CC BY
9DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-33-67-75 УДК 577.212:632.4
А. М. Нестюк1, С. В. Пантелеев2, В. А. Ярмолович1, О. Ю. Баранов1,3
ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА STS-МАРКЕРОВ ИЗОЛЯТОВ КОРНЕВОЙ ГУБКИ, ИНФИЦИРУЮЩИХ ЕЛЬ ЕВРОПЕЙСКУЮ (PICEA ABIES (L.) H.KARST.) В БЕЛАРУСИ
белорусский государственный технологический университет Республика Беларусь, 220006, г. Минск, ул. Свердлова, 13а e-mail: antonina.nestyuk95@gmail.com 2Институт леса НАН Беларуси Республика Беларусь, 246050, г. Гомель, ул. Пролетарская, 71
3Отделение биологических наук НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, пр. Независимости, 66
В статье приведены результаты изучения генетического полиморфизма изолятов корневой губки, инфицирующих ель европейскую (Picea abies) в различных регионах Беларуси. На основании полученных данных осуществлена сравнительная оценка пригодности STS-маркеров для видовой диагностики изолятов корневой губки (Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. sensu stricto (s. s.) и Heterobasidion parviporum Niemelä & Korhonen). Экспериментальный материал в виде плодовых тел корневой губки и высечек инфицированной данным фито-патегеном древесины был отобран в насаждениях ели европейской на территории трех геоботанических подзон в семи Государственных лесохозяйственных учреждениях Министерства лесного хозяйства Республики Беларусь, а также на территории Негорельского учебно-опытного лесхоза и Национального парка «Беловежская пуща». На основании проведенного комплексного анализа образцов рекомендованы маркеры для проведения видовой молекулярно-генетической диагностики H. annosum и H. parviporum.
Ключевые слова: корневая губка, Heterobasidion parviporum Niemelä & Korhonen, Heterobasidion annosum (Fr.) Bref., видовая идентификация, молекулярно-генетический анализ, STS-маркеры.
Введение
Грибы рода Heterobasidion spp. являются наиболее распространенными возбудителями корневой гнили у хвойных пород деревьев северного, умеренного и бореального поясов. Впервые возбудитель корневой гнили хвойных древесных пород был описан еще в 1821 году E. Fries как Polyporus annosus Fr. [1]. C 1930-х гг. некоторые ученые начали поиск географических рас гриба на основе их приуроченности к древесным видам. Однако, несмотря на выявленные различия в биохимических свойствах и патогенности, долгое время отдельные расы выделить не удавалось [2, 3]. Различные группы данного фитопатогена были выделены учеными только в конце XX века из комплекса видов Северного полушария Heterobasidion annosum sensu lato после проведения опытов по взаимной оплодотворяемости. В результате были выделены три европейские группы (P, S и F) на территории Евразии и две (P и S) — на
территории Северной Америки [1, 4, 5].
Несмотря на явную дифференциацию различных групп Heterobasidion относительно их взаимной оплодотворяемости, они не являются абсолютно интерстерильными. Гомо-кариотические чистые культуры из разных групп способны спариваться друг с другом с различной частотой. В Европе совместимость между группами S и F составляет 2575%, в зависимости от происхождения изолятов S. Совместимость между группами Р и S составляет около 10%, также низкие показатели между группами Р и F. Совместимость североамериканских групп S и Р составляет примерно 18%. Совместимость между европейской и североамериканской Р группами довольно высокая, однако не абсолютная, а североамериканская S-группа демонстрирует высокую совместимость как с европейскими S, так и с F группами [1].
В настоящее время все данные группы
приобрели статус видов и описаны как Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. sensu stricto (s. s.) (европейская Р-группа), Heterobasidion parviporum Niemelä & Korhonen (европейская S-группа), Heterobasidion abietinum Niemelä & Korhonen (европейская F-группа), Heterobasidion irregulare (Underw.) Garbel. & Otrosina (североамериканская Р-группа) и Heterobasidion occidentale Otrosina & Garbel. (североамериканская S-группа) [1, 5]. Так же за последнее десятилетие выявлено 11 видов грибов в составе азиатского комплекса Heterobasidion, однако, в отличие от европейской и североамериканской групп, данные виды являются облигатными сапротрофами [6].
На территории Беларуси, согласно литературным данным, встречаются два вида гриба из рода Heterobasidion: H. annosum и H. parviporum. Характер развития данных фитопатогенных видов грибов на разных древесных породах неодинаков. H. annosum является наиболее агрессивным видом, способным поражать широкий спектр древесных пород: сосну обыкновенную, ель европейскую, березу повислую, березу пушистую, осину и др. H. annosum поражает не только корни растущих деревьев, но и способен формировать гнили древесины в нижней (на высоте до 0,3 м) части ствола. В то же время H. parviporum развивается только на ели и неспособен поражать другие древесные породы. Гниль, вызываемая патогеном, из корней может заходить в ствол и распространяться в нем на высоту до 8-12 м.
Важной особенностью повреждения корневой губкой еловых насаждений является скрытый характер очагов, в результате чего своевременное обнаружение данного патогена представляется затруднительным, что, в свою очередь, способствует повреждению ельников на значительных территориях [7, 8].
Два вида (H. annosum и H. parviporum) гриба распространяются как при помощи базиди-оспор (первичное заражение) [9], так и через корневые контакты в результате разрастания мицелия (вторичное заражение) [10], вследствие чего повреждаются обширные территории хвойных насаждений. На тех площадях, где заражение фитопатогенными грибами из рода Heterobasidion установлено, может произойти заражение молодых насаждений от инфицированных корней и пней предыдуще-
го поколения деревьев при помощи корневых контактов [1, 11, 12]. Данный вид распространения корневой гнили можно избежать, используя древесную породу, являющуюся невосприимчивой для заражения определенным видом гриба корневой губки.
Таким образом, установление в очагах усы-хания видовой принадлежности патогена позволяет подобрать породный состав, в наибольшей степени подходящий для проведения лесовосстановления на вырубках.
К настоящему времени видовая идентификация корневой губки основана на морфологическом анализе плодовых тел и проведении теста соматической совместимости моноспоровых культур in vitro. Несмотря на присутствие некоторых морфологических различий (длина волосков на верхней стороне шляпки рядом с краем плодового тела, размер пор ги-менофора) плодовых тел между H. parviporum и H. annosum s.s., перекрывающиеся вариации затрудняют их достоверную идентификацию и наиболее точный метод определения видовой принадлежности, на наш взгляд, возможен лишь с применением молекулярно-генетиче-ских подходов. В то же время разрабатываются и другие направления анализа данных фи-топатогенов: оценка белковых спектров [13], изоферментный анализ[14], профилирование жирных кислот и стеринов (FAST) [15]. Используемые ДНК-методы также разнообразны по их методологии: произвольно амплифици-рованная полиморфная ДНК (RAPD) [16, 17], маркеры на основе секвенирования рибосо-мной ДНК [18], произвольно амплифициро-ванные мини- [19] и микросателлитные маркеры (RAMS) [20]. Для некоторых видов были предложены видоспецифичные праймеры для определения видовой принадлежности патогена как в условиях чистой культуры, так и непосредственно в древесине [21, 22]. В то же время следует отметить, что эффективность диагностики с использованием данных прай-меров зачастую являлась низкой и в значительной степени была обусловлена региональной приуроченностью изолятов, использованных в данных исследованиях.
В связи с вышеизложенным, задачами данного исследования являются: разработка STS-маркеров корневой губки, изучение генетического полиморфизма среди изолятов, ин-
фицирующих ель европейскую, и на основе полученных данных проведение сравнительной оценки пригодности маркеров для диагностики H. parviporum и H. annosum.
Материалы и методы
Экспериментальный материал (плодовые тела и высечки инфицированной древесины) корневой губки был собран в еловых насаждениях семи Государственных лесохозяй-ственных учреждений Министерства лесного хозяйства Республики Беларусь, а также на территории Негорельского учебно-опытного лесхоза и Национального парка «Беловежская пуща». Получение препаратов суммарной ДНК из плодовых тел осуществлялось напрямую, а для высечек древесины — напрямую или через получение чистых культур патогена [23]. Предварительная верификация культур in vitro корневой губки осуществлялась с использованием праймеров HetF и HetR [24].
В качестве исходного материала для разработки локус-специфичных праймеров были использованы геномные (база данных WGS) последовательности Heterobasidion spp., представленные в NCBI GenBank: H. annosum (учетная запись проекта CVKZ01.1) и H. parviporum (учетная запись проекта PDUQ01.1). Предварительное выравнивание нуклеотидных последовательностей было произведено по следующему алгоритму: 1) ассемблированные последовательности (контиги) H. parviporum с помощью программного обеспечения CLC Sequence Viewer 6 были объединены в один искусственный скаффолд размером 33 193 158 н. о.; 2) с использованием онлайн ресурса SMS (Sequence Manipulation Suite) данный скафолд был раз-
делен на 251 720 перекрывающихся (величина перекрытия — 50 н. о.) коротких фрагментов размером 250 н. о.; 3) полученные короткие фрагменты H. parviporum в программе Ugene v.42 были картированы на скаффолды (14 ед.) H. annosum, депонированные в NCBI GenBank. Далее с использованием программного обеспечения Ugene v.42 были идентифицированы участки генома, характеризующиеся сходством или отличиями между H. annosum и H. parviporum.
В качестве STS-маркеров были выбраны участки ортологичных генов H. annosum и H. parviporum. При этом последовательности места отжига праймеров для маркеров HetAll2, HetAllV3 и HetAllV4 выбирались с учетом возможности их ПЦР-амплификации у обоих видов. Основной характер изменчивости в данном случае был связан как с размером амплифициру-емого продукта, так и с полиморфизмом нукле-отидной структуры фланкируемого региона для разных видов. Дизайн праймеров для ПЦР-ам-плификации STS-маркеров HetParv1, HetParV2, HetAnn3, HetAnV2 осуществлялся посредством выявления последовательностей, содержащих олигонуклеотидные делеции / инсерции у одного из видов, что обуславливало их применимость только по отношению к H. parviporum (HetParv1 и HetParV2) или H. annosum (HetAnn3 и HetAnV2). Перечень разработанных STS-мар-керов приведен в таблице 1.
ПЦР-амплификация выполнялась с применением DreamTaq™ Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Электрофо-ретическое фракционирование ампликонов выполнялось в 2% агарозном геле с целью эффективного их разделения и типировки.
Таблица 1
Перечень разработанных STS-маркеров
Маркер Нуклеотидная структура праймеров для ПЦР-амплификации Ожидаемый размер ампликона, н. о Локализация
HetParvl GGCCTCATTGACCACTGACA TTTACCTGTGCGGCATCCTT H. parviporum — 117 H. annosum — н/а* Ген транскрипционного фактора семейства Swi5
HetAll2 GGWTCCTCCTCCACCAGACT CTAAYCCGTACATGGTGCGT H. parviporum — 174 H. annosum — 173 Ген цистеиновой протеиназы (убиквитинилгидролазы) семейства С19
HetAnn3 CAGCCCCGATACGCAGAC AGCATCGTCTTCACGTTCTTC H. parviporum — н/а H. annosum — 120 Ген ядерного белка семейства ТЬ1
Примечание. н/а — продукт амплификации отсутствует для H. annosum (NCBI CVKZ01.1) или H. parviporum (NCBI PDUQ01.1)
Окончание таблицы 1
Маркер Нуклеотидная структура праймеров для ПЦР-амплификации Ожидаемый размер ампликона, н. о Локализация
HetAnV2 CGAGAGAGGGGACGGAGAT GCACGCCTGCAGTGGC H. parviporum — н/а H. annosum — 100 Ген убиквитин связывающего фермента семейства UBCc
HetParV2 GCGAGAGAGGGGAGATG CTCCGTCAACCAGCAGT H. parviporum — 106 H. annosum — н/а Ген убиквитин связывающего фермента семейства UBCc
HetAllV3 TGTCCTTGACAAGTAGACAC CCCCCAAGTCAAGTACAAAA H. annosum — 116 H. parviporum — 102 Ген глутаминсинтетазы
HetAllV4 GTGCCAAGTAAGAGGTTC TTTTGAGGACGACGATACTT H. annosum — 161 H. parviporum — 149 ОРС (ORF) с неустановленной функцией
Результаты и обсуждения
В ходе молекулярно-генетической оценки изолятов был выявлен широкий спектр генетического полиморфизма, связанный с варьированием размера амплифицируемых STS-мар-керов корневой губки.
Маркер HetAll2
Несмотря на предполагаемое относительное сходство (173 и 174 н. о.) расчетных (на основании геномных данных) размеров ампликонов среди Heterobasidion spp., проведенный анализ ПЦР-профилей изученных образцов показал, что они характеризовались пятью электрофоретическими вариантами, детектируемых в условиях агарозного геля. При этом выявляемые алломорфы могли формировать различные типы электрофоретиче-ских профилей среди образцов корневой губки. Электрофоретические профили образцов (дикариотический мицелий) корневой губки были представлены однофракционными спектрами, что, как правило, соответствует гомозиготным генотипам (реже — гетерозиготным); двухфракционными — относящимися к гетерозиготным генотипам; трехфрак-ционными — имеющих дополнительные наследственные аспекты (дупликации, пара-логичные локусы, химерную структуру мицелия и др.). Секвенирование альтернативных электрофоретических вариантов показало их аллельную природу — выявляемые различия связаны с делецией / инсерцией фрагментов гомологичных последовательностей (данные не приведены).
Маркеры HetParvl и HetAnn3
Изменчивость среди образцов по маркерам
HetParv1 и HetAnn3 в основном была связана с нуклеотидной структурой мест отжига праймеров и, как следствие, возможностью получения ПЦР-продуктов. При этом размер зон амлификации совпадал с расчетным. Интенсивность окраски электрофоретических фракций среди образцов варьировала в широкой степени, что могло быть связано как с ну-клеотидной изменчивостью в местах отжига праймеров, так и с различиями в концентрации исходной матрицы в препаратах нуклеиновых кислот. Особую важность данный аспект имел для образцов, полученных из древесных кернов, содержащих также суммарную ДНК и растения-хозяина и различающихся по степени зараженности корневой губкой. Для нивелирования различий в концентрациях матриц была проведена предварительная нормализация образцов по данным количественной ПЦР (универсальные праймеры HetF и HetR, протокол SYBRGreen). Однако использованный STS-маркер Het представляет собой локус, входящий в состав рДНК, ко-пийность которой, по литературным данным, может варьировать в определенной степени среди штаммов и видов грибных организмов.
Маркеры HetAnV2 и HetParV2
Выявляемый полиморфизм среди образцов корневой губки по маркеру HetParV2 был связан с существенными отличиями нуклео-тидных последовательностей в зоне отжига праймеров, что обуславливало наличие или отсутствие ПЦР-продукта. В то же время, для маркера HetAnV2, различия между образцами были аналогичны HetParV2, но также выявлялись и амплифицируемые варианты иного (от
расчетного) размера.
Маркер ШШ^З и
Проведенный анализ образцов корневой губки по маркерам HetAllV3 и HetAllV4 показал наличие продуктов амплификации для всех изученных изолятов (рис. 1). Выявляемый полиморфизм был связан с изменением размеров локусов и соответствовал расчетным значениям, полученным на основании анализа геномных данных Н. annosum (учетная запись проекта CVKZ01.1) и Н. ра^1рогит (учетная запись проекта PDUQ01.1).
В целом на основании проведенного исследования была составлена сводная таблица результатов диагностики для 26 образцов корневой губки как по морфологическим, так и по молекулярно-генетическим признакам (табл. 2). Как следует из таблицы 2, для разработанных видоспецифических (применительно к Н. ра^1рогит и Н. annosum) праймеров не было выявлено абсолютной взаимосвязи между результатами ПЦР-амплификации. Так, наибольшее значение коэффициента корреляции (0,75) было выявлено для маркеров HetParv1 и HetParV2, разработанных на основе геномных данных Н. ра^грогит (учетная запись PDUQ01.1) и локализованных в различных скаффолдах (хромосомах) гриба. Значения коэффициентов корреляции для пар HetAnn3 и HetParV2, HetAnV2 и HetParV2 не превысили 0,57 и 0,48 соответственно, что указывает на отсутствие общей направленности результатов диагностики. Наименьшее значение коэффициента корреляции (0,04) было отмечено для маркеров
HetAnn3 и HetAnV2, для дизайна праймеров которых были использованы нуклеотидные последовательности Н. annosum (учетная запись проекта CVKZ01.1).
Наибольший уровень сходства результатов диагностики был выявлен для универсальных (по отношению к Н. ра^грогит и Н. annosum) маркеров HetAllV3 и HetAllV4, несмотря на их различное происхождение, функции и хромосомную локализацию. Значение коэффициента корреляции для изученных образцов составило 1. Высокая кон-кордантность молелекулярно-генетических признаков была также выявлена между парами маркеров HetAllV3 и ^РагУ2 — 0,92, HetAllV4 и HetParV2 — 0,92, HetParV1 и Не1РаГУ2 — 0,78, ШЛ1ТУ3 и Не!Рш^1 — 0,72, ШЛ1т и Не1РагУ1 — 0,72.
Проведенный сравнительный анализ данных, полученных по полиморфному маркеру HetA112, не позволил выявить закономерностей формирования генетического и гено-типического разнообразия в сопоставлении с изученными морфологическими признаками и данными, полученными с использованием других маркеров.
Полученные результаты кросс-амплификации видоспецифических маркеров могут быть объяснены как индивидуальным характером изменчивости, диагностируемой у депозитов Н. рагу1ротит или Н. annosum NCBI GenBank, так и, предположительно, наличием процессов интро-грессивной гибридизации между Н. parvгporum и Н. annosum и, как следствие, формированием различных вариантов межвидовых гибридов.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (-) 11 12 13 М
Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР-продуктов изолятов Heterobasidion spp. (праймеры HetA11V3F и HetA11V3R) Образцы: 1 — 1-11; 2 — 1-12; 3 — 1-13; 4 — 1-14; 5 — 2-3; 6 — 1-6; 7 — 2-5.3; 8 — 2-2; 9 — 2-9.2; 10 — 2-1; 11 — отриц. контроль; 11 — 2-9.6; 12 — 1-1; 13 — 1-2; М — маркер молекулярного веса
Таблица 2
Результаты молекулярно-генетической оценки образцов HeteroЪasidion врр.
Изолят Место сбора Тип образца Тип гименофора Опушение Не1А112, п. н. Не1АппЗ, п. н. Не1АпУ2, п. н. Не1РагУ1, п. н. Не1РагУ2, п. н. Не1А11УЗ, п. н. Не1А11У4, п. н.
1-1 Беловежская пуща П м + 130 - - 117 106 102 149
1-2 Беловежская пуща П м + 153 120 - 117 106 102 149
1-3 Негорельский уч. опыт, лесхоз К 142/153/170 120 100 - - 116 161
1-5 Полоцкий лесхоз П м +/- 130 120 - 117 106 102 149
1-6 Узденский лесхоз К 153/161 120* 100 - - 116 116
1-7 Оршанский лесхоз П м + 130 - - 117 106 102 149
1-8 Узденский лесхоз К 142/153/170 120 100 117* - 116 161
1-9 Узденский лесхоз К 142 - 100 - - 116 116
1-10 Ивьевский лесхоз П м + 130/161 120 - 117 106 102 149
1-11 Узденский лесхоз К 153/161 120 100 117* - 116 161
1-12 Узденский лесхоз К 130/153/170 120 100 117 106* 116 161
1-13 Барановичский лесхоз П к - 142/153/161 120 100 117 - 116 161
1-14 Барановичский лесхоз П к - 130/153 120 100 - - 116 161
2-1 Полоцкий лесхоз П м +/- 153/161/170 120* 100 117 106 102 149
Окончание таблицы 2
Изолят Место сбора Тип образца Тип гименофора Опушение Не1А112, п. н. Не1АппЗ, п. н. Не1АпУ2, п. н. Не1РагУ1, п. н. Не1РагУ2, п. н. Не1А11УЗ, п. н. Не1А11У4, п. н.
2-2 Ивьевский лесхоз П м + 142/161 - 100 117 106 102 149
2-3 Ивьевский лесхоз П м + 142/161 120* 100 117 106 102 149
2-4 Стародорожский опыт, лесхоз П к - 153/161 120 80 - - 116 161
2-5.1 Оршанский лесхоз П м + 142 - 100 117 106 102 149
2-5.3 Оршанский лесхоз П к - 161 120 80 117 - 116 161
2-7.1 Боровлянский спецлесхоз П ср +/- 142/161 120* 100 117 106 102 149
2-7.2 Боровлянский спецлесхоз П м + 142/161 - 100 117 106 102 149
2-7.3 Боровлянский спецлесхоз П к - 153/161 120 80 - - 116 161
2-7.4 Боровлянский спецлесхоз П м +/- 142 - 100 117 106 102 149
2-8.1 Беловежская пуща П м + 161 120* 100 117 106 102 149
2-9.2 Барановичский лесхоз П ср - 153/161 120* 80 - - 116 161
2-9.6 Барановичский лесхоз П к - 153/161 120* 80 117 - 116 161
Примечание. Тип образца: П — плодовое тело, К — керн. Тип гименофора: к — крупнопоровый, ср — среднепоровый, м — мелкопоровый. Маркеры: * — слабая окраска ампликонов. Цветом обозначены ячейки, значения морфологических или молекулярных признаков в которых в наибольшей степени соответствуют Н. раппрогит
Заключение
Исходя из полученных результатов, видно, что межвидовые отличия между изолятами в равной степени обусловлены как вариациями в нуклеотидных последовательностях маркеров, так и внутригенными перестройками. На основании проведенной комплексной диагностики маркеры HetAllV3 и HetAllV4 рекомендованы для проведения молекуляр-но-генетической диагностики H. parviporum и H. annosum.
Работа выполнялась в рамках гранта БРФФИ Б22М-055.
Список использованных источников
1. Niemela, T. Taxonomy of the genus Het-erobasidion / T. Niemela, K. Korhonen // Het-erobasidion annosum: ecology, biology, impact and control / edited by S. Woodward [et al.]. -Cambrige, 1998. - Ch. 2. - P. 27-33.
2. Mitchelson, K. Diagnosis and differentiation of intersterility groups / K. Mitchelson, K. Korhonen // Heterobasidion annosum: ecology, biology, impact and control / edited by S. Woodward [et al.]. - Cambrige, 1998. - Ch. 5. - P. 71-92.
3. Федоров, Н. И. Ферментативная активность разных штаммов корневой губки / Н. И. Федоров, Н. И. Стайченко, Л. М. Неустроева // Микология и фитопатология. - 1975. - Т. 9, № 3. - С. 235-239.
4. Korhonen, K. Intersteriity groups ofHeterobasidion annosum / K. Korhonen // Commun. Inst. For. Fenn. - 1978. - Vol. 94, № 6. - 25 p.
5. Otrosina, W. J. Heterobasidion occidentale sp. nov. and Heterobasidion irregulare nom. nov.: a disposition of North American Heterobasidion biological species / W. J. Otrosina, M. Garbelotto // Fungal Biol. - 2010. - Vol. 114. - P. 16-25.
6. Yuan Y. et al. An updated global species diversity and phylogeny in the forest pathogenic genus Heterobasidion (Basidiomycota, Russulales) //Frontiers in Microbiology. - 2020. - Т. 11.
7. Житникова, М. В. Состав и распространение интерстерильных групп корневой губки в лесных насаждениях Беларуси / М. В. Жит-никова, Н. И. Федоров // Биология, систематика и экология грибов в природных экосистемах и агрофитоценозах: материалы международной научной конференции, Минск, 20-24 сент. 2004 г. / Ин-т эксперим. ботаники им. В.Ф.
Купревича ; ред-кол.: О. С. Гапиенко [и др.]. -Минск, 2004. - С. 100-103.
8. Федоров, Н. И. Корневые гнили хвойных пород в лесах Беларуси / Н. И. Федоров // Проблемы лесоведения и лесоводства: сб. науч. тр. - Гомель : Ин-т леса НАН Беларуси, 2001.
- Вып. 53. - С. 342-345.
9. Федоров Н. и др. Исследование прорастания базидиоспор корневой губки. - 1978.
10. Stenlid J. Regional differentiation in Heterobasidion annosum //8. International Conference on Root and Butt Rots, Uppsala (Sweden), 9-16 Aug 1993. - Sveriges Lantbruksuniv., 1994.
11. Piri T., Korhonen K. Infection of advance regeneration of Norway spruce by Heterobasidion parviporum //Canadian journal of forest research.
- 2001. - Т. 31, №. 6. - С. 937-942.
12. Gunulf A. et al. Secondary spread of Heterobasidion parviporum from small Norway spruce stumps to adjacent trees //Forest Ecology and Management. - 2013. - Т. 287. - С. 1-8.
13. Mitchelson, K. Diagnosis and differentiation of intersterility groups / K. Mitchelson, K. Korhonen // Heterobasidion annosum: ecology, biology, impact and control / edited by S. Woodward [et al.]. - Cambrige, 1998. - Ch. 5. - P. 71-92.
14. Karlsson, J.-O. Pectic isozyme profiles of Intersterility groups in Heterobasidion annosum / J.-O. Karlsson, J. Stenlid // Mycol. Res. - 1991.
- Vol. 95, № 5. - Р. 531-536.
15. Combined fatty acid and sterol profiles of Heterobasidion annosum intersterility groups S, P and F / M. M. Müller [et al.] // Mycol. Res. -1995. - Vol. 99, № 9. - Р. 1 025-1 033.
16. Differentiation of intersterility groups and geographic provenances among isolates of Het-erobasidion annosum detected by random amplified polymorphic DNA assays / M. Garbelotto [et al.] // Can. J. Bot. - 1993. - Vol. 71, № 4. - Р. 565-569.
17. Fabritius, A.-L. Variation in Heterobasidi-on annosum detected by random amplified polymorphic DNAs / A.-L. Fabritius, R. Karjalainen // Eur. J. For. Path. - 1993. - Vol. 23, № 4. - Р. 193-200.
18. Heterobasidion annosum 5.8s ribosomal DNA and internal transcribed spacer sequence: rapid identification of European intersterility groups by ribosomal DNA restriction polymorphism / T. Kasuga [et al.] // Current Genetics. -
1993. - Vol. 24. - P. 433-436.
19. Stenlid, J. Intraspecific genetic variation in Heterobasidion annosum revealed by amplification of minisatellite DNA / J. Stenlid, J.-O. Karlsson, N. Hogberg // Mycol. Res. - 1994. - Vol. 98. - P. 57-63.
20. Vainio, E. J. Variation of RAMS markers within the Intersterility groups of Heterobasidion annosum in Europe / E. J. Vainio, J. Hantula // Eur. J. For. Pathol. - 1999. - Vol. 29, № 3. - P. 231-246.
21. Hantula, J. Specific primers for the differentiation of Heterobasidion annosum (s. str.) and H. parviporum infected stumps in Northern Europe / J. Hantula, E. Vainio // Silva Fennica. - 2003. -Vol. 37, № 2. - P. 181-187.
22. Skipars, V. Detection of Heterobasidion
annosum in Scots pine trees using a polymerase chain reaction based methods / V. Skipars, D. Rungis // Baltic Forestry. - 2011. - Vol. 17, № 1. - P. 2-7.
23. Падутов, В. Е. Методы молекулярно-ге-нетического анализа / В. Е. Падутов, О. Ю. Баранов, Е. В. Воропаев. - Минск: Юнипол, 2007. - 176 с.
24. Острикова, М. Я. Оценка зараженности почв корневой губкой на лесокультурных площадях / М. Я. Острикова // Сб. науч. тр. / Ин-т леса НАН Беларуси - Гомель, 2011. - Вып. 71: Проблемы лесоведения и лесоводства. -С.480-488.
A. M. Nestyuk1, S. V. Panteleev2, V. A. Yarmolovich1, O. Yu. Baranov13
STUDYING OF THE STS-MARKERS POLYMORPHISM IN HETEROBASIDION ISOLATES INFECTING NORWAY SPRUCE (PICEA ABIES (L.) H.KARST.) IN BELARUS
1Belarusian State Technological University, 13a Sverdlova St., 220006 Minsk, Republic of Belarus e-mail: antonina.nestyuk95@gmail.com 2Institute of Forests, National Academy of Sciences of Belarus, 71 Proletarian St., 246050 Gomel, Republic of Belarus 3Department of Biological Sciences of the National Academy of Sciences of Belarus 66 Independence Ave., 220072 Minsk, Republic of Belarus
The article presents the results of studying the genetic polymorphism of Heterobasidion (root rot agent) isolates that infect Norway spruce (Picea abies) in various regions of Belarus. Based on the data obtained, a comparative assessment of the suitability of STS markers for species diagnostics of fungal isolates (Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. sensu stricto (s. s.) and Heterobasidion parviporum Niemela & Korhonen) was carried out. Samples of the sporocarp and infected wood were collected in Norway spruce stands on the territory of three geobotanical subzones — in seven forestry enterprises of the Ministry of Forestry of the Republic of Belarus, on the territory of the Negorelsky educational and experimental forestry and the National Park "Belovezhskaya Pushcha". Based on the comprehensive analysis of the samples, markers for specific molecular genetic diagnosis of H. annosum and H. parviporum were recommended.
Keywords: root rot fungi, Heterobasidion parviporum Niemela & Korhonen, Heterobasidion annosum (Fr.) Bref., species identification, molecular genetic analysis, STS markers.
Дата поступления в редакцию: 01 сентября 2022 г.
