ВИДОВАЯ И ОРГАННАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КАНЦЕРОГЕНА 1,2-ДИБРОМ-З-ХЛОРПРОПАНА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Общие вопросы гигиены

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1993 УДК 615.277.4.015.4.06.076.9

В. С. Журков, Л. П. Сычева, О. Г. Саламатова, И. Ф. Выскубенко, Е. Г. Фельдт

ВИДОВАЯ И ОРГАННАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КАНЦЕРОГЕНА 1,2-ДИБРОМ-З-ХЛОРПРОПАНА

НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва

Перспективным направлением скрининга канцерогенов является разработка краткосрочных тестов, позволяющих оценивать генотоксический эффект химических соединений в разных тканях и органах млекопитающих. Один из наиболее подходящих для этого тестов микроядерный метод, который адаптирован в лаборатории оценки отдаленных эффектов для анализа клеток разных органов.

Целью исследования было изучение органной специфичности цитогенетического действия известного канцерогена 1,2-дибром-З-хлорпропана (ДБХГ1) микроядерным методом у мышей и крыс.

В опытах использован ДБХП, синтезированный в Институте элементоорганической химии им. А. Н. Несмеянова РАН. Содержание основного вещества в образце было не менее 95 %. ДБХП растворяли в подсолнечном масле и вводили зондом внутрижелудочно. LD50 при внутриже-лудочном введении составляет 257 мг/кг для мышей [8) и 150—370 мг/кг для крыс \2\.

Опыты проведены на мышах-самцах SHK массой 30—35 г и CBAB6F1 массой 20—25 г из питомника «Столбовая», а также на белых нелинейных крысах-самцах массой 250—300 г из питомника «Крюково». Животные получали воду без ограничений и стандартный пищевой рацион. В экспериментальных группах было по 5—7 животных.

ДБХП вводили мышам SHK дважды за 30 и 6 ч до забоя в дозах 1,03; 5,14; 25,7 и 128 мг/кг (0,004; 0,02; 0,1 и 0,5 LD50 соответственно). Анализировали частоту полихроматофильных эритроцитов костного мозга с микроядрами.

Мышам CBAB6F1 ДБХП вводили 4 раза с интервалом 24 ч между введениями в дозах 5,14; 25,7 и 51,4 мг/кг (0,02, 0,1 и 0,2 LD50). Одну группу животных забивали через 24 ч после введения последней дозы и готовили препараты клеток костного мозга и разных отделов желудоч-но-кишечного тракта. Животным другой группы через 1 сут после последнего введения производили частичную гепатэктомию и через 96 ч готовили препараты гепатоцитов.

В параллельном опыте для учета аберраций хромосом в клетках костного мозга мышам 5-кратно с интервалом 24 ч вводили ДБХП в тех же дозах. Препараты метафазных хромосом клеток костного мозга готовили через 6 ч после последнего введения вещества.

В опыте на крысах ДБХП вводили 4-кратно с интервалом 24 ч между введениями в дозах 6, 30 и 60 мг/кг (0,02 0,1 и 0,2 LDS0 соответственно). Животных забивали через 24 ч после

последнего введения и готовили препараты клеток костного мозга и разных отделов желудочно-кишечного тракта.

Препараты метафазных хромосом клеток костного мозга мышей готовили по стандартной методике [3]. Анализировали по 50 метзфаз на животное. Учитывали одиночные и парные фрагменты, обмены хроматидного и хромосомного типа. Пробелы не регистрировали.

Препараты костного мозга мышей и крыс для анализа микроядер готовили по стандартной методике [3]. У каждого животного подсчитывали число полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) с микроядрами на 1000 ПХЭ.

Препараты эпителиальных клеток преджелудка, желудка, двенадцатиперстной, тонкой и толстой кишок мышей и крыс готовили по методике [1] с некоторыми модификациями. Анализировали по 1000 эпителиальных клеток на животное, учитывали клетки с микроядрами, с помощью окуляр-микрометра измеряли размеры ядра и микроядра, определяли отношение объемов микроядра и ядра.

Для приготовления препаратов гепатоцитов мышам через 1 сут после последнего введения ДБХП производили частичную гепатэктомию. Через 96 ч после операции готовили препараты по методике, предложенной Л. П. Сычевой, Н. Н. Беляевой [4]. Перфузировали печень физиологическим раствором. Выделяли кусочек печени и измельчали ножницами в капле физиологического раствора в чашке Петри. Помещали в 0,15 М раствор сахарозы (37 °С) на 15—20 мин. Затем суспензию пипетировали для лучшего отделения клеток и фильтровали через капроновую сеточку в центрифужную пробирку. Центрифугировали 7 мин при 1500 об/мин. Супернатант удаляли, к осадку добавляли каплю 0,15 М раствора сахарозы, пипетировали и наносили каплю суспензии на предметное стекло. Готовили мазок, подсушивали на воздухе, проводили гидролиз 1 н. НС1 (37 °С, 15 мин), окрашивали азур-эозином. Анализировали по 2000 гепатоцитов на животное.

Цитогенетический анализ во всех опытах проводили на зашифрованных препаратах. При статистической обработке данных использовали параметрические и непараметрические методы парных сравнений, корреляционный, регрессионный и дисперсионный анализы.

В опытах на мышах БНК отмечено возрастание частоты ПХЭ с микроядрами с увеличением дозы ДБХП. Среднее число ПХЭ с микроядрами на )000 в контрольной группе составило 1,0±0,3, при дозах ДБХП 1,03; 5,14; 25,7 и 128 мг/кг —

Таблица I

Частота клеток с микроядрами в разных органах мышей и крыс после 4-кратного внутрижелудочного введения ДБХП (в каждой группе по 6 животных)

Животные Доза, мг/кг Число клеток с микроядрами на 1000 (М±т)

преджелудок толстая кишка

Мыши Контроль 1,00±0,25 1,50±0,34

5,1 2,33±0,87 1,84 ±0,54

25,7 2,75±0,96 1,84 ±0.48

51.4 3,00±0,89* 3,00±0,73*

Крысы Контроль 1,33±0,42 1,17±0,48

6,0 1,83±0,31 3,17±0,60*

30.0 2,67 ±0.42* 5,50±0,89**

60,0 5,00±0,86** 5,33±0,71**

Примечание. Здесь и в табл. 2: одна звездочка — достоверные различия с контролем при р<0,05, две — то же при р<0,01.

соответственно 1,8±0,7; 1,8±0,4; 3,7+0,5 и 4,5+ ±0,8. Значимое превышение показателя над контролем отмечено при двух максимальных дозах — 0,1 и 0,5 1Л)5о.

Частота метафаз с аберрациями хромосом в клетках костного мозга мышей СВАВ6Р| в опытных группах не отличалась от контроля: в контроле — 0,67+0,42 %, при дозе ДБХП 5,1 мг/кг — 1,67±0,61 %, 25,7 мг/кг — 2,00+0,89 % и 51,4 мг/кг - 0,33+0,33 %.

Данные эксперимента на мышах СВАВбР, и крысах приведены в табл. 1. Частота ПХЭ с микроядрами в костном мозге и эпителиальных клеток с микроядрами в желудке, двенадцатиперстной, тонкой кишках при всех испытанных дозах ДБХП не отличалась от контроля. В максимальной дозе вещество показало значимый цито-генетический эффект в преджелудке и толстой кишке. Корреляция доли клеток с микроядрами в преджелуДке с дозой ДБХП была незначимой, а в толстой кишке невысокой, но статистически значимой (л=0,42; с//=22; р<0,05). Зависимость числа клеток с микроядрами на 1000 клеток (у) в толстой кишке от дозы ДБХП мг/кг) описывалась линейным уравнением: у=1,46+ + (0,037±0,013)х (/уГр=4,57; 7,= 1; У2=22\ р< 0,05).

Результаты анализа гепатоцитов представлены в табл. 2. При всех дозах ДБХП отмечено значимое повышение доли гепатоцитов с микроядра-мн над контролем: эффект возрастал при увеличении дозы до 25,7 мг/кг (0,1 1^О50) и затем снижался при максимальной дозе 51,4 мг/кг (0,2 ЬО50).

Как и в опытах на мышах, ДБХП не влиял на частоту ПХЭ с микроядрами в костном мозге и эпителиальных клеток с микроядрами в желудке, двенадцатиперстной и тонкой кишках крыс. В преджелудке и толстой кишке ДБХП показал значимый, зависимый от дозы цитогенетический эффект. В преджелудке 2 максимальные, а в тол-стон кишке все испытанные дозы вызывали значимое повышение над контролем доли клеток с микроядрами. Зависимость числа клеток с микроядрами на 1000 клеток (у) от дозы ДБХП (х, мг/кг) хорошо описывалась линейным уравнением:

для преджелудка у= 1,30+ (0,059±0,11)*

Таблица 2

Частота гепатоцитов с микроядрами у частично гепатэктоми-рованных мышей после 4-кратного внутрижелудочного введения ДБХП

Лоза, мг/кг Число мышей Число проанализированных клеток Число гепатоцитов с микроядрамн на 1000 (А)±т)

Контроль 6 12 000 0,50±0,41

5,1 7 14 000 4,21 ±1.17*

25.7 5 10 000 7,2± 1,8**

51,4 6 12 000 4,25±1,33**

(/>гр=2.75; 71=1; 72=22; р<0,001); для толстой кишки у=2,29-\- (0,063±0,016)х (^регр=14-7= ^=22; р<0.001).

Кариометрический анализ показал, что распределение клеток с 1 микроядром по величине отношения объема микроядра к объему ядра в преджелудке и толстой кишке мышей и крыс были сходны с таковыми в общем контроле нескольких экспериментов лаборатории. На характер распределения показателя как у мышей, так и у крыс не влияли орган животного и доза вещества. В печени мышей величина отношения также не зависела от дозы вещества. Однако малый объем данных в контроле не позволил провести сравнение показателя у подопытных и контрольных животных.

В опытах на мышах и крысах ДБХП индуцирует опухоли полости носа, языка, гортани и легких при ингаляционном введении и опухоли преджелудка и носа — при пероральном воздействии [2]. Поскольку мишенями канцерогенного действия ДБХП чаще всего оказываются органы, расположенные в месте введения или близлежащие, интересно было оценить генотоксиче-скую активность ДБХП в эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта при пероральном введении. Данные литературы по мутагенному действию вещества в этих клетках отсутствуют. Как и предполагали, ДБХП повышал частоту клеток с микроядрами в преджелудке мышей и крыс. В более удаленных от места введения отделах желудочно-кишечного тракта крыс и мышей — желудке, двенадцатиперстной и тонкой кишках — цитогенетический эффект ДБХП не отмечен.

Неожиданным оказалось действие ДБХП на эпителиальные клетки толстой кишки. И у мышей, и у крыс этот препарат повышал частоту клеток с микроядрами, причем у крыс минимально действующая доза оказалась меньше в толстой кишке (0,02 Ь05о), чем в преджелудке (0,1 ЬОбо). Такой эффект может быть обусловлен особенностями его токсикокинетики. Й. Уо1р [10] отмечает возможность кишечной абсорбции аналогичного соединения — трихлорпропана. По-видимому, это присуще и ДБХП. Кроме того, многие авторы указывают на особые свойства конъюгатов 1,2-дигалоалканов с глутатионом. Это более реакционные электрофильные соединения, чем исходное вещество. Т. е. конъюгация с глутатионом в этом случае не является обычным путем детокси-кации, а наоборот, способствует образованию активных метаболитов, способных повреждать ДНК [5]. При этом конъюгаты могут образовываться как прямо, так и после окисления с помощью

цитохрома Р-450. Следовательно, при абсорбции метаболитов ДБХП в клетках кишечника и их конъюгации с глутатионом могут образовываться реакционно-способные соединения, индуцирующие цитогенетический эффект.

Генотоксический эффект ДБХП оценивали также в печени, поскольку именно здесь в основном происходит метаболизм этого препарата. ДБХП повышал частоту клеток печени с микроядрами у мышей во всех испытанных дозах, что указывает на большую чувствительность гепато-цитов по сравнению с клетками других органов. Эффект ДБХП увеличивался при действии доз 5,1 и 25,7 мг/кг, а затем при дозе 51,4 мг/кг снижался, но был все-таки значительно выше, чем в контроле. Отменено, что высокие дозы ДБХП приводят к истощению пула глутатиона, уменьшению глутатионовых сшивок и снижению повреждения ДНК |6]. Вероятно, этим и обусловлено снижение цитогенетического эффекта при действии высокой дозы ДБХП. Индукция опухолей в печени при введении ДБХП мышам и крысам не отмечена. Однако он значимо повышает частоту гепатом аквариумных рыб. По-видимому, ДБХП может индуцировать повреждения в гепа-тоцитах мышей, однако в результате того, что эти клетки относятся к медленно пролиферирующим, опухоли в печени не образуются. Можно полагать, что действие ДБХП совместно с веществами, усиливающими пролиферацию гепатоцитов, может индуцировать гепатоканцерогенез.

Общепринятая оценка цитогенетического действия препаратов в ПХЭ костного мозга показала наличие эффекта ДБХП, однако значительно менее выраженного, чем в преджелудке, толстой кишке или печени. ДБХП не индуцировал микроядер в ПХЭ костного мозга у мышей и крыс и аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей в диапазоне доз от 0,02 до 0,2 ЬО50 при 4-кратном внутрижелудочном введении. При 2-кратном введении ДБХП также не индуцировал микроядер в дозах 0,02 и 0,004 ЬОГ)0. Однако в более высоких дозах — 0,1 и 0,5 1^05о — он значимо повышал частоту ПХЭ с микроядрами. Полученные нами результаты и данные других авторов [7, 11 ] указывают на то, что ДБХП, по-видимому, обладает слабой цитогенетической активностью в клетках костного мозга в дозах на уровне 0,1 ЬО.зд и выше. Отсутствие эффекта, отмеченное нами в опытах на мышах и крысах при действии ДБХП в дозе 0,2 1-05о, возможно, обусловлено многократным введением препарата. По-

добный эффект показан G. Wooton и соавт. [11|, в опытах которых доза ДБХП 75 мг/кг была эффективной только при однократном введении, но не при 2- или 3-кратном.

Проведенные эксперименты позволяют оценить видовую специфичность цитогенетического эффекта ДБХП. Сходство действия препарата у крыс и мышей выражается в том, что он эффективен в одних и тех же органах: преджелудке и толстой кишке, и не эффективен в желудке, двенадцатиперстной и тонкой кишках. Однако крысы более чувствительны к действию препарата, чем мыши: минимально действующие дозы относительно LD50 у крыс значительно ниже, чем у мышей; возрастание доли клеток с микроядрами на единицу дозы ДБХП при сравнении коэффициентов регрессионных уравнений в 2,33 раза больше, чем у мышей, и это различие статистически достоверно. Данные других авторов при исследовании мутаций в половых клетках также показывают, что крысы более чувствительны к действию ДБХП, чем мыши [9].

Таким образом, результаты микроядерного теста выявляют четкую органную специфичность цитогенетического действия ДБХП (эффекты в клетках печени, преджелудка, толстой кишки), особенно выраженную у крыс.

Литература

1. Выскубенко И. Ф., Шеренешева Н. И. Способ подготовки эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта к исследованию: А. с. 1735737 СССР // Открытия,— 1992.— № 19.

2. Канцерогенные вещества.— М., 1987.

3. Методические указания но изучению мутагенной активности химических веществ при обосновании их ПДК в воде,— М„ 1986.

4. Сычева Л. П.. Беляева H. Н. Объем и методы геноток-сической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ.— Л.. 1989.— С. 90.

5. Baertsch A., Lutz W. К., Schlatter С. // Arch. Toxicol.-1991,- Vol. 65.- P. 169-176.

6. Holme Y., Soderlund E. I., Brunborg G. et al. // Carcinogenesis.— 1989.— Vol. 10, N 1.— P. 49—54.

7. Kapp R. W. Jr. // Toxicol, appl. Pharmacol.— 1979.— Vol. 48.— P. A46.

8. Registry of Toxic Effects of Chemical Substances / Eds. R. J. Lewis, R. L. Falken.— NIOSH.— 1980,— Vol. 2,— P. 425.

9. Teramoto S., Shirasu Y. 11 Mutat. Res.— 1989.— Vol. 221, N I.— P. 1—9.

10. Volp R. F. // Toxicol, appl. Pharmacol.— 1984,— Vol. 75, N 1,— P. 8-17.

11. Wooton G. E„ Gatehouse D. G. 11 Mutat. Res.— 1990.— Vol. 234, N 3-4.- P. 129-134.

Поступила 24.06.93

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 1993

УД К в 16-092:612.017.11 -02:616-003.671 -07

М. Г. Шандала, Р. В. Меркурьева, Ю. М. Мольков, М. Н. Костина, Г. Н. Степанова

КЛЕЩИ ДОМАШНЕЙ ПЫЛИ КАК НЕБЛАГОПРИЯТНЫЙ ФАКТОР ВНУТРИЖИЛИЩНОЙ

СРЕДЫ

НИИ профилактической токсикологии и дезинфекции ГКСЭН РФ, Москва

При определении влияния дезинфекционных средств (ДС) на состояние здоровья людей и, следовательно, безопасности их применения одной из важнейших задач медико-биологических исследований является оценка наиболее ранних и про-

гностически важных реакций организма человека, в том числе состояния иммунитета [2, 6, 7, 9|, служащего одним из основных объективных показателей состояния здоровья человека в целом. В настоящее время признано, что степень выра-