CC BY
11УДК 612.014.46
В.В. Юрченко, Ф.И. Мигель, Е.К. Кривцова, Н.А. Юрцева, Ю.А. Ревазова
ОЦЕНКА МУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТИ АКРЕПА НА ТРЕХ ТКАНЯХ
МЛЕКОПИТАЮЩИХ
ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН, Москва
Отечественный репеллент Акреп (N-гексилоксиметилкапролактам) при однократном введении в желудок самцам мышей не индуцировал аберраций хромосом в метафазах и микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга в дозах от 3 до 640 мг/кг (^ DL50) и доминатных летальных мутаций в половых клетках самцов в дозе 280 мг/кг. При нанесении на кожу крыс эмульсии Акрофтал в дозе 350 мг/кг по Акрепу в течение 1,5 мес. не наблюдали повышения частоты гепатоцитов с микроядрами.
Ключевые слова: костный мозг, печень, аберрации хромосом, микроядра, доминантные летальные мутации, репеллент Акреп.
Введение. Акреп ^-гексилоксиметилкапро-лактам) является отечественным репеллентом, предназначенным для отпугивания кровососущих насекомых и клещей. По острой репеллент-ной активности против гнуса он не уступает эталонному препарату ДЭТА, а по длительности ре-пеллентного действия превосходит его [4].
Мутагенную активность Акрепа изучали в соответствии с методическими рекомендациями [1]. На первом этапе работы препарат в разведениях 1 : 30, 1 : 100, 1 : 300 и 1 : 1000 был изучен в тесте Эймса на штаммах ТА 97, ТА 98 и ТА 100. При разведении 1:30 был отмечен бактериоста-тический эффект, особенно в варианте без метаболической активации (фракция 89). Мутагенные свойства Акрепа в использованных разведениях не были выявлены [2].
На втором этапе исследований оценили способность Акрепа вызывать цитогенетические нарушения в клетках костного мозга и доминантные летальные мутации в половых клетках мышей. В связи с тем, что общетоксическое действие Акрепа было связано с индукцией пере-кисного окисления липидов в печени, оценили также цитогенетическую активность Акрепа на гепатоцитах крыс.
Материалы и методы исследования. Использовали самцов и самок гибридов мышей F1 СВАхС 57В1 массой тела 20 г (ГУ Научный Центр биомедицинских технологий РАМН, филиал «Столбовая»). Масляные растворы Акрепа (ЗАО Щелково Агрохим) готовили непосредственно перед применением и вводили в желудок самцам мышей однократно в объеме 0,1 мл/10 г. Контрольным животным вводили в желудок подсолнечное масло в том же объеме, животным из группы положительного контроля — водный раствор
циклофосфана (ЦФ) (Самара, Россия) в дозе 10 мг/кг подкожно.
Анализ метафазных пластинок и микроядер (МЯ) в клетках костного мозга проводили на группах мышей по 5—8 самцов, Акреп вводили в дозах от 3 мг/кг до 640 мг/кг (около DL50). Через 22 ч после введения Акрепа для накопления метафаз животным вводили внутрибрюшинно колхицин 2,5 мг/кг, через 2 ч производили цер-викальную дислокацию и выделяли бедренные косточки, из которых одну использовали для приготовления мазков с целью анализа микроядер [6], а другую — для получения клеток в стадии метафазы [5]. Мазки окрашивали по Нохту, препараты метафазных хромосом — красителем Гимза, затем зашифровывали и микроскопиро-вали при увеличении 10x100. На мазках анализировали по 1000 полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) от каждой мыши, учитывали ПХЭ с МЯ. На метафазных препаратах от каждой мыши анализировали по 100 метафаз с модальным числом хромосом 40, в которых учитывали фрагменты одиночные и парные, обмены хроматид-ные и хромосомные.
В тесте на индукцию доминантных летальных мутаций использовали по 15 самцов мышей в группе, Акреп вводили в желудок однократно в дозе 280 мг/кг (Ую DL50). Подсадки самок производили в соотношении 3: 1 еженедельно в течение 3 недель (анализ постмейотических стадий сперматогенеза). На 17 день беременности после цервикальной дислокации, учитывали количество живых и мертвых плодов, а также резорбции ранние и поздние. Фертильность выражали в виде доли забеременевших самок в процентах от числа подсаженных. Постимплантацион-ную смертность выражали как отношение числа
Таблица 1
Аберрации хромосом в метафазах и микроядра в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей после введения в желудок акрепа и циклофосфана
Вещество, мг/кг Проанализировано Фрагменты Метафазы с абер- Проанализиро- ПХЭ с МЯ на
метафаз одиночные парные рацией на 100 вано ПХЭ 1000 ПХЭ
Контроль 800 11 1 1,5±0,5 6000 2,5±1,1
3 600 4 0 0,7±0,5 6000 1,7±0,7
10 477 5 0 1,1±0,6 5000 1,7±0,6
30 600 6 1 1,2±0,5 6000 2,5±0,8
90 600 4 1 0,8±0,5 6000 2,0±0,6
Акреп 160 600 2 0 0,3±0,3 6000 2,2±0,8
320 600 10 0 1,7±0,5 6000 3,7±0,9
418 500 10 1 2,2±0,7 4000 3,1±0,9
480 500 2 1 0,6±0,4 6000 3,3±1,0
640 600 5 0 0,8±0,5 6000 2,5±0,6
Циклофосфан 10 500 26 5 7,0±0,7* 6000 6,8±2,1*
Примечание: * — р < 0,001
мертвых имплантаций к сумме живых и мертвых эмбрионов.
На печени крыс изучали препаративную форму — эмульсию Акрофтал (ЗАО Щелково Агро-хим) — на основе Акрепа (20 %) и диметифтала-та (20 %). Самцам белых крыс массой тела 200 г (ГУ Научный Центр биомедицинских технологий РАМН, филиал «Крюково») на выстриженный участок спинки 5x6 см наносили эмульсию в дозе 1750 мг/кг (26 норм расхода [3]) ежедневно 5 дней в неделю в течение 1,5 месяцев. Контрольным крысам наносили основу эмульсии. Каждая группа состояла из 10 крыс. По завершении экспозиции животным удаляли % печени. Удаленные в процессе операции, а также полученные на 4-е
сутки после операции кусочки печени фиксировали в нейтральном формалине и готовили препараты диссоциированных клеток в соответствии с методическими рекомендациями [6]. Препараты окрашивали ацетоорсеином и зеленым светлым, шифровали и микроскопировали при увеличении 10x100. Анализировали по 1000 гепа-тоцитов от каждого животного в соответствии с расширенным протоколом микроядерного теста, разработанным нами ранее для эпителия слизистой оболочки щеки [8]. Учитывали клетки с высоковероятными и сомнительными МЯ, протру-зиями ядра (выбухания в цитоплазму, имеющие форму везикулы, ниппеля или разбитого яйца), двуядерные клетки и клетки в митозе.
Таблица 2
Индукция Акрепом доминантных летальных мутаций в половых клетках самцов мышей
Неделя подсадок Вариант опыта Число беременных самок Фертильность, % Постимплантационная смертность, % X2
1 контроль 36 80 6,6±1,4
акреп 41 89,1 5,6±1,5 0,27
циклофосфан 36 81,1 9,0±2,0 1,66
2 контроль 40 88,9 7,7±0,3
акреп 36 81,1 7,3±1,6 0,05
циклофосфан 38 84,4 8,5±1,9 0,27
3 контроль 40 88,9 4,7±1,1
акреп 38 90,5 6,2±1,4 0,34
циклофосфан 39 86,7 9,3±2,0 * 4,62
Примечание: * — р < 0,05
Таблица 3
Влияние эмульсии Акрофтал на цитогенетические и кариологические показатели гепатоцитов
Показатель (частота на 1000 клеток) Число клеток на 1000 (среднее значение ± ошибка среднего)
до регенерации после регенерации
контроль опыт контроль опыт
МЯ 0,4±0,2 0,3+0,2 11,9+1,0 10,4+1,3
Сомнительное МЯ 0,2±0,1 0,1+0,1 6,9+1,1 6,8+1,5
Протрузия ядра 0,0±0,0 0,1+0,1 1,7+0,5 1,6+0,4
Двуядерность 143,1+9,2 165,9+8,9 81,6+8,3 114,7+11,4
Митоз 0,5±0,3 0,6+0,4 5,8+0,8 9,2+1,3*
Профаза 0,2+0,1 0,2+0,2 0,5+0,3 2,2+0,4*
Метафаза 0,3+0,2 0,2+0,1 3,2+0,5 4,6+0,6
Ана-телофаза 0,0+0,0 0,1+0,1 2,1+0,4 2,4+0,7
Примечание: * — р < 0,01 по сравнению с соответствующим контролем
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью дисперсионного анализа, различия между группами крыс по частоте двуядерных клеток оценивали с применением ^критерия Стьюдента, по всем остальным показателям — критерия соответствия х2.
Результаты и обсуждение. Данные цитоге-нетических исследований на клетках костного мозга мышей приведены в табл. 1.
Аберрации хромосом в основном были представлены одиночными разрывами. Обмены наблюдались после воздействия циклофосфана в клетках, имеющих множественные фрагменты. Как видно из табл.1, Акреп не индуцировал аберраций хромосом в метафазах и микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга при его воздействии в диапазоне доз вплоть до DL50.
Результаты, полученные в тесте на индукцию доминантных летальных мутаций в половых клетках самцов мышей, представлены в табл. 2.
Как видно из табл. 2, фертильность самцов в течение опыта не изменялась как в контроле, так и после воздействия Акрепа в дозе 280 мг/кг и
Рис. Зависимость частоты гепатоцитов с МЯ от уровня остаточной пролиферации клеток печени
По оси абсцисс: митотический индекс у животных контрольной группы; по оси ординат: частота клеток с МЯ
циклофосфана в дозе 10 мг/кг. Уровень постим-плантационной смертности плодов не изменялся после введения самцам Акрепа и увеличивался только после воздействия циклофосфана на ранние сперматиды.
Результаты анализа микроядер в гепатоци-тах крыс представлены в табл. 3. Как видно из табл. 3, собственно процесс регенерации печени у животных сопровождался увеличением частоты не только МЯ (что было ранее отмечено в литературе [10]), но и протрузий (х2 = 18,91 в опыте и х2 = 11,28 в контроле). При этом процентное соотношение между частотами протрузий в форме везикулы, ниппеля и разбитого яйца составило 69,7, 21,2 и 9,1 % соответственно. Очевидно, что в процессе прохождения клеточного цикла выявились накопленные спонтанные или индуцированные потенциальные нарушения хромосом.
Частоты клеток с высоковероятными МЯ, а также с протрузиями ядра и сомнительными МЯ (предположительные маркеры генотоксич-ности) не различались при попарном сравнении опытных групп с контрольными как до, так и после восстановительной регенерации.
В связи с драматическим влиянием полноты регенерации ткани на выявляемость индуцированных МЯ [7] представляется необходимой оценка полноты регенерации, для чего рекомендовано учитывать частоту двуядерных гепатоци-тов или делящихся клеток [7, 9, 11, 12].
При рутинной оценке цитогенетической активности различных факторов на гепатоцитах обычно используют только материал, полученный через несколько дней после операции. Поскольку в ходе регенерации происходит снижение частоты двуядерных клеток, принято считать одинаковой полноту регенерации в опыте и контроле в том случае, когда на 3—4 сутки по-
сле операции частота двуядерных клеток в этих группах значимо не различается [7, 11, 12]. В соответствии с таким подходом данные из табл. 3 не позволяют установить задержку регенерации печени у крыс опытной группы по сравнению с контрольной.
Другой подход заключается в оценке отставания основной волны митозов по повышенной частоте метафаз на спаде пролиферации через 4 суток после операции [12]. Нет различий по частоте метафаз между опытной и контрольной группами (х2 = 2,27) (табл. 3).
В соответствии с третьим подходом сравнивают частоты всех клеток в митозе [9]. В нашем опыте митотический индекс на 4-е сутки после операции у животных опытной группы почти вдвое выше, чем в контрольной (х2 = 7,53), в основном за счет профаз (х2 = 10,69). Таким образом, выявлены два маркера отставания пролиферации —частота клеток в профазе и в митозе в целом. Однако оба они оказались слабо связаны с частотой клеток с МЯ: значение Я2 составляло от 0,214 до 0,022. Экстраполяция, произведенная на основании самой сильной связи, показанной на рис., приводит лишь к более точному выравниванию уровня МЯ в опыте и контроле.
Заключение. Акреп не индуцировал аберраций хромосом и микроядер в клетках костного мозга (до У DL50 однократно) и доминатных летальных мутаций в половых клетках самцов мышей ('/ю DL50 однократно), а также микроядер в гепатоцитах крыс (350 мг/кг по Акрепу, накож-но, повторно).
Список литературы
1. Дурнев А.Д., Ревазова Ю.А., Верстакова О.Л. и др. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических веществ //В кн. Руководство по экспериментальному (доклиниче-кому) изучению новых фармакологических веществ (ред. Р.У.Хабриев). - М, 2005. - С. 100-122.
2. Кривцова Е.К. Оценка мутагенной активности репеллента Акреп в тесте Эймса // 3-й съезд токсикологов России 2-5 дек 2008 г. Москва. Тез. докл. - М.: РПОХВ, 2008. - С. 157-159.
3. Методические рекомендации по отбору и изучению биологической активности и токсичности репеллентов. Утв. Нач. Гл. Упр. карантинных инфекций МЗ СССР В.П. Сергиевым 14.07.87 № 24-6/24. - М, 1987. - 60 с.
4. Наумов Ю.А., Шашина Н.И., Маркина В.В. и др. N-гексилоксиметилкапролактам, обладающий инсекто- и акарорепеллентной активностью. Патент 2017732 (Зарегистрирован в Гос. Реестре изобретений 15 авг. 1994 г. - 10 с.
5. Определение мутагенности химических соединений (генетический скрининг) на лабораторных мышах (методические указания). - М.: Медицина, 1977. - 12 с.
6. Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом (Метод. рек. Утв. зам. нач. Гл. Упр.карантинных инфекций МЗ СССР О.Г. Имамалиевым 03.04.84 № 286/10). - М, 1984. - 17с.
7. Урываева И.В. Перспективы разработки и применения в экологических исследованиях цитоге-нетического метода анализа микроядер в гепатоцитах // РАН Известия Сер. Биол., 1993. - № 1. -С. 88-94.
8. Юрченко В.В. Цитогенетические нарушения в эпителии щеки человека при экспозиции ге-нотоксикантами //Токсикол. вестник, 2005. -№ 6. - С. 14-21.
9. Braithwaite I., Ashby J. A non-invasive micro-nucleus assay in the rat liver // Mutat Res., 1988. -V. 203. - № 1. - P. 23-32.
10. George E., Burlinson B., Gatehouse D. Geno-toxicity of the 1- and 2-nitropropane in the rat // Carcinogenesis, 1989. - V. 10. - № 12. - P. 2329-2324.
11. Poll van de M.L. M., Hulst van der D.A. M, Tates A.D. et al. The role of specific DNA adducts in the induction of micronuclei by N-Hydroxi-2-aceti-laminofluorene in rat liver in vivo // Carcinogenesis, 1989. - V. 10. - № 4. - P. 717-722.
12. Tates A.D. A micronucleus test for hepatocytes to detect mutagens in rat liver in vivo // Mutat Res., 1980. - V. 74. - № 3. - P. 235-236.
Материал поступил в редакцию 29.01.09.
V.V. Yurchenko, F.I. Ingel, Ye.K. Krivtsova, N.A. Yurtseva, Yu.A. Revazova
ASSESSMENT OF MUTAGENIC ACTIVITY OF ACREP WITH THE USE OF THREE TISSUES OF MAMMALS
A.N. Sysin Research Institute for Human Ecology and Environmental Health, Russian Academy of Medical Sciences
A domestic repellent Acrep (N-hexyloximethylcaprolactum) did not induce aberrations of chromosome in metaphases and those of micronuclei in polychromatophylic erythrocytes of bone marrow at a single intragastric administration to male mice in doses of 3 to 640 mg/kg (^ of LD50) and dominant lethal mutations in sex cells of male mice at a dose of 280 mg/kg. While applying the emulsion AKROFTAL as AKREP to the rat skin in a dose of 350 mg/kg, within 1.5 months, no increased frequency of hepatocytes with micronuclei was observed.
