CC BY
43
УДК 632.937;595.142.39;591.23
Вегетативные инсектицидные белки
А.Г. ВИКТОРОВ, старший научный сотрудник Института проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН e-mail: [email protected]
Возделывание генетически модифицированных сельскохозяйственных культур, несущих Cry-гены грамм-положительной спо-рообразующей бактерии Bacillus thuringiensis, выявило разную чувствительность вредных насекомых к Bt-токсинам (Cry-белкам, или дельта-эндотоксинам). В ряде случаев понадобилось дополнительное применение таких инсектицидов, какпиретроиды,карбаматы и даже фосфорорганические соединения, особенно на полях трансгенного хлопчатника. Именно с целью поиска инсектицида следующего поколения молекулярные биологи приступили к детальному изучению всего спектра белков, производимых бактерией B. thuringiensis.
Наибольший интерес в качестве такового вызвали Vip-белки -vegetative insecticidal protein (вегетативные инсектицидные белки). Первым был обнаружен ген vip3A(a) у бактерий B. thuringiensis из штамма АВ88. Гомологичные гены были выявлены также примерно у 15 % штаммов этого вида. Кодируемый геном vip3A(a) белок состоит из 791 аминокислоты и весит порядка 88,5 kDa*. Белок Vip3A не имеет структурной гомологии с дельта-эндотоксинами, в частности у него нет длинной ам-фипатической спирали в N-конце-вой части белка (домен 1), которая у Cry-белков ответственна за
: kDa - единица атомарной массы.
проникновение сквозь клеточную мембрану. Из этого можно сделать вывод об ином механизме действия Vip-белков. В отличие от дельта-эндотоксинов, экспрессия которых проходит во время споруляции, синтез Vip-белков начинается на стадии вегетативного роста (с середины логарифмической фазы) и продолжается во время споруляции. В отличие от дельта-эндотоксинов секреция Vip-белков происходит без про-цессинга N-концевой части. Vip-белки непохожи на другие известные протеины и представляют собой новый класс токсинов, поражающих личинки чешуекрылых в течение 24-72 ч после попадания в желудочно-кишечный тракт. Спектр инсектицидной активности белков Vip3A довольно впечатляющ: хлопковые совки(Spodop-tera frugiperda, S. exigua, Helico-verpa zea), совка ипсилон Agrotis ipsilon, табачная огневка Heliothis virescens. Таким образом, список видов чешуекрылых, гусеницы которых погибают от Vip3A значительно шире соответствующего показателя у Cry-белков [2].
Токсичность Vip3A на два-три порядка превышает таковую дельта-эндотоксинов. Так, если ЛД50 белков CryIA(b) и CryIA(c) для гусениц A. ipsilon составляет около 80 и 18 мкг на мл корма соответственно, то 100 % смертность особей того же вида достигается при добавлении всего 62 нг Vip3A на 1 мл искусственного корма [2]. Гистологические исследования показали, что нанесение Vip3A на искусственный корм в концентрации 4 нг/см2 вызывало паралич кишечника у гусениц 1-го возраста A. ipsilon и S. frugiperda. При-
менение более высокой дозы -40 нг/см2 - вызывало полный лизис клеток эпителия кишечника и гибель гусениц, в то же время гусеницы кукурузного мотылька (Ostrinia nubialis), не чувствительные к этому токсину, питались кормом, содержащим Vip3A белки, без всяких отрицательных для себя последствий [7].
При попадании в кишечник гусениц белок Vip3A, весящий 88,5 kDa,протеолитически активируется до белка, весящего 62 kDa. В лабораторных экспериментах прототоксин Vip3A-F [Full-length] протеолитически активировался и при воздействии трипсина -Vip3A-T [Trypsin], и экстракта кишечного сока - Vip3A-G [Gut]. Крайне интересным представляется и то обстоятельство, что токсин Vip3A активируется кишечным соком как чувствительной к нему табачной рогатой гусеницы -бражник сфинкс Manduca sexta, так и не чувствительной гусеницы кукурузного мотылька [3]. Из данного обстоятельства можно сделать вывод, что устойчивость насекомых к этому токсину обусловлена более тонкими молекулярными механизмами.
Изучение поведения меченного белка Vip3A-G в кишечнике гусениц M. sexta показало, что происходит его конкурентное связывание с мембранными пузырьками клеток щеточной каймы эпителия средней кишки. В то время как протеолитическая обработка Vip3A белка в кишечниках как чувствительных, так и не чувствительных насекомых происходит одинаково, in vivo иммунолокали-зация показывает, что молекулы Vip3A прикрепляются к клеткам эпителия кишечника гусениц, чувствительных к нему, в значительно больших масштабах, нежели к таковым у гусениц, не чувствительных к Vip3A. Исследования in vitro клеток средней кишки гу-
сениц M. sexta показали, что если молекулы активированного токсина CrylAb связывались с 120 kDa аминопептидазы-N и 250 kDa молекул кадгерина, то молекулы токсина Vip3A-G прикреплялись к 80 kDa и 100 kDa молекул, отличавшихся от всех известных CrylAb рецепторов. Исследования in vitro средней кишки гусениц M. sexta методом фиксации напряжения показали, что белок Vip3A-G действительно образует поры, в то время как белок Vip3A-F на это не способен. В то же самое время при проведении аналогичных опытов с не чувствительными к Vip-белкам гусеницами Danaus plexippus Vip3A-G поры не образовывал. В плоскихлипид-ных бислоях Vip3A-G и Vip3A-T образовывали ионные каналы в отсутствии любых рецепторов, подтверждая имманентное свойство белка Vip3A к образованию пор [3].
Вместе с тем, некоторыми авторами не исключалась возможность белка Vip3A вызывать апоптоз клеток после прикрепления к соответствующим рецепторам чувствительных насекомых [3]. Термин «апоптоз» обозначает программу гибели клеток, которая включает в себя «слипание» хромосом, деф-рагментацию клеточного ядра, конденсацию цитоплазмы, пузырьковидные вздутия клеточной мембраны и, наконец, разрушение всей клетки. Апоптоз, как механизм токсического воздействия, не взаимоисключаем с механизмом образования пор. Так, было показано, что бактериальные токсины аэролизин, производимый Aeromonas hydrophila, и альфа-токсин - Staphylococcus aureus, в зависимости от дозы и типа клеток могут индуцировать и порообразование и апоптический синдром [5, 6]. Кроме того, токсические агенты, полученные из спор B. thuringiensis, могут индуциро-
вать in vitro апоптоз клеток средней кишки H. virescens [4].
Так или иначе, к настоящему времени фирмой Syngenta Crop Protection уже разработано несколько линий хлопчатника, содержащих гены Vip3A: СОТ102, СОТ202 и СОТ203. Кроме того, проходит испытания принципиально новая трансгенная технология VipCot. Растения этого сорта генетически модифицированного хлопчатника содержат сразу два гена B. thuringiensis: Vip3A и Cry 1Ab. Результаты, полученные на экспериментальных посевах VipCot хлопчатника в 2005-2007 гг., показали его высокую эффектив-
ность как против хлопковой совки, так и против табачной огневки. В ближайшее время следует ожидать появления и других генетически модифицированных сельскохозяйственных культур, содержащих Vp-гены. Однако до сих пор никто еще не ответил на вопрос известного канадского генетика Joe Cummins [1]: все ли меры безопасности предприняты для того, чтобы содержащиеся в трансгенном хлопчатнике Vip-белки, вызывающие апоптоз клеток млекопитающих, не причинили непоправимого вреда, попадая в сырье для производства одежды, пищу человека и корм для скота.
ЛИТЕРАТУРА
1. Cummins J. Death Domains in New Bio-pesticides. 2005 // http://www.i-sis.org.uk/ DeathDomains.php
2. Estruch J.J., Warren G.W., Mullins M.A., Nye G.J., Craig J.A. & Koziel M.G. Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticida! protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects. // PNAS, 1996, v. 93, p. 5389-5394.
3. Lee M.K., Walters F.S., Hart H., Palekar N. and Chen J. The mode of action of the Bacillus thuringiensis vegetative insecticida! protein Vip3A differs from that of CrylAb d-endotoxin / / Appl. Environ. Microbiol, 2003, v. 69, p. 4648-4657.
4. Loeb M.J., Hakim R.S., Martin P., Narang N., Goto S. and Takeda M. Apoptosis in cultured midgut cells from Heliothis virescens larvae exposed to various conditions. // Arch. Insect Biochem. Physiol, 2000, v. 45, p. 12-23.
5. Menzies B.E., Kourteva I. Staphylococcus aureus alpha-toxin induces apoptosis in endothelial cells. // FEMS Immunol Med Microbiol, 2000, v. 29, p. 39-45.
6. Nelson K.L., Brodsky R.A. and Buckley J.T. Channels formed by subnanomolar concentrations of the toxin aerolysin trigger apoptosis of T-lymphomas. // Cell Microbiol, 1999, v. 1, p. 69-74.
7. Yu C.-G., Mullins M.A., Warren G.W., Koziel M.G. and Estruch J.J. The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium cells of susceptible insects. // Appl. Environ. Microbiol, 1997, v. 63, p. 532-536.
Аннотация. Рассмотрен механизм действия вегетативных инсектицидных белков (Vip3A), вырабатываемых бактерией Bacillus thuringiensis. Оценены перспективы использовании Vip3A(a) генов в создании трансгенных растений второго поколения.
Ключевые слова. Bacillus thuringiensis, вегетативные инсектицидные белки, трансгенные растения, апоптоз.
Abstract. The paper discusses the toxic effect of Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal proteins (Vip3A). It considers the prospects of using Vip3A(a) genes in the construction of the second generation transgenic plants.
Keywords. Bacillus thuringiensis, vegetative insecticidal proteins, transgenic plants, apoptosis.
