CC BY
9ных условиях появляются на 5—6 день, а в растворах концентрацией 0,12 мл/л — на 9-й день.
4. При хранении растворов в темноте в анаэробных условиях, деградация токсиканта в течение 2-х недель незначительна.
Список литературы
1. Токсикологические методы контроля // Методика определения токсичности воды по смертности и изменению плодовитости дафний. Государственный комитет РФ по охране окружающей среды. М, 1999. - 35 с.
2. Cox C. Glyphosate // Journal of Pesticide Reform, 2004. - V. 24. - №. 4. - P. 11-15.
3. Duke S.O. Glyphosate // In: Kearney P.C.,
Kaufman D.D. (eds) Herbicides: chemistry, degradation and mode of action. Marcel Dekker. New York, 1988. — P. 1-58.
4. Reinert K.H., Rogders J.H. Fate and persistence of aquatic herbicides // Rev Environmental Contamination and Toxicology, 1987. — V. 98. — P. 61-91.
5. Saenz M.E., Di Marzio W.D., Alberdi J.L. et al. Effects of Technical Grade and a Commercial Formulation of Glyphosate on Algal Population Growth // Bull. Environmental Contamination and Toxicology, 1997. — V. 59. — P. 638—644.
Материал поступил в редакцию 22.12.05.
G.A.Papchenkova
INVESTIGATION OF THE DEGRADATION OF ROUNDUP HERBICIDE IN ACUTE EXPERIMENTS ON DAPHNIA MAGNA
I.D.Papanin Institute of Inland Waters Biology, Russian Academy of Sciences, Borok
To investigate the degradation of «Roundup» solutions stored under different conditions, an experiment on survival of Daphnia Magna was conducted in toxicants solutions in the concentration range of 0,008 to 0,50 ml/l. It was revealed that the degradation speed of Roundup solutions depends on storage conditions and concentrations. Stored by the light under aerobic conditions, solutions degrade significantly faster than in the dark under anaerobic conditions. 0' When stored by the light under aerobic conditions, trustworthy significant differences in daphnia death in the range of concentrations of 0.03 to 0.06 ml/l appear by the 5th or 6th day and in solutions of 0.12 ml/l concentration by the 9th day.
УДК [615.916:546.17].015.44
Л.П.Сычева, С.М.Шереметьева*, М.А.Коваленко, М.А.Пинигин, Л.А.Тепикина, В.С.Журков
ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО И ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ДИОКСИДА АЗОТА ПОЛИОРГАННЫМ МИКРОЯДЕРНЫМ МЕТОДОМ
ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН, Москва
Диоксид азота в концентрациях 10,1, 21,1 и 44,93 мг/м3 не оказывал цитогенетического действия на клетки костного мозга, легких и мочевого пузыря крыс при ингаляции в течение 4, 48 или 120 ч. Установлено цитотоксиче-ское действие вещества во всех экспериментальных группах, характеризующееся повышением доли полихромато-фильных эритроцитов, частоты двуядерных клеток и клеток с центральной ядерной перетяжкой в мочевом пузыре и легких крыс.
Ключевые слова: диоксид азота, микроядерный тест, легкие, мочевой пузырь, двуядерные клетки.
Введение. Диоксид азота (М02) является одним из основных загрязнений атмосферного воздуха. Он поступает в окружающую среду с выбросами предприятий черной металлургии, ТЭЦ, и других производств, сжигающих топливо, а также с автомобильным транспортом. Вопрос о мутагенной активности диоксида азота
* Фрагмент диссертационной работы
остается спорным. Мутагенный эффект вещества установлен в бактериальном тесте Эймса, в тестах по выявлению разрывов ДНК и хромосомных аберраций в легких крыс [6], цитогене-тических повреждений в лимфоцитах периферической крови людей при высокой концентрации вещества в воздухе рабочей зоны [9]. Имеются единичные указания на канцерогенный эффект диоксида азота у мышей при хроническом
действии высоких доз [6]. Целью данного исследования является изучение цитогенетическо-го и цитотоксического действия диоксида азота с помощью предложенного нами полиорганного микроядерного метода, включающего классический микроядерный метод на полихрома-тофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга, анализ эффекта в органе мишени — легких и органе выделения — мочевом пузыре [4].
Материал и методы исследования. Эксперимент проведен на самцах белых неинбредных крыс, полученных из питомника Крюково, массой 350—400 г. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Первая группа крыс дышала чистым воздухом и служила контролем. Крысы второй-пятой групп находились в условиях ингаляционного воздействия диоксида азота в специальных 730-литровых камерах. Вторая группа повергалась воздействию вещества в концентрации 44,93 мг/м3 в течение 4 ч, фиксацию органов проводили через 5 суток. Крысы третьей (10,1 мг/м3) и пятой групп (21,1 мг/м3) — круглосуточно в течение двух суток; четвертая группа (10,1 мг/м3) — в течение 5 суток. Фиксацию органов крыс 3—5 групп проводили сразу же после окончания воздействия диоксида азота.
Препараты клеток костного мозга готовили по стандартной методике в нашей модификации. Суспензионные препараты клеток легких и мо-
чевого пузыря получали путем фиксации органов в формалине с последующей щелочной диссоциацией в соответствии с [5]. Микроскопический анализ зашифрованных препаратов проводили при увеличении 1000. Анализировали по 1000 полихроматофильных эритроцитов костного мозга (ПХЭ), клеток легких (пневмоцитов I и II типа и альвеолярных макрофагов суммарно) и эпителиальных клеток мочевого пузыря. В костном мозге для оценки цитотоксичности учитывали долю полихроматофильных эритроцитов от суммы всех эритроцитов при анализе 200 эритроцитов. В легких и мочевом пузыре в качестве показателей цитогенетического действия учитывали клетки с микроядрами и протрузиями, которые представляют собой шаровидные, нитевидные или иной формы ядерные структуры в цитоплазме, четко отграниченные от ядра и соединяющиеся с ним перемычкой. Определяли частоту двуядерных клеток и клеток с центральной ядерной перетяжкой как показателей цито-токсического действия. В мочевом пузыре определяли также долю клеток с атипичной формой ядра.
Для статистической обработки результатов использовали программу STATISTICA for Windows. Показатели в опытных и контрольной группах сравнивали с помощью критерия х2.
Результаты и обсуждение. Показатели цитоге-нетического и цитотоксического эффекта диокси-
Таблица
Цитогенетический и цитотоксический эффект диоксида азота при исследовании клеток костного
мозга, легкого и мочевого пузыря крыс (хср±m)
Показатель Группа животных, концентрация и длительность ингаляции
1 группа контроль 2 группа 44,93 мг/м3, 4 ч 3 группа 10,1 мг/м3, 48 ч 4 группа 21,1 мг/м3, 48 ч 5 группа 10,1 мг/м3, 120 ч
Количество животных 6 6 6 6 7
Костный мозг
Доля клеток с микроядрами, %% 1,16+0,40 0,67+0,21 0,16+0,16 2,0+0,58 1,16+0,48
ПХЭ/все эритроциты 0,48+0,01 0,64+0,03* 0,56+0,01* 0,69+0,04* 0,72+0,04*
Легкие
Доля клеток с микроядрами, %% 0,50+0,34 0,83+0,54 0,50+0,34 0,33+0,21 0,28+0,18
Доля клеток с протрузиями,% 1,00+0,36 1,33+0,33 1,67+0,49 2,33+0,61 1,86+0,51
Доля двуядерных клеток, % 8,17+0,94 10,83+1,14 11,5+1,99 8,00+1,50 13,14+,47*
Доля клеток с ядерной перетяжкой,% 8,17+1,78 10,50+1,73 13,00+4,16* 13,00+2,26* 9,71+1,32
Мочевой пузырь
Доля клеток с микроядрами, % 0,33+0,21 0,33+0,21 0,17+0,17 0,50+0,34 0,14+0,14
Доля клеток с протрузиями,% 1,67+0,67 1,83+0,70 2,00+0,36 2,50+1,06 1,43+0,48
Доля двуядерных клеток, % 3,33+0,80 7,00+2,61* 9,83+2,36* 7,33+2,60* 8,57+2,06*
Доля клеток с ядерной перетяжкой,% 21,67+4,28 23,50+5,09 28,00+2,29* 41,83+15,46* 35,14+9,07*
Доля клеток с атипичной формой ядра, % 80,50+9,35 105,00+14,78* 93,17+16,59* 78,83+8,50 98,43+9,53*
Примечание. * — значимое различие с контролем по критерию х2 (р < 0,05)
да азота в клетках костного мозга, легких и мочевого пузыря представлены в табл. Цитотоксическое действие диоксида азота на клетки костного мозга, легких и мочевого пузыря отражено на рис.
Костный мозг. Частота ПХЭ с микроядрами в среднем в контрольной группе составила 1,16%о; в опытных группах — от 0,16% до 2%. Межгрупповые отличия этих показателей не достоверны. В опытных группах отмечено достоверное увеличение частоты ПХЭ на 17-50% по сравнению с контролем. Корреляционный анализ данных по Спирмену показал сильную высоко достоверную связь этого показателя со временем воздействия (Я = 0,79; & = 60; р < 0,001).
Легкие. Средняя частота клеток легкого с микроядрами в контрольной группе животных составила 0,5%, в опытных группах от 0,28 до 0,83%. Частота клеток с легкого с ядерными протрузиями варьировала в пределах 1,67— 2,33% в опытных группах при 1% в контроле. Отличия показателей в опытных группах от контроля не достоверны. Частота двуядерных клеток статистически значимо увеличилась от 8,17% в контроле до 13,14% в опытной группе при пя-тисуточной ингаляции диоксида азота. Корреляционный анализ показал зависимость этого показателя от длительности воздействия (Я = 0,36; ёГ = 60; р < 0,05). Частота клеток с центральной ядерной перетяжкой достоверно увеличилась через двое суток воздействия до 13,00% по сравнению с 8,17% в контрольной группе.
Мочевой пузырь. Частота эпителиальных кле-250
ток с микроядрами и протрузиями в мочевом пузыре крыс опытных групп варьировала в пределах 0,14—0,5% и 1,43—2,5% и не отличалась от контроля. Отмечено достоверное 2—3-кратное повышение частоты двуядерных клеток во всех опытных группах по сравнению с контролем, частоты клеток с ядерными перетяжками на 29— 93% в 3—5 группах, частоты клеток с атипичной формой ядра на 15—30% (2, 3 и 5 группы).
Исследованные концентрации диоксида азота значительно превышают нормативы этого вещества для атмосферного воздуха. Максимальная разовая и среднесуточная ПДК, принятые в Российской Федерации, составляют 0,085 мг/м3 и 0,04 мг/м3 соответственно [2]. Среднегодовая ПДК в США составляет 0,1 мг/м3. ВОЗ и ЕС рекомендует годовую допустимую концентрацию NO2 в атмосферном воздухе — 0,04 мг/м3. Референтная концентрация для хронического ингаляционного воздействия — 0,04 мг/м3 [1,6]. Следовательно, испытанные концентрации в 100 и более раз превышают рекомендуемые нормативы. При данных условиях эксперимента цито-генетический эффект диоксида азота не выявлен классическим микроядерным методом на клетках костного мозга, а также в органах дыхательной и выделительной системы. Отмеченный некоторыми авторами генотоксический эффект наблюдали при более высоких концентрациях вещества. Диоксид азота вызывал образование однонитевых разрывов ДНК в легких крыс in vivo после 5-часовой ингаляции 94 мг/м3 и 16-ча-
Легкие,
двуядерные
клетки
Легкие, клетки с
центральной
перетяжкой
3
Мочевой пузырь,
двуядерные
клетки
Мочевой пузырь, клетки с центральной перетяжкой
5
Мочевой пузырь, клетки с ядром атипичной формы
6
исследуемые показатели
Рис. Цитотоксическое действие диоксида азота на клетки костного мозга, легких и мочевого пузыря крыс
Ряд 1 - 44,93 мг/м3, 4 ч; Ряд 2 - 10,1 мг/м3, 48 ч; Ряд 3 - 21,1 мг/м3, 48 ч; Ряд 4 - 10,1 мг/м3, 120 ч
совой ингаляции в концентрации 54 мг/м3 [11]. Ьошига К. с соавторами [8] показал повышение частоты мутаций и хромосомных аберраций в клетках легких крыс при действии 50 мг/м3 диоксида азота в течение 3 ч. В то же время двухчасовая ингаляция диоксида азота в концентрации 75 мг/м3 не увеличивала частоту хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови обследуемых [10].
Токсическое действие препарата отмечено нами во всех исследованных органах. Повышение частоты ПХЭ и, соответственно, снижение частоты нормохромных эритроцитов, показано начиная с 4-часовой ингаляции. По данным литературы, снижение содержания эритроцитов и гемоглобина в крови мышей при ингаляции 6—19 мг/м3 М02 наблюдается уже через час после воздействия [1]. По-видимому, высокие концентрации диоксида азота приводят к гибели эритроцитов, что стимулирует эритропоэз и образование ПХЭ. Повышение частоты двуядерных клеток и клеток с центральной ядерной перетяжкой в легких и мочевом пузыре, по-видимому, также связано с токсическим действием вещества. Считают, что образование двуядерных клеток происходит в результате деления ядра без деления цитоплазмы. Можно предположить два механизма, определяющих увеличение частоты двуядерных клеток при токсическом действии вещества. Это может быть прямое или опосредованное повреждающее действие вещества на цитоскелет, приводящее к нарушению цитотомии. В то же время образование двуядерных клеток (клеток с удвоенным геномом) является косвенным показателем усиления пролиферации ткани как компенсаторный ответ на повреждающее действие вещества [3]. Прямые доказательства увеличения пролиферативной активности клеток легкого получены при анализе включения Н3-тимидина в клетки бронхиального эпителия крыс, которое происходит уже через час после воздействия М02 в концентрации 36,7 мг/ м3. В пневмоциты II типа Н3-тимидин включается на 5 сутки после воздействия [7].
С этих позиций можно рассматривать и повышение частоты клеток с центральными ядерными перетяжками. Такие клетки могут быть образованы в результате повреждения веретена деления в процессе митоза, что приводит к нарушению кариотомии, или в результате непрямого деления ядра (амитоза). Отмечена средняя значимая корреляция этого показателя с частотой двуядерных клеток (Я = 0,47; ёГ = 60; р < 0,01).
Среди исследованных клеточных популяций наиболее чувствительными к цитотокси-ческому действию диоксида азота оказались эпителиальные клетки мочевого пузыря (рис.). Почти все показатели, характеризующие ци-
тотоксическое действие, достоверно превышали контрольный уровень, причем, частота двуядерных клеток была в 2—3 раза выше контроля. Диоксид азота, в основном, поступает в организм через верхние дыхательные пути, растворяется в жидкостях легких, что может приводить к образованию NO2- и NO3-, которые захватываются и транспортируются через кровь к другим органам [6]. Считается, что диоксид азота оказывает наиболее выраженное действие на органы дыхания. Однако при действии этого вещества страдают и другие органы. Нефротоксический синдром (повышение альбумина, а-, р- и у-глобулина в моче) отмечен у морских свинок, экспонированных в течение 14 часов к диоксиду азота в концентрации 0,94 мг/м3. Протеинурия выявлена и при более низкой экспозиции — 0,75 мг/м3 в течение 4 часов [6]. Это подтверждает наши данные и свидетельствует о системном токсическом эффекте диоксида азота.
Выводы. 1. Диоксид азота не оказывал цитоге-нетического действия на клетки легких, костного мозга и мочевого пузыря крыс в условиях проведенных исследований.
2. Установлено цитотоксическое действие вещества на животных всех экспериментальных групп, характеризующееся повышением доли полихроматофильных эритроцитов, частоты двуядерных клеток и клеток с центральной ядерной перетяжкой в мочевом пузыре и легких крыс и увеличивающееся в зависимости от длительности воздействия.
Список литературы
1. Вредные вещества в промышленности / Под ред. Н.В.Лазарева и И.Д.Гадаскиной. Л.Химия, 1977. — Т. III. — С. 108-111.
2. Онищенко Г.Г., Новиков С.М., Рахманин Ю.А.и др. Основы оценки риска для здоровья при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду. М, 2002. — C. 347.
3. Рябинина З.А., Бенюш В.А. Полиплоидия и гипертрофия клеток в процессах роста и восстановления. М.: Медицина, 1973. — 207 с.
4. Сычева Л.П., Журков В.С., Рахманин Ю.А. Новый подход к диагностике мутагенных и канцерогенных свойств факторов окружающей среды // Гигиена и санитария, 2003. — № 6. — С. 87-90.
5. Сычева Л.П., Юрченко В.В., Журков В.С. и др. Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом. Методические рекомендации. М.: Межведомственный научный совет по экологии человека и гигиене окружающей среды, 2001. — 21 с.
6. Environmental Health Criteria 188. //Nitrogen oxides 2nd edition. — WHO, Geneva.-1997.-550p.
7. Evans M.J., Dekker N.P., Cabral-Anderson L.J. et al. Quantitation of damage to the alveolar epithelium by means of type 2 cell proliferation // Am Rev Respir Dis., 1978. - V 118. - № 4. - P. 787-790.
8. Isomura K., Chikahira M, Terannishi K. et al. Induction of mutations and chromosome aberrations in lung cells following in vivo exposure of rats to nitrogen oxides//Mutat. Res., 1984. - V. 136. - P. 119-125.
9. Jodinger S, Seth Y., Seth N. Effect of NOx on the somatic chromosomes goldsmiths // Environ Health Perspect, 1998. - V. 106. - № 10. - P. 643-647.
10. Luhr O.R., Frostell C.G., HeywoodR. et al. Induction of chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes after short time inhalation of nitric oxide // Mutatm.Res, 1998. - V. 414. - № 1-3. - P. 107-15.
11. Walles S.A., Victorin K., Lundborg M. DNA damage in lung cells in vivo and in vitro by 1,3-buta-diene and nitrogen dioxide and their photochemical reaction products // Mutat. Res., 1995. - № 328. - P. 11-19.
Материал поступил в редакцию 28.10.05.
L.P.Sychyova, S.M.Sheremetyeva, M.A.Kovalenko, M.A.Pinigin, L.A.Tepikina, V.S.Zhurkov
STUDY OF CYTOGENETIC AND CYTOTOXIC ACTIONS OF NITROGEN DIOXIDE USING A POLYORGANIC MICRONUCLEAR METHOD
A.N.Sysin Research Institute for Human Ecology and Environmental Health, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Nitrogen dioxide in concentrations of 10.1, 21.1 and 44.93 mg/m3 did not produce any cytogenetic effects on medulla, lung, urinary bladder cells in rats at inhalation for 4,48 and 120 hours. A cytotoxic action displayed by the substance was revealed in all the test groups which was characterized by an increased part of polychromatophilic erythrocytes, formation frequency of two-nuclear cells and cells with central nuclear strangulation in rat urinary bladder and lungs.
УДК 615.111.014.2.014.46
Н.В.Рязанцева1, В.В.Новицкий1, И.А.Шперлинг2*, О.Н.Филиппова1, О.А.Рогов2, Э.В.Сапрыкина1
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ НАРУШЕНИЯ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ МЕТГЕМОГЛОБИНОБРАЗОВАТЕЛЕЙ
1ГОУВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» 2Томский военно-медицинский институт Министерства обороны Российской Федерации
У крыс линии 'Маг после однократного внутрибрюшинного введения нитрита натрия и солянокислого фе-нилгидразина в дозах DL50 установлено, что нарушения структурного статуса эритроцитарной мембраны у крыс при токсическом действии метгемоглобинобразователей характеризуются возрастанием микровязкости как в области интегральной липидной фазы, так и в области анулярных липидов, а также угнетением активности №+,К+-АТФазы. При этом действие солянокислого фенилгидразина характеризуется более выраженным и длительным мембранодестабилизирующим эффектом. Признаки структурной модификации мембраны эритроцитов при введении нитрита натрия и солянокислого фенилгидразина (DL50) в эксперименте выражены в течение длительного времени (до 21 сут), сохраняясь в период ликвидации метгемоглобинемии.
Ключевые слова: метгемоглобинемия, эритроцит, мембрана, флуоресцентные зонды, активность Ш+,К+-АТФазы
Введение. В последние годы наметилась тенденция к увеличению случаев интоксикации соединениями, обладающими метгемоглобиноб-разующими свойствами [1, 4]. Отравления мет-
* Фрагмент диссертационной работы
гемоглобинобразователями характеризуются скоротечностью и высокой частотой смертельных исходов [9]. Современные сведения о токсикологии метгемоглобинобразователей позволяют говорить о большом многообразии патологических эффектов, вызываемых этими соеди-
