heterobasidion annosum (Fr.) Bref., rootsponge, ShushenskiyBor, moleculargenetic analysis, DNA sequencing.
Введение
Корневая губка (Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.) является одним из наиболее опасных фитопатоген-ных грибов, поражающих хвойные породы деревьев [1, 2, 8, 10]. Данный гриб вызывает пеструю ситовую гниль древесины корневой системы и комлевой части ствола. Патогенное воздействие корневой губки приводит к резкому ухудшению санитарного состояния насаждений и причиняет ущерб в виде снижения про -дуктивности древостоев, обесценивания древесины, дополнительных затрат на проведение санитарных рубок [2].
На территории России распространение и экология видов Яе/егойш7А?г'ой изучались ограниченно, только в некоторых районах страны. Например, на Урале в смешанных насаждениях пихты сибирской и ели сибирской был идентифицирован фитопатогенный гриб Н. рагугрогит [10]. На Алтае в насаждениях сосны обыкновенной был обнаружен,^. аппояит [3]. Позднее Н. аппояит был выявлен в сосновых борах Минусинской котловины (юг Красноярского края) в древостоях искусственного и естественного происхождения [3, 5]. Первоначально идентификация вида здесь была выполнена по морфологическим особенностям базиди-
ом, окончательно - с использованием метода скрещивания моноспоровых культур с гомокариотическими тестерами. В настоящее время этот район рассматривается как восточная граница распространения данного вида макромицета в Евразии.
В рамках продолжения изучения проблемы усыха-ния уникальных сосняков Минусинской котловины в 2022 году были проведены генетические исследования корневой губки по материалам, отобранным в сосняках Перовского лесничества Национального парка «Шушенский бор». Цель работы - уточнение видовой принадлежности возбудителя корневой гнили в древостоях сосны с помощью молекулярно-генетического анализа методом секвенирования ДНК.
Материалы и методы
В качестве материала для исследования послужили плодовые тела, обнаруженные на сосне обыкновенной (взрослые деревья с утраченной жизнеспособностью, погибший подрост) на территории Перовского лесничества в лесостепной части национального парка «Шушенский бор». Отбор образцов проводился из очагов усыхания в шести кварталах лесничества.
Первичная идентификация вида осуществлялась по морфологическим особенностям плодовых тел видов комплекса Н. annosum [6, 8]. Для дальнейшей идентификации вида гриба был проведен молекулярно-генетический анализ образцов методом секвенирования ДНК. Метод основан на сочетании принципов полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием фрагментов. Проводимая на первом этапе ПЦР позволяет выявить полиморфизм в краевых областях локуса (местах посадки праймеров) [4]. Далее проводится прямой анализ нуклеотидной последовательности с помощью секвенирования. Полученные при секвенировании нуклеотидные последовательности анализируемых образцов сравниваются с информацией по секвенированию данного региона рибосомальной ДНК в современных электронных генетических базах данных, открытых для прямого доступа.
Процедура молекулярно-генетической диагностики состояла из следующих стадий: выделение суммарной ДНК из анализируемого материала; амплификация локусов грибной ДНК методом ПЦР; расшифровка структуры амплифицированных локусов (секвениро-вание); сравнительный анализ в базе данных (идентификация). Выделение суммарной ДНК было выполнено СТАВ-методом [7]. ПЦР анализ был выполнен с применением готовой смеси «GenePak PCR Core» (ООО «Лаборатория Изоген») при следующих параметрах реакции: начальная денатурация - 4 мин при 96 °С, последующие 30 циклов - 1 мин при 96 °С, отжиг -30 сек при 60 °С, элонгация - 2 мин при 72 °С, финальная элонгация - 10 мин при 72 °С, охлаждение -
5 мин при 4 °С. Для амплификации были использованы праймеры ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) и ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) [11]. Электрофорети-ческое разделение продуктов амплификации проводили в горизонтальных камерах «Helicon» в однократном ТВЕ-буфере (трис-боратный электродный буфер) в 2% агарозном геле. Электрофорез проводили при комнатной температуре в течение 1 ч при параметрах тока -90 V/60 мА. Визуализация продуктов электрофореза достигалась окрашиванием гелевых пластин в раство-ре бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 10 мин. Затем гель извлекался и промывался в дистиллированной воде для удаления остатков красителя. Фотодокументирование продуктов электрофореза достигалось за счет видеосканирования в УФ-свете специальной системой Gel-Imager. Для дальнейшей видовой идентификации грибов производили иссечение фрагмента геля, содержащего ДНК-фрагмент гриба. Очистка фрагментов ДНК от геля проводилась набором реагентов «Био-Силика» в соответствии с протоколом производителя (ООО «БиоСилика»). Секвенирование фрагментов ДНК осуществляли с помощью генетического анализа -тора ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) на основании использования набора BigDye Terminator Sequence Kit v. 1.1, согласно методике компании-изготовителя. Ана-лиз нуклеотидных последовательностей образцов производился с помощью программ Sequencing Analysis v. 6. Нуклеотидная структура секвенированных ам-пликонов была проанализирована с помощью программы BLAST в GenBank NCBI ("Ше National Center for Biotechnology Information).
Результаты и обсуждение
По данным молекулярно-генетической диагностики в Перовском лесничестве в лесостепной части национального парка «Шушенский бор» в образцах из плодовых тел в очагах усыхания сосны обыкновенной (рис. 1) идентифицирован фитопатогенный гриб Н. annosum.
Идентификация всех выявленных изолятов по базе данных NCBI показала их ближайшее сходство с данным видом - на 98-99% (табл. 1).
Нарушение санитарного состояния сосняков в межгорных котловинах на юге Средней Сибири к настоящему времени проявляется в групповом и куртинном усыхании древостоев (рис. 2).
Признаки этой проблемы в сосняках Шушенского бора, расположенного в южной части Минусинской котловины, обнаруживались с середины 1980-х годов, первоначально в отдельных его частях в виде единичного, реже группового патологического отпада деревьев. Причина усыхания была не ясна вплоть до начала следующего десятилетия, когда на свежем сухостое начали обнаруживать плодовые тела предположительно корневой губки, что позволило гово-
I М.А. ШЕЛЛЕР И СОАВТ. |
А Б В
Рис. 1. Плодовые тела (базидиомы) Н. аппо$ит: А - в основании ствола усохшего дерева; Б, В - на стволике (корневая шейка) погибшего подроста
Результаты молекулярно-генетической идентификации Н. аппо$ит в образцах плодовых тел, отобранных в сосняках Перовского лесничества Национального парка «Шушенский бор»
Исходные данные образцов Информация о гомологичных последовательностях в базе данных BLAST
Квартал взятия Объект обнаружения
19 Погибший подрост JF411709.1
21 Сухостойное дерево (43 см*) КС768081.1
21 Сильно ослабленное дерево (52 см) JF411709.1
10 Усыхающее дерево (33 см) МН859050.1
27 Погибший подрост МН859050.1
14 Ветровальное дерево (39 см) МН859050.1
8 Сухостойное дерево (51 см) МН859050.1
8 Погибший подрост МН859050.1
* Диаметр ствола на высоте 1,3 м.
Рис. 2. Действующий очаг корневой губки в сосняках Перовского лесничества
>
рить о развитии очагов корневой гнили. Проведенные в 2014 году исследования с использованием классических методов показали, что наиболее вероятным возбудителем корневой гнили в сосняках Перовского лесничества является H. annosum (Fr.) Bref., относящийся к комплексу H. annosum s. 1. (корневая губка) [5]. Присутствие данного фитопатогенного гриба в сосновых насаждениях Минусинской котловины под -тверждено нами на основе проведения молекулярно-генетического анализа методом секвенирования ДНК патогена.
Заключение
Таким образом, по результатам обследования древо-стоев сосны обыкновенной в шести кварталах Перовского лесничества национального парка «Шушенский бор» были выявлены деревья, зараженные Н. аппо5ит. Проведенное исследование показало, что ДНК-анализ является современным и достоверным методом диагностики инфекционных болезней лесообразующих древесных растений, который должен повысить эффективность фитопатологических исследований в системе мониторинга состояния лесов.
Литература
Список русскоязычной литературы
1. Василяускас АП. Корневая гу бка и устойчивость экосистем хвойных лесов. Вильнюс: Мокслас; 1989.
2. Негруцкий СФ. Корневая губка. М.: Агропром-издат; 1986.
3. Павлов ИН, Корхонен К, Губарев ПВ, Черепнин ВЛ, Барабанова OA, Миронов АГ, Агеев АА. Закономерности образования очагов Heterobasid-ion annosum (Fr.) Bref. s. str. в географических культурах сосны обыкновенной (Минусинская котловина). Хвойные бореальной зоны. 2008;25 (1-2):28-36.
4. Падутов BE, Баранов ОЮ, Воропаев ЕВ. Методы молекулярно-генетического анализа. Мн.: Юни-пол; 2007.
5. Татаринцев АИ, Каленская ОП, Бубликов АГ. К вопросу пораженности корневой гнилью сосняков минусинской котловины. Хвойные бореальной зоны. 2015;33(5-6):240-7.
6. Федоров НИ. Лесная фитопатология. Мн.: БГТУ; 2004.
Общий список литературы/Reference List
1. Vasilyauskas АР. Kornevaya Gubka i Ustoychi-vost Eksistem Khvoynykh Lesov. [Root Sponge and Ecosystem Stability of Coniferous Forests], Vilnius: Mokslas; 1989. (InRuss.)
2. Negrut sky SF. Kornevaya Gubka. [Root sponge], Moscow: Agropromizdat; 1986. (In Russ.)
3. Pavlov IN, Korhonen K, Gubarev PV, Cherepnin VL, Barabanova OA, Mironov AG, Ageev AA. [Regularities in the formation of disease foci of Heteroba-sidion root rot in provenance plantations of Pinus
sylvestris in Minusinskaya hollow, Krasnoyarsk region], Khvoynye Borealnoy Zony. 2008;25(l-2): 28-36. (In Russ.)
4. Padutov VE, Baranov OYu, Voropayev EV. Metody Molekuliarno-Geeticheskogo Analiza. [Methods of Molecular Genetic Analysis], Minsk: Yunipol; 2007. (In Russ.)
5. Tatarintsev AI, Kalenskaya OP, Bublikov AG. [On the issue of root-rot infestation of pine forests of the Minusinsk basin], Khvoynye Borealnoy Zony. 2015;33(5-6):240-7. (InRuss.)
6. Fedorov N1. Lesnaya Fitopatologiya. [Forest Phytopathology], Minsk: BSTU; 2004. (InRuss.)
7. Doyle JJ, Doyle JL. Isolation of plant DNA from freshtissue. Focus.l990;12:13-5.
8. Korhonen K. Fungi belonging to the genera Heteroba-sidion and Armillaria in Eurasia. In: Storozhenko VG, Krutov VI, eds. Fungal Communities in Forest Ecosystems. Moscow-Petrozavodsk; 2004. Vol. 2, p. 89-113.
9. Korhonen K, Fedorov N1, La Porta N, Kovbasa NP. tte S type of Heterobasidon annosum attacks Abies sibirica in the Ural region. Eur J Forest Pathol. 1997;(27):273-81.
10. Niemela T., Korhonen K. Taxonomy of the genus Heterobasidion. In: Woodward S, Stenlid J, Kar-jalainen R, HUttermann A, eds. Heterobasidion annosum. Biology, Ecology, Impact and Control. CAB International, 1998.
11. White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. San Diego: Acad. Press; 1990. P. 315-22.
