CC BY
12УДК 615.917:[667.274.3:661.8].07
Л.П.Сычева, С.М.Шереметьева, В.В.Юрченко, Е.К.Кривцова, В.С.Журков, Е.Н.Головач*, Е.Е.Полякова, О.О.Синицына
АНАЛИЗ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОФЛАВИНА АЦЕТАТА И ПРОДУКТОВ ЕГО ФОТОДЕСТРУКЦИИ В ПОЛИОРГАННОМ МИКРОЯДЕРНОМ ТЕСТЕ НА КРЫСАХ
ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН, Москва
Проведена оценка цитогенетической и цитотоксической активности профлавина ацетата (0,25, 0,05, 0,01 мк/кг) и продуктов его фотодеструкции (0,05, 0,01 мк/кг) в полиорганном микроядерном тесте (костный мозг, эпителиальные клетки мочевого пузыря и толстой кишки) в субхроническом эксперименте на крысах при внутрижелудоч-ном воздействии. Установлено, что профлавина ацетат и продукты его фотодеструкции не обладают цитогенетической активностью в исследованных дозах. Пороговая доза цитотоксического действия необлученного профлавина ацетата — 0,05 мг/кг. После фотодеструкции сенсибилизатор не вызывал цитотоксических эффектов.
Ключевые слова: профлавин ацетат, фотосенсибилизатор, фотодеструкция, цитогенетическая и цитотоксиче-ская активность, полиорганный микроядерный тест.
Введение. Профлавин (3,6-диаминоакридин), действуя как интеркалирующий агент, индуцирует генные мутации в тесте Эймса на штаммах S. typhimurium, регистрирующих мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 1537, ТА 1538, ТА 97, ТА 98) [3, 5, 8]. В культурах клеток млекопитающих и человека in vitro профлавин повышал частоту генных мутаций [2, 7], хромосомных аберраций [4], сестринских хроматидных обменов [11]. Сходными мутагенными свойствами в тестах на микроорганизмах и культурах клеток млекопитающих обладает профлавин сульфат [1, 6, 11].
Результаты анализа канцерогенной активности профлавина моногидрохлорида в опытах на мышах (200 и 400 мг на кг корма, затравка 104 недели) и крысах (300 и 600 мг на кг корма, затравка 109 недель) экспертами МАИР оценены как неадекватные [8]. В опытах на мышах проф-лавин при однократном внутривенном введении в дозе 6 мг/кг не повышал уровень аберраций хромосом и сестринских хроматидных обменов в клетках костного мозга [12]. Авторы рекомендовали провести оценку мутагенной активности профлавина на других клеточных системах млекопитающих.
После облучения видимым светом продукты фотодеструкции профлавина обладают выраженной мутагенной активностью в тест-системах in vitro [9, 10]. Отмечено различие механизмов мутагенного действия профлавина и продуктов его фотодеструкции. Если профлавин действовал как интералкилирующий агент, то
* Фрагмент диссертационной работы
после облучения его видимым светом нарушения ДНК были сходны с таковыми для свобод-норадикальных продуктов и мутагенный эффект был выявлен на штамме ТА 1535 [9].
В настоящее время рассматривается вопрос использования профлавина ацетата для фотодинамического обеззараживания воды. Приведенные выше данные указывают на необходимость оценки мутагенной активности профлавина и продуктов его фотодеструкции в клетках разных органов млекопитающих. В качестве тест-системы был выбран полиорганный микроядерный тест на крысах, позволяющий изучить цитогенетическую активность вещества в клетках разных органов [15].
Цель работы — оценка цитогенетической активности профлавина ацетата и продуктов его фотодеструкции в полиорганном микроядерном тесте в субхроническом эксперменте на крысах при внутрижелудочном воздействии.
Материал и методы исследований. Эксперименты проведены на самцах белых неинбред-ных крыс с начальной массой 250—300 г. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и корму. В каждой экспериментальной группе было по 6 особей.
Профлавин ацетат синтезирован в ФГУП «ГНЦ «НИОПИК».**
Исследовалась цитогенетическая активность самого вещества и продуктов его фотодеструкции. Растворы препарата готовили на питьевой воде «Ваше здоровье», не подвергавшейся хло-
** Авторы благодарят с.н.с., к.х.н. В.И.Алексееву и с.н.с., к.х.н. Л.Е.Маринину за предоставление профлавина ацетата
рированию и не содержащей ГСС. Для получения продуктов фотодеструкции растворы препарата помещали в термостатированный сосуд объемом 0,5 л и облучали видимым светом с помощью галогеновой лампы. В процессе облучения через раствор непрерывно барбатирова-ли воздух с целью перемешивания и насыщения кислородом. Длительность облучения составила 3 мин. При этом доля распавшегося препарата составила 20%.
Растворы профлавина ацетата до облучения в дозах 0,01, 0,05 и 0,25 мг/кг, и после облучения в дозах 0,01 и 0,05 мг/кг вводили внутрижелудоч-но 5 дней в неделю в течение 30 суток. Препараты клеток костного мозга, эпителиальных клеток толстой кишки и мочевого пузыря готовили в соответствии с методическими рекомендациями [13].
Цитогенетический анализ проводили на зашифрованных препаратах. В препаратах костного мозга подсчитывали число полихромато-фильных эритроцитов с микроядрами на 1000 полихроматофильных эритроцитов и долю по-лихроматофильных эритроцитов на 200 эритроцитов. В препаратах мочевого пузыря учитывали на 1000 эпителиальных клеток число клеток с микроядрами, протрузиями, атипичной формой ядра, перетяжкой ядра и двуядерных клеток. В препаратах толстой кишки учитывали на 1000 эпителиальных клеток число клеток с микроядрами и протрузиями.
Критерии учета аномалий ядра приведены в методических рекомендациях [14]. К показателям цитогенетического эффекта относятся клетки с микроядрами и с протрузиями. Микроядра — небольшие округлые с четким контуром ДНК-содержащие образования в цитоплазме клеток за пределами ядра. Протрузии — шаровидные, нитевидные или иной формы ядерные структуры в цитоплазме, четко ограниченные от ядра и соединяющиеся с ним перемычкой. К ци-тотоксическим показателям относятся: двуядер-ные клетки, клетки с перетяжкой ядра (клетки с
бороздкой, перетягивающей ядро), клетки с ядром атипичной формы.
Сравнение долей клеток с нарушениями в опытной группе с контрольной проводили по Манн-Уитни. Для оценки связи доли клеток с нарушениями и дозы красителя использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмена
Результаты и обсуждение. Костный мозг. Средняя доля полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в группах животных, получавших необлученный профлавин ацетат (колебания от 1,67 от 2,67%о), и в группах животных, получавших препарат после фотоактивации (колебания от 1,67 до 3,00%), не отличалась от таковой в контрольной группе 2,16±0,87%. Не выявлено влияния красителя при всех испытанных дозах и вариантах на долю полихромато-фильных эритроцитов от общего числа эритроцитов.
Толстая кишка. Результаты анализа представлены в табл. 1. В группах животных, получавших раствор необлученного и облученного профла-вина ацетата, средняя доля клеток с микроядрами и с протрузиями не отличалась от таковых в контрольной группе.
Мочевой пузырь. Результаты анализа эпителиальных клеток мочевого пузыря крыс представлены в табл. 2. Доля клеток с микроядрами и с протрузиями в мочевом пузыре крыс при действии всех доз необлученного красителя и продуктов его фотодеструкции не отличалась статистически значимо от контроля.
Показано возрастание доли клеток с перетяжкой ядра с увеличением дозы профлави-на ацетата без облучения ^ = 0,404, ёГ = 22, Р = 0,05). Пороговая доза необлученного препарата — 0,25 мг/кг. Средняя доля двуядерных клеток в группах животных, получавших необлучен-ный профлавин ацетат, была в 2 раза выше, чем в контроле. Однако достоверное различие показателя с контролем выявлено для групп животных, получавших препарат в дозах 0,05 и 0,25 мг/
Таблица 1
Цитогенетические показатели в эпителиальных клетках толстой кишки крыс при действии профлавина ацетата
Доза препарата, мг/кг Средняя доля клеток с нарушениями, %с
микроядра протрузии
Контроль 1,83+0,87 1,33+0,49
Профлавин ацетат
0,01 1,50+0,81 0,33+0,33
0,05 0,50+0,22 0,50+0,50
0,25 1,67+0,42 0,83+0,48
Профлавин ацетат после облучения видимым светом
0,01 0,67+0,42 0,83+0,54
0,05 1,33+0,33 1,33+0,67
Таблица 2
Цитогенетические и кариологические показатели в клетках мочевого пузыря крыс при действии
профлавина ацетата
Доза профлавина ацетата, мг/кг Средняя доля клеток с нарушениями, %
микроядра протрузии двуядерные клетки перетяжка ядра атипичная форма ядра
Контроль 0,33+0,21 2,50+0,62 17,67+4,36 32,00+6,40 26,17+3,88
Профлавин ацетат
0,01 0,17+0,17 1,00+0,45 37,17+13,94 46,67+10,65 32,67+7,45
0,05 0,50+0,34 2,17+0,48 34,67+5,12* 53,17+10,95 21,67+6,89
0,25 0,17+0,17 1,00+0,45 36,50+4,45* 58,17+6,95* 13,17+2,77
Профлавин ацетат после облучения видимым светом
0,01 0,00 0,67+0,33 26,00+10,78 44,50+11,32 23,67+4,40
0,05 0,17+0,17 1,67+0,88 28,33+11,70 29,33+9,02 22,00+8,27
Примечание. * — значимое различие с контролем по Манн-Уитни, р < 0,05
кг. Из-за большого колебания показателя у животных при дозе препарата 0,01 мг/кг, различие средней доли двуядерных клеток с контролем было не значимым. Не выявлено достоверного возрастания средней доли клеток с атипичной формой ядра с увеличением дозы необлученно-го препарата.
В группах животных, получавших профлавин ацетат после облучения видимым светом, частоты клеток мочевого пузыря с ядерной перетяжкой, с атипичной формой ядра и двуядерных клеток не отличались от таковых в контрольной группе.
В субхроническом эксперименте при перо-ральном введении крысам профлавин ацетат без облучения (дозы 0,01, 0,05 и 0,25 мг/кг) и после фотоактивации (дозы 0,01 и 0,05 мг/кг) не индуцировал цитогенетических нарушений в клетках костного мозга, эпителиальных клетках толстой кишки и мочевого пузыря. Максимальная доза красителя была примерно в 1000 раз ниже ниже DL50 для крыс при внутрижелудочном введении. Эти дозы не влияли на долю полихроматофиль-ных эритроцитов в костном мозге.
В то же время не облученный профлафин ацетат в мочевом пузыре повышал частоту клеток с перетяжкой ядра и двуядерных клеток. Эти изменения в клетках оцениваются как показатели цитотоксичности [14]. Пороговая доза профлавина ацетата — 0,05 мг/кг. После фотоактивации профлавин ацетат в дозах 0,01 и 0,05 мг/кг не влиял на уровень изученных показателей клеток мочевого пузыря крыс.
Заключение. Таким образом, в полиорганном микроядерном тесте в субхроническом эксперименте на крысах профлавин ацетат в изученном диапазоне доз не индуцировал цитогенетиче-ских нарушений в клетках костного мозга, толстого кишечника и мочевого пузыря. Фотоактивация препарата также не влияла на уровень ци-тогенетических показателей в клетках этих органов. Наши данные согласуются с результата-
ми работы, в которой показано отсутствие цитогенетической активности профлавина в клетках костного мозга мышей при однократном внутривенном введении в дозе 6 мг/кг [12].
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы
Список литературы
1. Brown J.P., Brown R.J. Mutagenesis by 9,10-an-thrachinone derivatives and related compounds in Salmonella typhimurium//Mutation Res., 1976. - V. 40.
- P. 203-224.
2. Clive D, McCuen R, Spector J.F.S. et al. Specific gene mutation in L5178Y cells in culture: A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program //Mutation Res., 1983. - V. 115. - P. 225-251.
3. Fukunaga M., Mizuguchi Y., Yielding L.W. The effects of metabolic activation on the mutagenicity of aminoacridines// Chem. Pharm. Bull., 1987. - V. 35.
- № 2. - P. 792-797.
4. Ishidate Jr M., Harnois M.C., Sofuni T. A comparative analysis of data on the clastogenicity of 951 chemical substances tested in mammalian cell cultures //Mutation Res., 1988. - V. 195. - P. 151-213.
5. Kier L.D., Brusick D.J., Auletta A.E. et al. The Salmonella typhimurium/mammalian microsomal assay: A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-ToxPrograme//Mutation Res., 1986. -V. 168. - P. 69-240.
6. Nishi Y., Hasegava M.M., Taketomi M. et al. Comparison of 6-thioguanine-resistant mutation and sister-chromatid exchanges in Chinese hamster V-79 cells with forty chemical and physical agents // Cancer Res., 1984. - V. 44. - № 8. - P. 3270-3279.
7. Oberly T.J., Michaelis K.C., Rexroat M.A. et al. A comparison of the CHO/HGPRT+ and the L5178Y/ TK+/- mutation assays using suspension treatment and soft agar cloning: results for 10 chemicals // Cell Biol. Toxicol, 1993. - V. 9. - № 3. - P. 243-257.
8. Proflavine, proflavine dihydrochloride, profla-vine hemisulfate, proflavine monohydrochloride // IARC Monographs on the evaluation of the carcino-
genic risk of chemicals to human. Vol. 24. IARC. Lyon, 1980. — P. 195-209.
9. Speck W.T., Rosenkranz. H.S. Proflavin: an unusual mutagen //Mutation Res., 1980. — V. 77. — №
1. — P. 37-43.
10. Speit G., Vogel W. The effect on sister-chro-matid exchanges of drug and dyes by intercalation and photoreactivation // Mutation Res., 1979. — V. 59. — № 2. — P. 223-229.
11. Tucker J.D., Auletta A.E., Cimino M.S. et al. Sister-chromatid exchange: Second report of the Gene-Tox Programe//Mutation Res., 1993. — V. 297. — №
2. — P. 101-186.
12. YoshifUmi Nakanishi, Schneider E.L. In vivo sister-chromatid exchange: a sensitive measure of DNA damage//Mutation Res., 1979. — V. 60. — № 3. — P. 329-337.
13. Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом. Методические рекомендации. — М.: Межведомственный научный совет по экологии человека и гигиене окружающей среды, 2001. — 22 с.
14. Оценка цитологического и цитогенетиче-ского статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека. Методические рекомендации. — М.: Межведомственный научный совет по экологии человека и гигиене окружающей среды, 2005. — 37с.
15. Сычева Л.П., Журков В.С., Рахманин Ю.А. Новый подход к диагностике мутагенных и канцерогенных факторов окружающей среды // Гигиена и санитария, 2003. — № 6. — С. 87-91.
Материал поступил в редакцию 24.04.06.
L.P.Sychova, S.M.Sheremetyeva, V.V.Yurchenko, Ye.K.Krivtsova, V.S.Zhurkov, Ye.N.Golovach, Ye.Ye.Polyakova, O.O.Sinitsina
ANALYSIS OF CYTOGENETIC ACTIVITY OF PROFLAVINE ACETATE AND PRODUCTS OF ITS PHOTODECOMPOSITION IN A POLYORGANIC MICRONUCLEAR ASSAY ON RATS
A.N.Sysin Research Institute for Human Ecology and Environmental Health, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Cytogenetic and cytotoxic activity of proflavine acetate (0.25, 0.05, 0.01 mk/kg) and products of its photodecomposition (0.05, 0.01 mg/kg) in a polyorganic micronuclear assay (bone marrow, epithelial cells in urinary bladder and large intestine) were assessed in a subchronic experiment on rats at intragastric exposure. It was found out that proflavine acetate and products of its photodecomposition do not have any cytogenetic activity in doses investigated. A cytotoxic activity threshold dose of unirradiated proflavine acetate is 0.05 mg/kg. After photodecomposition the sensitinogen did not induce a cytotoxic effect.
УДК 613.632.4.074
А.В.Биткина, Л.А.Малькова, И.А.Биткин
ОБОСНОВАНИЕ ПДК ЭТИЛТРЕТИЧНОБУТИЛОВОГО ЭФИРА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
Лаборатория промышленной токсикологии, ОАО НИИ «Ярсинтез», Ярославль
Установлено, что этилтретичнобутиловый эфир относится к малоопасным веществам и по параметрам токсичности близок к метилтретичнобутиловому эфиру. Обоснована ПДК этилтретичнобутилового эфира в воздухе рабочей зоны на уровне 300 мг/м3 (максимальная разовая) и 100 мг/м3 (среднесменная).
Ключевые слова: этилтретичнобутиловый эфир, метилтретичнобутиловый эфир, токсикологическая оценка, ПДК в воздухе рабочей зоны.
Введение. Этилтретичнобутиловый эфир (2-этокси-2-метилпропан, ЭТБЭ) относится к классу простых эфиров.
СН3
н3с—с—о—сн2—сн3 сн3
ЭТБЭ широко применяется как высокооктановый компонент автобензинов.
Ближайшим нормированным гомологом ЭТБЭ является метилтретичнобутиловый эфир (2-метил-2-метоксипропан, МТБЭ), ПДК которого для воздуха рабочей зоны — 300/100 мг/м3, 4-ый класс опасности. Имеется также ряд нормированных изомеров ЭТБЭ: 1-метокси-2,2-ди-метилпропан, 2-(1-метилэтокси)пропан и 2-ме-
