CC BY
221
УДК 159.9.07 ББК 55.5
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОЯДЕРНОГО ТЕСТА ПРИ ОЦЕНКЕ ГЕНОТОКСИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
ЗВЕРЕВА Д.Е.
ФГБОУВО ЧелГУ, Челябинск, Россия e-mail: [email protected]
Аннотация
В современном мире появляется все большее количество веществ, которые требуют оценки степени вредного воздействия на природу в целом и в частности на человека. Приоритетной является проверка лекарственных препаратов и пищевых компонентов. Так как фармакологические средства являются важной частью среды обитания человека, изучение их безопасности является неотъемлемым этапом в доклинических исследованиях. По данным зарубежной литературы в качестве наиболее надежного теста при генотоксической оценке выступает микроядерный тест в клетках костного мозга грызунов. К важным задачам современной медицины относится поиск лекарственных препаратов, которые подходили бы для лечения последствий применения ионизирующего излучения, так как наиболее частым осложнением после перенесения лучевой терапии является лучевое поражение кожи. Перспективность применения показывают препараты на основе белка альфа-фетопротеина, так как он является тонким регулятором гомеостаза в физиологических условиях и при развитии патологических процессов, поэтому проверка данного белка на выявление генотоксических свойств с помощью комплекса тест-систем, в том числе и микроядерным тестом, является целесообразной. Кроме того, микроядерный тест проявляет себя как чувствительный метод оценки генотоксичности ионизирующих излучений в широком диапазоне доз, что говорит о чувствительности метода. В отечественной научной литературе содержится небольшое количество исследований генотоксичности микроядерным тестом. Результаты этих экспериментов требуют систематизации знаний и обобщение материала. В работе показано, что данный метод является надежным, воспроизводимым и относительно простым в исполнении. В работе рассмотрены исследования лекарственных препаратов методом микроядерного теста, приведены механизмы образования микроядер, достоинства и недостатки метода.
Ключевые слова: альфа-фетопротеин, микроядерный тест, микроядра, генотоксичность, лекарственные средства, ионизирующее излучение.
Актуальность. В настоящее время синтезируется большое количество новых лекарственных препаратов, которые требуют оценки их безопасности. Известно, что безопасность лекарственных веществ устанавливают в доклинических исследованиях и одним из важных этапов является оценка генотоксических свойств. Если исследуемый продукт будет отличаться высокой степенью генотоксичности, то есть оказывать повреждающее воздействие на генетический материал, то его нельзя будет использовать с целью лечения [20]. Кроме того, по данным научной литературы отечественными и зарубежными авторами показано, что лекарственные препараты обладающие генотоксическими свойствами (некоторые
антибиотики, психотропные, гипотензивные и др.) увеличивает мутагенную нагрузку окружающей среды [19, 21].
Для оценки генотоксических свойств рекомендуется использовать определенный набор методов, который соответствует требованиям ВОЗ. Как правило, используется несколько тестов с целью всестороннего изучения возможных мутагенных свойств вещества. Опыты проводят на культивируемых животных и растительных клетках, на клетках дрожжей и бактерий, также часто используют опыты с лабораторными животными. При этом изучают точковые мутации, хромосомные перестройки и мутации, сцепленные с полом [16].
Одним из надежных способов определения генотоксических свойств веществ является микроядерный тест на эритроцитах костного мозга мелких грызунов. С его помощью можно получить информацию о воздействии исследуемых веществ на любой стадии клеточного цикла клеток, а доступность постановки данного теста, позволяет автоматизировать работу [10]. Тем не менее в научных публикациях информации об изучении генотоксических свойств лекарственных веществ с помощью микроядерного теста немного и требуется обобщение материала.
Таким образом, цель данной работы - с помощью научной литературы изучить возможности микроядерного теста при выявлении генотоксических свойств
лекарственных веществ.
Микроядерный тест - это довольно распространенный метод оценки хромосомных повреждений в эукариотических клетках и помимо исследований генотоксичности веществ, его используют при биомониторинге окружающей среды [6, 15], биодозиметрии [7], при оценке радиочувствительности клеток [2, 18]. Кроме этого, известно, что микроядра могут являться предиктом некоторых заболеваний человека, например, таких как сахарный диабет, онкология и аллергия [1]. На данный момент с помощью микроядерного теста проверено большое количество химических,
биологических и физических агентов. В странах ЕЭС и в Японии метод оценки микроядер является обязательным при токсикологических исследованиях [19].
В последнее время исследования различных агентов на индукцию ими цитогенетических повреждений в клетках проводится тестами in vitro. Но стоит отметить, что эксперименты с культурами клеток зависят от условий постановки эксперимента и от различных неспецифических эффектов, которые не возникают в тестах in vivo. Из всех методов оценки цитогенетических повреждений in vivo, наиболее часто используемым является определение микроядер в эритроидных клетках костного мозга грызунов. Подсчет микроядер в клетках костного мозга был предложен Schmid (1970) [27]. Преимуществом этого метода является легкость идентификации микроядра в эритроцитах, так как они лишены ядра. Подсчет частоты микроядер может осуществляется в молодых и зрелых эритроцитах. Молодые эритроциты получили название
полихроматофильные (ПХЭ), а зрелые эритроциты называются - нормохромными (НХЭ) (рис. 1). При окрашивании ПХЭ обладают голубоватой или фиолетовой окраской, что объясняется наличием высокой концентрации в цитоплазме рибонуклеиновой кислоты. НХЭ, в свою очередь, имеют окраску красноватую или желтую. При сравнении размеров видно, что ПХЭ крупнее НХЭ. В экспериментах было обнаружено, что, в зависимости от дозы мутагена, образование микроядер в полихроматофильных эритроцитах может идти по двум механизмам: более низкие дозы вызывают появление микроядра без воздействия на возрастной состав эритроцитов, а более высокие дозы значительно снижают процент юных клеток [16].
А)
wOO
.о[Л°
Б)
&
СГОЛОО
Рис. 1. Полихроматофильные (А) и нормохромные (Б) эритроциты
Механизмы образования микроядер. Как правило, образование микроядер происходят двумя путями (рис. 2):
1. из отставшего на стадии анафазы хромосомного материала, который в процессе митоза остается в одной из дочерних клеток.
2. крупные микроядра могут образоваться из целой хромосомы в процессе нерасхождения хроматид. Такое нерасхождение может быть вызвано повреждением на веретена деления, в следствие чего образуются его дефекты.
Рис. 2. Формирование микроядер в делящихся клетках (из ацентрических фрагментов и из целой хромосомы) [7]
В научной литературе хорошо представлены механизмы образования микроядер из ацентрических фрагментов. Во-первых, образование микроядер из-за неустраненных двунитевых разрывов ДНК являются причиной формирования ацентрических фрагментов. Такое явление наблюдается, когда мутационная нагрузка на ДНК превышает репарационный
потенциал в клетке в течение определенного периода. Во-вторых, ошибочная репарация двунитевых разрывов ДНК, которая приводит к появлению дицентрических хромосом и ацентрических фрагментов, из которых образуется микроядро. В свою очередь дицентрические хромосомы формируют мост между двумя дочерними ядрами. Такую цитогенетическую аномалию можно наблюдать в цитокинез-блокированных клетках, так как при цитотомии мосты разрушаются (рис. 3) [8].
Рис. 3. Формирование микроядра и моста в результате ошибочной репарации двунитевого разрыва в сестринских хроматидах [25]
Образование микроядер из целой хромосомы связано с дефектами веретена деления, к чему может привести, например, гипометилирование цитозина. В норме цитозин в центромерных участках и в альфа-сателлитных повторах в значительной степени метилирован. Сборка кинетохорных белков, зависит от степени метилирования в данных районах, что обуславливает правильное связывание ценромеры с нитью веретена деления. Гипометилирование цитозина в центромерных и прицентромерных районах обуславливает нарушение взаимодействия центромеры с веретеном, в результате чего хромосома задерживается на экваторе и в последствии дает начало микроядру. Кроме этого, еще одним механизмом образования микроядра из целой хромосомы могут быть мутации, приводящие к дефектам в динамике взаимодействия кинетохорных белков и микротрубочек. Дефекты митотической сборки веретена, ненормальное удвоение центросомы и точечные дефекты в контроле митоза также могут служить причинами формирования микроядер [11].
Современные цитогенетические методы окраски хромосом позволяют отличить микроядра, образованные разными путями. Для этого используют меченные зонды к центромерным районам хромосом. Если микроядро содержит центромерный сигнал, то
это значит оно включает в себя целую хромосому [25].
В научной литературе описан еще один механизм, объясняющий появление микроядер -это так называемые BFB-циклы, описанные McClintock в 1930 году [24]. Суть данного цикла состоит в том, что в результате двунитевого разрыва ДНК происходит утрата теломерных районов, а после репликации поврежденные сестринские хроматиды сливаются и дают начало дицентрической хромосоме. После цитотомии такая хромосома разрывается, в результате чего в одной из дочерних клеток возникает недостаток генетической
информации, а в другой - избыток. Затем такой цикл может повторяться, либо участки хромосомы с амплифицированными генами конъюгируют, образуют циклическую структуру, которая элиминируется из ядра и дает начало микроядрам [25].
Достоинства и недостатки метода. Микроядерный тест имеет несколько преимуществ [8]. Во-первых, с его помощью можно получить информацию о воздействии анализируемых соединений на любой стадии клеточного цикла. Вторым преимуществом является точность и простота постановки данного теста, что позволяет автоматизировать работу. Так как исследование проводится in vivo, то экстраполяция данных на человека при оценке безопасности вещества является более надежной. Микроядерный тест можно использовать при анализе тканей с низкой митотической активность. Кадровые, временные и экономические затраты при постановке микроядерного теста минимальны.
К недостаткам микроядерного теста можно отнести то, что без специального окрашивания нельзя точно выявить тип хромосомных аберраций и обнаружить хромосомы, в которых произошло нарушение. Кроме этого результаты тестирования могут различаться в зависимости от того, какие будут применены методы фиксации и окраски. Число клеток с микроядрами может достаточно сильно варьировать в разных популяциях животных и человека. Это связано с присутствием в окружающей среде различных генотоксических веществ. Уровень клеток с микроядрами в разных органах и тканях у одного и того же организма не одинаков. В эксперименте нужно учитывать, что на частоту микроядер важное влияние оказывает пол, возраст и
физиологические особенности исследуемого организма [8].
Методика микроядерного теста на эритроцитах грызунов. Данная методика является стандартной и более детально описана в исследованиях [27]. Для приготовления препарата костный мозг вымывают из бедренной кости в эмбриональную телячью сыворотку, затем центрифугируют в течение 5 мин при скорости 100 после удаляют надосадочную жидкость. Следующий этап заключается в ресуспендировании осадка. На один конец обезжиренного, чистого предметного стекла наносят каплю суспензии и с помощью предметного стекла ее растягивают. Перед последующей окраской препараты необходимо высушить на воздухе. Окраска производится дважды, используют красители Май-Грюнвальд и Гимзы. Подсчет ПХЭ с микроядрами производят на большом увеличении (рис. 4). Отмечается также количество НХЭ с микроядрами. Для каждого животного соотношение ПХЭ и НХЭ определяется путем анализа в сумме 1000 эритроцитов. Генотоксический эффект исследуемого соединения выражается в изменении соотношения ПХЭ и НХЭ [16].
^ ! ф\ т 7
Рис. 4. Препарат клеток костного мозга мышей, содержащих микроядра. Обработка этиленимином. Стрелками показаны микроядра [27]
Так как некоторые мутагены способны индуцировать микроядра в тех клетках, которые находятся в 02-фазе клеточного цикла, то генотоксические эффекты могут наблюдаться несколько раньше, по сравнению с эффектами от других мутагенных агентов, которые являются зависимыми от Б-стадии. Для того, чтобы повысить точность регистрации эффектов, необходимо выяснить, в какой промежуток времени от начала воздействия анализируемого фактора происходит выход максимального количества ПХЭ с микроядрами. Для таких повреждающих агентов, которые не зависят от Б-фазы клеточного цикла, промежуток времени
между обработкой клеток агентом и первым зафиксированным увеличением частоты микроядер в ПХЭ находится в пределах от 8 до 12 ч [16].
Важно учитывать, что за микроядро может быть принят артефакт, что оказывает свое влияние на точность микроядерного теста. За микроядра могут быть ошибочно приняты гранулы тучных клеток, при их размещении на ПХЭ. Основное отличие микроядер от других структур заключается в том, что они всегда имеют четкие края и равномерно окрашены. По форме микроядра круглые, реже встречаются овальные и в форме полумесяца. Значительное число артефактов можно отличить при помощь перемещения препарата вниз и вверх. Это так называемый "оптический разрез". При этом, если вокруг частиц при выведении ее из фокуса обнаруживается кольцо свечения, то это -артефакт [16].
Полученные с использованием
микроядерного теста данные указывают на то, что для учета микроядер достаточно одного пола лабораторного животного. Однако, если имеются доказательства того, что разница в результатах между мужскими и женскими особями значительна, то в эксперименте следует учитывать оба пола [23].
Стандартного режима дозировки при исследовании вещества на генотоксичность нет, но следует использовать как минимум 3 уровня дозирования. Наибольшая испытанная доза должна быть максимально переносимой и основываться на клинических симптомах или смертности [23].
Использование микроядерного теста при оценке генотоксических свойств лекарственных средств
В связи с тем, что в своей повседневной жизни человек тесно соприкасается с различными ксенобиотиками, необходима качественная проверка этих веществ на генотоксичность. Но оценка абсолютно всех соединений невозможна, поэтому выборочность тестирования является одним из основных принципов токсикологии. Выбор тестируемых соединений определяется масштабом их применения. Приоритетной считается проверка лекарственных препаратов, а также компонентов пищевых продуктов.
Генотоксичность должна оцениваться в тестах in vivo и in vitro, которые позволяют выявить повреждения генетического аппарата клетки [14]. Такая комплексная оценка позволяет
максимально снизить процент вероятности ложноположительных результатов.
Исследования показывают, что 50% канцерогенных веществ, не обнаруживающих вредных свойств при использовании одной тест-системы, не проходят строгую проверку на генотоксичность с использованием нескольких методов оценивания. Например,
диметилнитрозамин способный вызывать хромосомные повреждения и рак печени, не показывает подобных эффектов при испытании на клетках костного мозга [5].
В отечественной и зарубежной научной литературе имеются работы, посвященные использованию микроядерного теста с целью проверки лекарственных средств на генотоксичность [5, 13, 20, 23, 26, 28]. Чаще всего в эксперименте используются эритроциты костного мозга грызунов. Это связано с тем, что данные по возникшим в ККМ нарушениям можно корректно перенести на другие активно делящиеся клетки организма [13]. Оценка так же может производиться и на лимфоцитах человека [2]. В настоящее время микроядерный тест на лимфоцитах с цитокинетическим блоком является единственной тест-системой, использующейся в биомониторинге [19].
Микроядерный тест использовался в качестве изучения мутагенной активности
лекарственного средства на основе тридекапептида [12]. Исследование
обусловлено тем, что в настоящее время препараты на основе регуляторных пептидов весьма популярны. Такие пептиды участвуют в регуляции процессов центральной нервной системы.
В эксперименте [12] учет микроядер после курсового введения тестируемого вещества проводился в ПХЭ и НХЭ периферической крови мышей. Мазки окрашивали ДНК-специфическим красителем акридиновым оранжевым. В исследовании использовались аутбредные мыши, содержащиеся в стандартных условиях. Исследуемый препарат в виде суспензии в 1% растворе крахмала вводили однократно и ежедневно в течение семи дней внутрижелудочно в дозах 1 и 10 мг/кг. Субстанцию циклофосфамида
(противоопухолевый лекарственных препарат) использовали в качестве позитивного контроля и вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг. Полученный уровень НХЭ и ПХЭ в группах негативного контроля находился в пределах нормальных значений, то есть не
превышал 1-2%о. При межгрупповом анализе результатов было выявлено статистически значимое увеличение ПХЭ и НХЭ с микроядрами, а также увеличенное процентное соотношение ПХЭ/НХЭ у животных, которые получали циклофосфамид однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг, по сравнению с группами негативного контроля. Между группами животных, которые получали тестируемое вещество в исследуемых дозах, и группой негативного контроля статистически значимых различий не выявлено. Уровень микроядер у мышей, получавших исследуемый объект, не превышал нормальных значений. Увеличения процентного соотношения ПХЭ и НХЭ и количества микроядер в ПХЭ и НХЭ при введении лекарственного средства на основе тридекапептида в исследуемых дозах не происходило. По результатам эксперимента выявлено отсутствие генотоксического действия исследуемого лекарственного средства, вследствие чего лекарственные препараты на основе тридекапептида являются безопасными [12].
На генотоксичность исследовался противовоспалительный препарат напроксен [21]. Он относится к производным пропионовой кислоты и используется в качестве обезболивающего средства и для уменьшения воспаления при повреждении тканей организма. Лекарственные препараты данного типа составляют подавляющую часть
фармакологических средств, поэтому их проверка на мутагенность имеет важное значение [21]. Для проверки напроксена использовали микроядерный тест и тест ДНК-комет. Учет микроядер проводился в клетках костного мозга крыс. Препарат вводили перорально в дозах 38,91 и 65,78 мг/кг в течение 14 дней. Микроядерный тест выявил повышенный уровень микроядер в эритроцитах животных. Метод ДНК-комет также показал значительное увеличение повреждений генетического материала. Следовательно, данный препарат обнаруживает
генотоксические свойства, поэтому его использование в качестве лекарственного средства должно быть ограничено.
Проблема защиты генетического аппарата клеток человека остро стоит в онкологии, так как основная часть противоопухолевых препаратов - это классические мутагены [13]. К ним, например, относится циклофосфан (ЦФ), паклитаксел, цисплатин. Повреждающее
действие этих препаратов связывают со способностью индуцировать образование активных форм кислорода, а также продуктов перекисного окисления липидов [13].
В работе [13] проводилась проверка генотоксических свойств паклитаксела методом микроядер в клетках периферической крови мышей линии СВА/СаLa, (табл. 1). По результатам исследования выяснено, что и у самцов, и у самок мышей количество микроядер значимо превышало контрольные значения, начиная с 6 часов после введения паклитаксела в дозе 40 мг/кг.
Таблица 1
Количество эритроцитов с микроядрами в периферической крови (%о) у мышей, получивших паклитаксел в МПД 40 мг/кг внутрибрюшинно (по результатам научной
Примечание: сравнение полученных данных с соответствующими значениями у контрольной группы животных, Р<0,05 - *; Р<0,01 - **; сравнение полученных данных в группе мышей самцов с соответствующими значениями группы мышей самок Р<0,05 - $; Р<0,01 - $$.
Кроме этого у самок и самцов мышей выявлены эритроциты с "крупными" микроядрами, что также свидетельствует о геномной патологии.
Авторы делают вывод, что современные противоопухолевые препараты вызывают выраженные генетические повреждения, и, следовательно, необходим поиск новых фармакологических средств, обладающих умеренной мутагенностью.
В настоящее время поиск новых лекарственных соединений активно ведется среди растительного сырья. Несмотря на то, что растительные препараты в лечебной практике имеют многовековую историю, оценка их генотоксичности проведена в ограниченном объеме. При этом для изучения генотоксических свойств чаще всего использовали микробиологические системы [5].
На сегодняшний день экспериментально подтверждена генотоксичность только нескольких групп природных соединений, к ним
относятся аристолохиевые кислоты, пирролизидированные алкалоиды, гидразины и микотоксины [5]. Исследования
фенантроценового алкалоида морфина в диапазоне 5-20 мг/кг показали дозозависимое увеличение выхода микроядер, что говорит о его генотоксичности. Алкалоид той же группы -кодеин не влияет на выход микроядер в клетках крови мышей при однократном и пятидневном введении в дозе 26 мг/кг [5]. Алкилирующие соединения вызывают различные
биохимические изменения в клетке, при этом образуются активные метаболиты и АФК, которые и являются причиной различных генетических повреждений, обуславливая этим мутагенный эффект [13].
Бразильскими учеными были исследованы генотоксические свойства ядовитого дерева Handroanthus impetiginosus (муравьиное дерево), кора которого использовалась в народной медицине как наружное средство при лечении заболеваний кожи и при перроральном использовании для лечения некоторых воспалительных заболеваний. В эксперименте оценивалась частота микроядер в эритроцитах костного мозга мышей. По результатам исследования был сделан вывод об отсутствии генотоксичности при дозах 0,5-2 г/кг [26].
Корейские ученые исследовали мутагенные свойства известного травяного сбора Gyejibokryeong-hwan, состоящей из пяти лекарственных трав [28]: Cinnamomum cassia, Poria cocos, Oaeonia lactiflora, Paeonia suffruticosa и Prunus persica. Gyejibokryeong-hwan, который использовался для лечения заболеваний почек. Кроме того, имеются научно подтвержденные данные о том, что данный сбор проявляет биологическую и фармакологическую активность против воспаления, сердечнососудистых заболеваний, диабета, диабетической нефропатии, мозговых ишемий и различных видов рака. Однако генотоксичность была еще не изучена. Исследование проводилось с помощью нескольких тестов: тест на хромосомные аберрации in vitro с использованием клеток легкого китайского хомячка, тест Эймса с Salmonella typhimurium и Escherichia colistraus и in vivo с использованием костного мозга мыши. Результаты исследования были неоднозначны: тесты с бактериальными клетками не выявили генотоксических свойств травяногоа сбора, а микроядерный тест и тест на хромосомные аберрации показали повышенную частоту повреждений ДНК. При этом
статьи [13])
Время Самцы (n=4) Самки (n=5)
Контроль 6 ч 1,18±0,08 1,09±0,11
6 ч 1,85±0,13* 2,87±0,27**
24 ч 2,04±0,26* 3,36±0,25**$
48 ч 2,15±0,10** 2,40±0,22*
5 сут 1,98±0,10* 1,35±0,15
Контроль 14 сут 1,01±0,15 1,29±0,15
14 сут 1,70±0,07* 1,33±0,25
хромосомный анализ показал дозо-зависимое повышение повреждений, а микроядерный тест показал эффект накопления мутаций с течением жизни клеток [28]. Таким образом, данная работа подтверждает важность использования микроядерного теста для обнаружения генотоксических свойств.
Работа Timothy S.Murbach и соавторов [20] посвящена комплексной оценке лекарственного препарата на основе водного экстракта тропического папоротника Polypodium leucotomos, который обладает
фотопротекторными свойствами. Актуальность использования фотозащитных средств обусловлена необходимостью сохранения защитных свойств кожи и предупреждения образования эритемы при долгом воздействии ультрафиолетового излучения. Проверка осуществлялась с помощью теста на индукцию обратных мутаций в бактериальных клетках (штаммы Salmonella typhimurium и Escherichia coli), хромосомных аберраций у млекопитающий in vitro и микроядер в клетках костного мозга мышей in vivo. Ни одна из тест систем не показала генотоксической активности экстракта папоротника. Исходя из результатов исследования, препарат на основе Polypodium leucotomos является безопасным и может быть использован в качестве эффективного лекарственного средства.
Еще одной важной причиной актуальности проверки на генотоксичность большего количества веществ природного происхождения является ухудшение экологической ситуации в местах произрастания растений, которые обладают клинически значимыми свойствами, или неправильное обращение с ними. Так, вследствие неадекватного использования вид Maytenus ilicifolia (эспинейра-санта), произрастающий в Бразилии и использующийся при лечении язв желудка, находится на грани вымирания [22]. В связи с этим возобновился поиск нового вещества, обладающего такой же гастропротекторой активностью и не вызывающего генотоксических эффектов.
Микроядерный тест часто применяется для оценки радиопротекторных свойств
фармакологических агентов, так как защита генетических структур без уменьшения при этом терапевтической активности
лекарственного средства является важным моментом при использовании препарата в клинике. В работе [10] с помощью микроядерного теста проводилось исследование
радиопротектора - дигидрокверцетина (ДКВ) на его способность проявлять защитное действие. Изучалась его лекарственная форма "Диквертин". Лабораторных животных подвергали у-облучению. Исследуемое вещество вводилось животным
внутрибрюшинно за 15-20 мин до облучения, облучение проводилось в дозе 1,5 Гр. Аминоэтилизотиурониум (АЭТ) использовали в качестве позитивного контроля и вводили в аналогичных условиях. Использование АЭТ обусловлено тем, что он является одним из обычно применяемых в исследованиях и наиболее эффективных синтетических радиопротекторов. Результаты исследования показали, что количество клеток с микроядрами гораздо ниже при введении ДКВ, количество повреждений в клетках снижалось на 45% [10].
При оценке длительности защитного действия препарата от ионизирующего излучения изменяли время его введения до облучения. По результатам исследования [10] было выяснено, что наибольший защитный эффект наблюдается при введении ДКВ за 15 минут до облучения в дозе 1 Гр. Эффект незначительно снижался при увеличении времени введения препарата до 1ч до облучения. Значительно ниже защитное действие проявляется при увеличении интервала времени до 24 ч.
Проведение эксперимента с использованием доз 10-100 сГр также показывает защитное действие ДКВ [10]. Величина наблюдаемого защитного эффекта при использовании разных доз приблизительно равна.
Таким образом, на основании полученных данных показан достоверный радиозащитный эффект анализируемого препарата от цитогенетических повреждений в клетках костного мозга мышей при использовании средних и малых доз у-облучения [10].
Микроядерный тест использовался при оценке защитного действия экстракта аврана лекарственного ^гайо1а officinalis) от канцерогенного препарата циклофосфана [17]. Анализ проводили на белых лабораторных мышах. В качестве позитивного контроля был использован циклофосфан, так как он является известным мутагеном и генотоксикантом. Защитное действие экстракта оценивали по изменению частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами по сравнению с позитивным и негативным контролем. При введении экстракта и циклофосфана на 5 сутки у животных
происходило снижение числа клеток с микроядрами. Введение экстракта в дозе 200 мг/кг вызывало уменьшение числа клеток с микроядрами до значений, полученных в негативном контроле (табл 2, 3).
Таблица 2
Изменение частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами у мышей после введения циклофосфана (по результатам научной статьи
Примечание. а Различия с 1 сут и с группой 1(б) достоверны при Р < 0.01.
Таблица 3
Воздействие экстракта аврана лекарственного, введенного в разной дозе, на частоту встречаемости эритроцитов с микроядрами (по
Таким образом, по результатам проведенного исследования, выявлено защитное действие экстракта аврана от генотоксических эффектов циклофосфана. Экстракт проявляет свои протекторные свойства только при введении его в максимальной дозе 200 мг/кг.
Существенной проблемой современной медицины является поиск лекарственных препаратов, подходящих для лечения последствий применения ионизирующих излучений, особенно при лучевой терапии. Особое внимание к себе привлекает изучение препаратов на основе белка альфа-фетопротеина, так как он обладает разнообразными лечебными свойствами и специфической функциональной активностью. Так, исследователями УНПЦ РМ показана
эффективность лечения лучевых ожогов кожи препаратом, содержащим рч АФП в доклинических исследованиях. В работе [3] показано, что лечебный препарат с рч АФП способствует более быстрому заживлению лучевого ожога у экспериментальных животных. Важно отметить, что лечение лучевых ожогов представляет
трудноразрешимую задачу, а эффективных лекарственных средств для лечения лучевых поражений кожи, обладающих подтвержденной терапевтической эффективностью в настоящее время нет. Следовательно, проблема создания эффективных средств экстренной профилактики и лечения лучевых ожогов является актуальной, а дальнейшие исследования рч АФП является востребованным.
Оценка мутагенных и канцерогенных свойств рч АФП проводилась с помощью различных тест-систем [1]. По полученным результатам не было выявлено канцерогенных и мутагенных реакций организма в ответ на длительное введение препарата АФП в больших дозах. Но данные об экспериментальных исследованиях генотоксических свойств рч АФП с использованием микроядерного теста в научной литературе ограничены и требуют дополнительных исследований.
Положительный контроль при оценке генотоксических свойств лекарственных средств. В каждом эксперименте необходимо обеспечивать как положительный, так и отрицательный контроль. Постановка отрицательного контроля (на растворитель) -важная составляющая любого исследования. Отрицательный контроль необходим для проверки фоновой частоты мутантов. Этот контроль должен состоять из культур, не подвергавшихся никакой обработке и/или подвергавшихся обработке только
растворителем, используемым для растворения тестируемого соединения. Для проверки правильности постановки эксперимента необходимы также два отдельных позитивных контроля, один из которых требует метаболической активации. Предпочтительнее использовать положительный контроль с известным характером зависимости доза - ответ, что позволяет в каждом эксперименте оценивать чувствительность теста. Часто в качестве положительного контроля используют ионизирующее излучение [9].
Известно, что микроядерный тест очень востребован при исследовании радиационного
1171
Группа мышей Через 1 сут Через 5 сут
1 (введение воды, негативный контроль) 1.812±0.116 0.25±0.1118а
2 (введение ЦФ 20 мг/кг, позитивный контроль) 3.3180±0.2309б 3.2850±0.1917б
результатам научной статьи [17])
Группа Через 1 сут Через 5 сут
мышеи
1 (вода) 1,812±0,116 0,250±0,112а
2 (ЦФ) 3,318±0,231б 3,850±0,192б
3 (ЦФ + АЛ, 3,303±0,515б 2,302±0,415б в
50 мг/кг)
4 (ЦФ + АЛ, 2,708±0,084б в 2,303±0,372б г
100 мг/кг)
5 (ЦФ + АЛ, 2,020±0,113г 0,825±0,275а
200 мг/кг)
Примечание. Достоверность различий: а с 1 сут при Р < 0.01, б с группой 1 при Р < 0.01, в, г с группой 2 при Р < 0.05 и Р < 0.01 соответственно.
воздействия. Это связано с тем, что ионизирующее излучение особенно сильно индуцирует образование микроядер при его воздействии на геном [18]. Система кроветворения представляет собой наиболее радиочувствительную мишень. По результатам экспериментов выяснено, что при разных дозах облучения выход микроядер соответствует линейной или линейно-квадратичной модели. Например, при изучении зависимости выхода микроядер в эритроцитах костного мозга мышей при воздействии острого облучения в малых дозах (от 5 до 50 сГр) была получена зависимость доза - эффект, представленная на рисунке 5 [4]. Как видно, частота клеток с микроядрами постепенно нарастает с дозой ионизирующего воздействия.
4
^ з
я
£ 2 О
<Т> * <
о
О 5 10 20 35 40 50
Доча, сГр
Рис. 5. Дозовая зависимость выхода ПХЭ с микроядрами в костном мозге мышей при у-облучении in vivo [4]
В работе [9] проведена оценка частоты эритроцитов с микроядрами в костном мозге мышей, подвергшихся острому внешнему у-облучению в дозе 2 Гр после воздействия ЭМП РЧ с различной поляризацией. По результатам эксперимента [9] отмечено, что общее внешнее у-облучение приводит к увеличению частоты ПХЭ и НХЭ с микроядрами относительно необлученного контроля.
Таким образом, микроядерный тест является чувствительным методом оценки
генотоксического при воздействии
ионизирующих излучений в широком диапазоне доз [4, 9, 18].
Заключение. Актуальность развития генетической токсикологии обусловлена тем, что в среде обитания человека существует достаточно большое количество веществ различной природы, которые требуют оценки на наличие мутагенных свойств. Оценка на генотоксичность должна быть комплексной и включать в себя тесты как in vitro, так и in vivo.
Наиболее часто используемым тестом in vivo, является подсчет микроядер в эритроцитах
костного мозга мышей [5, 13, 20, 22, 26, 28]. Микроядерный тест является востребованной тест-системой при оценке генотоксических свойств лекарственных препаратов, в связи с тем, что это наиболее точный, надежный и информативный метод [8]. Так как исследование проводится in vivo, то экстраполяция данных на человека при оценке безопасности вещества является более надежной. Важным преимуществом является и то, что кадровые, временные и экономические затраты при постановке микроядерного теста минимальны. Применение микроядерного теста в комплексе с другими тест-системами при оценке генотоксических свойств соединений различной природы увеличивает точность проверки и снижает риск получения ложных результатов. Микроядерный тест проявляет себя как чувствительный метод оценки радиационного воздействия [4, 9, 18], а частота клеток с микроядрами возрастает при увеличении дозы ионизирующего излучения. Эта зависимость может носить как линейный, так и линейно-квадратичный характер.
Результаты зарубежных и отечественных исследований показывают, что часть применяемых в настоящее время лекарственных препаратов обладает генотоксическими свойствами, поэтому их использование должно быть ограничено. К таким препаратам относится напроксен [20], применяющийся в качестве обезболивающего и для уменьшения воспалительных процессов, а также современные противоопухолевые препараты, такие как циклофосфан (ЦФ), паклитаксел, цисплатин [13]. По данным проверки на мутагенность и канцерогенность безопасность показывают лекарственные средства на основе тридекапептида, что является важным в связи с ростом актуальности применения пептидных препаратов [12].
Так как при поиске новых соединений, способных обеспечить защиту генома, важно учитывать безвредность применяемого вещества, пользу могут принести препараты растительного происхождения. Среди природных веществ генотоксичность обнаруживают аристолохиевые кислоты, пирролизидированные алкалоиды, гидразины и микотоксины [5]. Например, морфин вызывает дозозависимое увеличение выхода микроядер. Исключение составляет алкалоид кодеин, который не влияет на образование микроядер и
появление повреждений структуры ДНК в клетках крови мышей [5].
Анализ травяного сбора Gyejibokryeong-hwan на мутагенные свойства проводился с помощью нескольких тест-систем, которые показали различные результаты. Микроядерный тест выявил эффект накопления мутаций с течением жизни клеток, а при использовании теста Эймса генотоксических свойств обнаружено не было [28].
Генотоксичность не проявляет НапёгоапШш impetiginosus (муравьиное дерево) [26], использующееся в народной медицине при заболеваниях кожи и для лечения некоторых воспалительных заболеваний, и лекарственный препарат на основе водного экстракта тропического папоротника Ро1уроёшт 1eucotomos, который обладает фотозащитными свойствами [20]. Не вызывает мутагенных и канцерогенных эффектов вид Мау^пш ШаАэНа
(эспинейра-санта), имеющий
гастропротекторную активность [22].
Защита генетических структур клетки требует проверки протекторных свойств фармакологических агентов. По результатам исследований [10] радиозащитным эффектом обладает лекарственная форма радиопротектора дигидрокверцетина (ДКВ) - Диквертин. Анализ защитного действия экстракта аврана лекарственного от канцерогена циклофосфана показал снижение клеток с микроядрами, что говорит о хороших защитных свойствах исследованного растительного препарата [17].
Оценка мутагенных и канцерогенных свойств рч АФП, обусловленная его активными заживляющими свойствами при лучевых ожогах, не обнаружила данных эффектов, но препаратам на основе этого белка необходима дальнейшая проверка, в том числе с помощью микроядерного теста [1, 3].
Список литературы
1. Альфа-фетопротеин /В.А. Черешнев [и др.]. - Екатеринбург: УрО РАН, 2004. - 376 с.
2. Ахмадуллина Ю.Р. Радиочувствительность Т-лимфоцитов у потомков, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию /Ю.Р. Ахмадуллина, А.В. Аклеев // Современные проблемы науки и образования. - 2013. -№6.
3. Влияние липосомального препарата, содержащего белки альфа-фетопротеин и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, на патогенез лучевого ожога кожи у мышей /Г.А. Тряпицына [и др.] //Радиационная биология. - 2018. - №3. - С. 251-261.
4. Дестабилизация генома при действии ионизирующей радиации и острой кровопотери /В.Л. Кожура [и др.] // Общая реаниматология. - 2007. - №3. - С. 5-11.
5. Дурнев А.Д. Генотоксикология соединений растительного происхождения / А.Д. Дурнев, А.С. Лапицкая // Экологическая генетика. - 2012. - №3. - С. 41-52.
6. Ингель Ф.И. Модификация мутагенных эффектов при сочетанном действии факторов окружающей среды: дис. д-ра биол. наук / Ф.И. Ингель. - Москва, 1999. - 222 с.
7. Использование цитогенетической дозиметрии для обеспечения готовности и реагирования при радиационных аварийных ситуациях //Международное агентство по атомной энергетике. - 2014. - №23. - С. 23 7.
8. Колмакова Т.С. Использование микроядерного теста для оценки эффективности лечения аллергии у детей: метод. рекомендации /Т.С. Колмакова. -Ростовн/Д: Изд-воРостГМУ, 2013. - 31 с.
9. Коломиец И.А. Адаптивные реакции клеток крови млекопитающих на воздействие электромагнитных полей радиочастотного диапазона: автореф, дис. канд. биол. наук /И.А. Коломиец - Челябинск, 2009. - 22 с.
10. Кондакова Н.В. Противолучевые свойства лекарственного средства "диквертин" по микроядерному тесту in vivo при умеренных и малых дозах ионизирующей радиации /Н.В. Кондакова [и др.] //Вопр. биол., мед. и фармац. химии. -2002. - С. 46-49.
11. Метилирование ДНК - универсальный механизм регуляции генов /А.А. Пендина [и др.] // Экологическая генетика. -2004. - №1. - С. 27-37.
12. Мутагенные свойства лекарственного средства на основе тридекапептида в тесте Эймса и в тесте по учету микроядер в эритроцитах крови мышей / А.Х. Шараф [и др.] // Вопросы экспериментальной биологии и медицины. -2018. - №8. - С. 38-44.
13. Неупокоева О.В. Влияние тиофана и экстракта трансформированных корней шлемника байкальского на индуцированный мутагенез: дис. канд. биол. наук / О.В. Неупокоева. - Томск, 2015. - 139 с.
14. Оганесян Г.Г. Методы и проблемы генетической токсикологии /Г.Г. Оганесян //Биология. - 2009. - С. 3-9.
15. Оценка генотоксического и цитотоксического действия известных мутагенов (этилметансульфоната, митомицина C и циклофосфамида) с помощью микроядерного теста на лимфоцитах и ретикулоцитах крови человека и белой крысы /Н.В. Томилин [и др.] //Клиническая токсикология. - 2017. - №18. - С. 90-101
16. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ // Всемирная организация здравоохранения. - Женева, 1989. - 198 с.
17. Хахулина Н.Н. Микроядерный тест в оценке антимутагенной активности лекарственных средств /Н.Н. Хахулина, М.Н. Курчатова //Бюллетень медицинских Интернет-конференций. - 2014. - №5. - С. 786-786.
18. Цитогенетические показатели соматического мутагенеза млекопитающих в условиях хронического низкодозового облучения / С.А. Костенко [и др.] //Радиоэкология. - 2015. - №1. - С. 35-42.
19. Юркин А.Ю. Методические особенности анализа микроядер в клетках человека и животных при скрининге и мониторинге кластогенных факторов в окружающей среде: дис. канд. мед. наук /А.Ю. Юркин. - Томск, 2003. - 184 с.
20. A comprehensive toxicological safety assessment of anaqueous extract of Polypodium leucotomos (Fernblock®) / Timothy S. Murbach [et al.] //Food and Chemical Toxicology. - 2015. - Vol. 86. - P. 328-341.
21. Evaluation of naproxen-induced oxidative stress, hepatotoxicity and in-vivo genotoxicity in male Wistar rats /M.H. Ahmad [et al.] // J. of Pharmaceutical Analysis. - 2018. - Vol. 8. - P. 400-406.
22. Genotoxicity of the medicinal plant Maytenus robusta in mammalian cells in vivo / T.M. Raymundo [et al.] // Genet. Mol. Res. - 2012. - Vol. 11, №3. - P. 2847-2854.
23. In vivo rodent erythrocyte micronucleus assay /M. Hayashi [et al.] //Mutat Res. - 1994. - Vol. 312, №3. - P. 293-304.
24. McClintock B. The behaviour in successive nuclear divisions of a chromosome broken at meiosis / B. McClintock // Proc. Natl. acad. Sci. USA. - 1939. - Vol. 25. - P. 405-416.
25. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells / M. Fenech [et al.] //Mutagenesis. - 2011. - Vol. 26, №1. - P. 125-132.
26. Reduction of doxorubicin-induced genotoxicity by Handroanthus impetiginosus in mouse bone marrow revealed by micronucleus assay /M.F.G. Boriollo [et al.] //Biol. - 2018. - Vol. 78, №1. - P. 1-12.
27. Schmid W. Chemical mutagen testing on in vivo somatic mammalian cells / W. Schmid //Agents and Actions. - 1973. - Vol. 3, №2. - P. 77-85.
28. The genotoxicity of an aqueous extract of Gyejibokryeong-hwan / Mee -Young Lee [et al.] // BMC Complementary and Alternative Medicine. - 2018. - Vol. 18, №21. - P. 2-9.
APPLICATION OF MICRONUCLEUS TEST FOR EVALUATION OF GENOTOXIC
PROPERTIES OF DRUGS*
ZVEREVA D.E.
Chelyabinsk State University, Chelyabinsk, Russia e-mail: [email protected]
Abstract
The relevance of development of a genetic toxicology is bound to production of a large number of new substances, which become an integral part of the habitat of the person and demand check on existence the genotoxic of properties. First of all foodstuff and pharmaceuticals are exposed to check. Such check has to be complex and include the test of a system both in vitro, and in vivo. According to literature, the most widespread in vivo test that is used in preclinical researches of drugs account is of micronucleus in cells of marrow of rodents. Because searching of substances belongs to one of important tasks at synthesis of new drugs, which help to improve a condition of cancer patients after radiation therapy the attention of researchers is drawn more and more protein by an alpha-fetoprotein. AFP has specific activity and a number of the useful properties and promotes faster healing of radiation burns therefore further researches of drugs based on protein of an alpha-fetoprotein are perspective. It should be noted that this the test system is very sensing and at assessment of genotoxic action of the ionizing radiation in the wide range of doses. Domestic scientific literature contains a small amount of researches of genotoxicity micronucleus test. These data demand systematizations of knowledge and generalization of material. In work it is shown that micronucleus test is reliable, reproduced and rather prime performed by. In work researches of drugs are considered by method of micronucleus test, mechanisms of formation of micronucleus are given, method merits and demerits.
Keywords: alfa-fetoprotein, micronucleus test, micronuclei, genotoxic activity, medicines, ionizing radiation.
* Научный руководитель: к.б.н., доц. Ахмадуллина Ю.Р.
