CC BY
12УДК 575.55.044
Л.П.Сычева, С.М.Шереметьева, Е.К.Кривцова, В.С.Журков, Е.Н.Головач*, Е.Е.Полякова, О.О.Синицына
ОЦЕНКА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МЕТИЛЕНОВОГО ГОЛУБОГО И ПРОДУКТОВ ЕГО ФОТОДЕСТРУКЦИИ В ПОЛИОРГАННОМ
МИКРОЯДЕРНОМ ТЕСТЕ НА КРЫСАХ
ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН, Москва
Проведена оценка цитогенетической и цитотоксической активности метиленового голубого (0,25, 0,05, 0,01 мг/кг) и продуктов его фотодеструкции (0,05, 0,01 мг/кг) в полиорганном микроядерном тесте (костный мозг, эпителиальные клетки мочевого пузыря и толстой кишки) в хроническом эксперименте на крысах при внутрижелу-дочном воздействии. Установлено, что метиленовый голубой не обладает цитогенетической активностью в исследованных дозах. Пороговая доза цитотоксического действия — 0,05 мг/кг. Продукты фотодеструкции способствуют развитию мутагенных эффектов в эпителиоцитах толстой кишки в дозе 0,05 мг/кг; цитотоксическое действие в эпителиоцитах толстой кишки и мочевого пузыря проявляется в дозах 0,01 мг/кг и выше.
Ключевые слова: метиленовый голубой, фотосенсибилизатор, фотодеструкция, цитогенетическая и цитотоксиче-ская активность, полиорганный микроядерный тест.
Введение. Метиленовый голубой является фотодинамически активным красителем и может быть использован в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамического обеззараживания воды. В основе метода лежит использование тропности к клеткам микроорганизмов красителей, возбуждение которых в присутствии кислорода приводит к образованию синглетного кислорода и кислородсодержащих радикалов, окисляющих биомолекулы и вызывающих гибель микробной клетки по месту локализации вещества [9]. Для определения возможности применения препарата в практике водоподготовки необходимо изучение его токсичности и опасности.
Особое внимание требует оценка мутагенной активности метиленового голубого. В тестах на микроорганизмах показана способность красителя индуцировать мутации [4, 8]. В культурах клеток млекопитающих препарат повышал частоту генных мутаций и сестринских хроматид-ных обменов [6, 7] и не влиял на уровень аберраций хромосом [3]. В ряде работ выявлена мутагенная активность продуктов трансформации метиленового голубого после облучения его видимым светом [1, 5]. При этом отмечено различие механизмов мутагенного действия метиле-нового голубого и продуктов его фотодеструкции. Если метиленовый голубой действовал как интеркалирующий агент, вызывая мутации на штаммах S. typhimurium ТА 97 и ТА 98, то нару-
* Фрагмент диссертационной работы
шения ДНК при обработке красителем после облучения видимым светом были сходны с таковыми для синглетного кислорода, мутагенный эффект был выявлен на штамме ТА 100 [2].
Эти данные указывают на необходимость оценки мутагенной активности метиленового голубого и продуктов его фотоактивации в экспериментах на млекопитающих. В качестве тест-системы выбран полиорганный микроядерный тест на крысах, позволяющий оценить цитоге-нетическую активность вещества в клетках костного мозга, эпителиальных клетках мочевого пузыря и толстой кишки [14]. Цель работы — оценка цитогенетической активности метиленового голубого и продуктов его фотодеструкции в полиорганном микроядерном тесте в хроническом эксперименте на крысах при внутрижелудочном воздействии.
Материал и методы исследований. Эксперименты проведены на самцах белых неинбред-ных крыс массой 260—310 г. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и корму. В каждой экспериментальной группе было по 6 особей.
Метиленовый голубой синтезирован в ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»1. Исследовалась цитогенети-ческая активность самого вещества и продуктов его фотодеструкции. Растворы красителя готовили на питьевой воде «Ваше здоровье», не подвергавшейся хлорированию и не содержащей
1 Авторы благодарят с.н.с., к.х.н. В.И.Алексееву и с.н.с., к.х.н. Л.Е.Маринину за предоставление профлавина ацетата
ГСС. Для получения продуктов фотодеструкции растворы красителя помещали в термостатированный сосуд объемом 0,5 л и облучали видимым светом с помощью галогеновой лампы. В процессе облучения через раствор непрерывно барботировали воздух с целью перемешивания и насыщения кислородом, расходующимся в процессах фотоокисления. Длительность облучения составила 3 ч. При этом доля распавшегося красителя составила 20%.
Растворы красителя в дозах 0,01, 0,05 и 0,25 мг/кг, а также облученного красителя в дозах 0,01 и 0,05 мг/кг вводили 5 дней в неделю внут-рижелудочно в течение 120 суток. Препараты клеток костного мозга, эпителиальных клеток толстой кишки и мочевого пузыря готовили в соответствии с методическими рекомендациями [10].
Цитогенетический анализ проводили на зашифрованных препаратах. В препаратах костного мозга подсчитывали число полихромато-фильных эритроцитов с микроядрами на 1000 полихроматофильных эритроцитов и долю по-лихроматофильных эритроцитов на 200 эритроцитов. В препаратах мочевого пузыря учитывали на 1000 эпителиальных клеток число клеток с микроядрами, протрузиями, атипичной формой ядра, перетяжкой ядра и двуядерных клеток. В препаратах толстой кишки учитывали на 1000 эпителиальных клеток число клеток с микроядрами, протрузиями и кариопикнозом.
Критерии учета аномалий ядра приведены в методических рекомендациях [11]. К показателям цитогенетического эффекта относятся клетки с микроядрами и с протрузиями. Микроядра — небольшие округлые с четким контуром ДНК-содержащие образования в цитоплазме клеток за пределами ядра. Протрузии — шаровидные, нитевидные или иной формы ядер-
ные структуры в цитоплазме, четко ограниченные от ядра и соединяющиеся с ним перемычкой. К цитотоксическим показателям относятся: двуядерные клетки; клетки с перетяжкой ядра (клетки с борозкой, перетягивающей ядро); клетки с ядром атипичной формы, клетки с ка-риопикнозом.
Сравнение долей клеток с нарушениями в опытной группе с контрольной проводили по Манн-Уитни. Для оценки связи доли клеток с нарушениями и дозы красителя использовали Ранговый коэффициент корреляции Спирмена
Результаты и обсуждение. Костный мозг. Средняя доля полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в опытных группах варьировала от 0,67 до 3,83%о и не отличалась от таковой в контрольной группе 2,16±0,87%. Не выявлено влияния красителя при всех испытанных дозах и вариантах на долю полихроматофильных эритроцитов от общего числа эритроцитов.
Толстая кишка. Результаты анализа представлены в табл. 1. В группах животных, получавших раствор необлученного метиленового голубого, средняя доля клеток с микроядрами, с протру-зиями и с кариопикнозом не отличалась от таковых в контрольной группе.
В группах животных, получавших облученный светом краситель, доля клеток с микроядрами не отличалась от контроля. В то же время выявлено статистически значимое увеличение доли клеток с протрузиями в группе животных, получавших облученный краситель в максимальной дозе, как при сравнении с контролем, так и при сравнении с группой животных, получавших соответствующую дозу необлученного препарата. Доля клеток с кариопикнозом при действии исследованных доз облученного красителя была статистически значимо выше, по сравнению с контрольной группой и с группами жи-
Таблица 1
Цитогенетические и кариологические показатели в эпителиальных клетках толстой кишки крыс
при действии метиленового голубого
Доза красителя, мг/кг Средняя доля клеток с нарушениями, %с
микроядра протрузии кариопикноз
Контроль 0,17+0,17 3,17+1,08 16,00+5,28
Метиленовый голубой
0,01 0,33+0,21 2,83+0,40 16,67+11,71
0,05 0,17+0,17 4,17+1,05 7,33+2,82
0,25 0,17+0,17 4,00+1,77 20,17+6,76
Метиленовый голубой после облучения видимым светом
0,01 0,00 6,50+1,65 41,33+5,26*
0,05 0,50+0,34 10,00+1,41* 40,00+8,27*
Примечание. В табл. 1 и 2 * — значимое различие с контролем по Манн-Уитни, р < 0,05
Таблица 2
Цитогенетические и кариологические показатели в клетках мочевого пузыря крыс при действии метиленового голубого
Доза красителя, мг/кг Средняя доля клеток с нарушениями, %
микроядра протрузии двуядерные клетки перетяжка ядра атипичная форма ядра
Контроль 2,17+1,22 7,67+2,52 14,17+2,60 40,67+8,78 38,00+12,55
Метиленовый голубой
0,01 2,67+0,76 8,50+1,38 10,33+2,80 33,83+4,66 35,83+9,38
0,05 3,50+0,76 11,83+2,65 5,17+1,58* 26,83+4,47 49,83+11,49
0,25 3,00+0,63 10,67+1,08 5,83+1,85* 29,00+8,73 47,83+16,15
Метиленовый голубой после облучения видимым светом
0,01 2,17+0,48 7,67+1,38 6,83+1,49* 23,50+6,35 43,83+6,04
0,05 1,50+0,43 9,83+2,49 6,33+2,02* 21,83+7,29 52,33+11,26
вотных, получавших соответствующие дозы не-облученного препарата.
Таким образом, необлученный краситель во всех изученных дозах не выявил значимого изменения цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках толстой кишки. Облученный краситель индуцировал в эпителии толстой кишки значимое повышение доли клеток с про-трузиями (цитогенетический эффект) при дозе 0,05 мг/кг, и доли клеток с кариопикнозом (ци-тотоксический эффект) при минимальной исследованной дозе 0,01 мг/кг.
Мочевой пузырь. Результаты анализа эпителиальных клеток мочевого пузыря крыс представлены в табл. 2. Доля клеток с микроядрами и с протрузиями в мочевом пузыре крыс при действии всех доз необлученного красителя и продуктов его фотодеструкции не отличалась статистически значимо от контроля.
П оказано снижение доли двуядерных клеток с увеличением дозы метиленового голубого как при действии красителя без облучения ^ = -0,573, ёГ = 22, р < 0,01), так и после облучения видимым светом ^ = -0,555, ёГ = 16, р < 0,05). Пороговая доза необлученного красителя — 0,05 мг/кг, облученного красителя — 0,01 мг/кг. Сходные тенденции отмечены и для доли клеток с перетяжкой ядра. Однако из-за большого разброса показателя в группах не выявлено как достоверно значимых отличий показателя от контроля, так и значимой обратной связи доли клеток с перетяжкой ядра у крыс и дозой красителя. Хотя наблюдается увеличение средней доли клеток с атипичной формой ядра с возрастанием дозы необлученного и облученного красителя, из-за большого разброса показателя между животными в группах статистически значимых отличий от контроля не выявлено.
В хроническом эксперименте при перораль-ном введении крысам необлученный метилено-
вый голубой в дозах 0,01, 0,05 и 0,25 мг/кг не индуцировал цитогенетических нарушений в клетках костного мозга, эпителиальных клетках толстой кишки и мочевого пузыря. Максимальная доза красителя была примерно в 4—20 раз ниже терапевтической дозы препарата для человека в день [12]. Эти дозы не влияли на долю по-лихроматофильных эритроцитов в костном мозге, уровень клеток с атипичной формой ядра и с перетяжкой ядра в мочевом пузыре, клеток с ка-риопикнозом в толстой кишке. Отмечено снижение в 2,5 раза по сравнению с контролем доли двуядерных клеток в мочевом пузыре у крыс, получавших краситель в дозах 0,05 и 0,25 мг/кг. В настоящее время критериальная значимость снижения доли двуядерных клеток в эпителии мочевого пузыря не ясна. Можно заключить, что необлученный краситель не индуцирует цитоге-нетических аномалий и значимых кариотокси-ческих нарушений в клетках изученных органов крыс при хроническом внутрижелудочном введении.
После фотоактивации метиленовый голубой в дозах 0,01 и 0,05 мг/кг не влиял на уровень изученных показателей в костном мозге крыс. В мочевом пузыре, также как и при действии не-облученного красителя, отмечено значимое снижение только доли двуядерных клеток по сравнению с контролем. Достоверный эффект выявлен в группе крыс, получавших минимальную дозу красителя 0,01 мг/кг. В эпителии толстого кишечника существенно возрастала доля клеток с протрузиями (минимально-действующая доза 0,05 мг/кг) и доля клеток с кариопикнозом (эффективны все испытанные дозы).
Заключение. Фотоактивация метиленового голубого приводит к образованию соединений, обладающих цитогенетической (индукция про-трузий) и цитотоксической (индукция карио-пикноза) активностью в клетках толстой кишки
крыс. Эти же соединения снижают уровень дву-ядерных клеток в мочевом пузыре в дозе, которая в 5 раз ниже действующей дозы необлучен-ного красителя. Поскольку при облучении разрушалось 20% дозы метиленового голубого, биологическая активность продуктов фотодеструкции даже минимально изученной дозы красителя (0,01 мг/кг) представляется значимой.
Полученные результаты, наряду с данными по изучению цитогенетической активности химических соединений в полиорганном микроядерном тесте на млекопитающих [14], указывают на недостаточность при оценке мутагенного эффекта учета микроядер или аберраций хромосом только в клетках костного мозга млекопитающих. Внедрение полиорганного микроядерного теста позволит повысить эффективность выявления мутагенных соединений, оценить ор-ганоспецифичность их действия, более надежно выявлять минимально-эффективную дозу мутагенов, оценить цитотоксичность изученных соединений.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы.
Список литературы
1. Chung K.-T., Fulk G.F., Andrews A.W. Mutagenicity testing of some commonly used dyes // Appl. Environ. Microbiol., 1981. - V 42. - № 4. - P. 641648.
2. Epe B, Hegler J., Wild D. Identification of ultimate DNA damaging oxygen species//Environ. Health Perspect, 1990. - V 88. - P. 111-115.
3. Ishidate Jr M., Harnois M.C., Sofuni T. A cjm-porative analysis of data on the clastogenicity of 951 chemical substances tested in mammalian cell cultures // Mutation Research, 1988. - V 195 - P. 151-213.
4. Kier L.D., Brusick D.J., Auletta A.E. et al. The Salmonella typhimurium/mammalian microsomal assay: A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Programe // Mutation Research, 1986. - V 168. - P. 69-240.
5. Smijs T.G., Nivard M.J., Schuitmarker H.J. Development of a test system for mutagenicity of pho-
tosensitizers using Drosophila melanogaster // Photo-chem. Photobiol, 2004. -V. 79. - № 4. - P. 332-338.
6. Tucker J.D., Auletta A.E., Cimino M.S. et al. Sister-chromatid exchange: Second report of the Gene-Tox Programe // Mutation Research, 1993. - V. 297.
- № 2. - P. 101-186.
7. Wagner S.J., Cifone M.A., Murli Y. et al. Geno-toxicity assessment of methylene blue in plasma: Implications for virus inactivation // Transfusion, 1995. -V 35. - № 5. - P. 407-413.
8. Webb R.B., Hass B.S. Biological effects of dyes on bacteria. IV. Mutation induction by acridine orange and methylene blue in the dark with the special reference to Esherichia coli WP6 (polA1) // Mutation Research, 1984. - V 137. - № 1. - P. 1-6.
9. Кузнецова Н.А., Калия О.Л. Фотокаталитическая генерация активных форм кислорода в биологических средах в методе фотодинамической терапии // Российский химический журнал, 1998.
- № 5. - С. 36-49.
10. Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом. Методические рекомендации. - М., 2001. - 22 с.
11. Оценка цитологического и цитогенетиче-ского статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека. Методические рекомендации. -М., 2005. - 37с.
12. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Часть II. - 12-ое изд. перераб. и доп. - М.: Медицина, 1993. - С. 473-474.
13. Сычева Л.П. Научное обоснование и разработка системы оценки мутагенного эффекта химических загрязнений окружающей среды у млекопитающих in vivo с учетом органной специфичности // Автореферат дисс... д-ра мед. наук. - М., 2002. - 46 с.
14. Сычева Л.П., Журков В.С., Рахманин Ю.А. Новый подход к диагностике мутагенных и канцерогенных факторов окружающей среды // Гигиена и санитария, 2003. - № 6. - С. 87-91.
Материал поступил в редакцию 24.04.06.
L.P.Sychyova, S.M.Sheremetyeva, Ye.K.Krivtsova, V.S.Zhurkov, Ye.N.Golovach, Ye.Ye.Polyakova,
O.O.Sinitsina
ASSESSMENT OF CYTOGENETIC ACTIVITY OF METHYLENE BLUE AND PRODUCTS OF ITS PHOTO DECOMPOSITION IN A POLYORGANIC MICRONUCLEAR ASSAY ON RATS
State-owned Research Institute of Human Ecology and Environmental Health, Russian Academy of Medical Sciences
It was conducted an assessment of cytogenetic and cytotoxic activity of methylene blue (0.25; 0.05; 0.01 mg/kg and products of its photo decomposition (0.05; 0.01 mg/kg) in polyorganic micronuclear assays (bone marrow, epithelial cells in urinary bladder and large intestine) in a chronic experiment on rats at intragastric exposure. It was found out that methylene blue has no cytogenetic activity at doses investigated. A threshold dose to cytotoxic action is 0.05 mg/kg. Photo decomposition products induce the development of mutageneous effects in epitheliocytes of large intestine at a dose of 0.05 mg/kg; a cytotoxic effect in epitheliocytes of large intestine and urinary bladder appears at doses of 0.01 mg/kg and higher.
