CC BY
113
Том 150, кн. 1
Естественные науки
2008
УДК 579.83:543.42
ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИН BACILLUS THURINGIENSIS КАК ПРИРОДНЫЙ ПРОТОНОФОР: АНАЛИЗ МЕТОДАМИ ИК- И ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ
Д.В. Каменек, О.Н. Ильинская, Л.М. Цофина, Л.К. Каменек
Аннотация
Установлена способность дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis снижать в 2-5 раз сопротивление искусственных фосфолипидных мембран, прямо пропорциональная концентрации токсина. Дельта-эндотоксин в концентрации 70 мкг/мл снижал потенциал внутренней митохондриальной мембраны на 40% в течение 12 мин инкубации. Методами ИК- и ЯМР-спектроскопии показано, что эндотоксин является потенциальным природным разобщителем-протонофором благодаря наличию большого количества лабильных протонов.
Ключевые слова: дельта-эндотоксин, ЯМР-, ИК-спектроскопия.
Введение
Спорообразующая кристаллофорная бактерия Bacillus thuringiensis, поражающая многие виды насекомых, широко используется при получении инсектицидных препаратов для защиты растений. Эффективное применение таких препаратов, а также создание новых, более совершенных, требует знания многих особенностей патогена и механизмов его действия.
Известно, что основным действующим началом B. thuringiensis, в целом ответственным за комплекс патологических проявлений, является дельта-эндотоксин, продуцируемый ею, который наряду с инсектицидным оказывает цито-токсическое влияние на культуры раковых, бактериальных и грибных клеток [1]. Установлено, что строение и химические свойства токсинов разного происхождения имеют значительное сходство [2]. Показано также, что дельта-эндотоксин способен связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматиче-ских мембранах клеток кишечного эпителия насекомых, а затем проникать в них, формируя каналы-поры, приводящие к нарушению активного транспорта ионов через мембрану [3]. Однако известно, что такие каналы обладают сродством к самим токсичным полипептидам или их фрагментам в 20-30 раз более высоким, чем к электролитам [4].
Имеются данные, показывающие, что первичным действием дельта-эндотоксина является разобщение окислительного фосфорилирования и дыхания в митохондриях чувствительных к нему клеток, обусловленное его протонофор-ными свойствами. Способность разобщать при этом не зависит от источника происхождения токсина (в пределах патотипа), но прямо пропорциональна его концентрации [5].
Целью настоящей работы явилось выяснение особенностей строения дельта-эндотоксина, которые обусловливают его способность разобщать окислительное фосфорилирование.
1. Постановка задачи
В работе использовали следующие штаммы различных подвидов B. thurin-giensis: galleriae 69-6 и 13-7; thuringiensis 202; alesti 204; sotto 617; kurstaki Z-52; dendrolimus 502, продуцирующие дельта-эндотоксины, токсичные для чешуекрылых (патотип А) и кодируемые генами Cry I-класса [6]. Культуры получены из ФГУП ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Поверхностное культивирование осуществляли в термостатах при 27 °С в чашках Петри на агаризованной питательной среде № 14. Кристаллы предварительно выделяли в чистом виде, используя двухфазную систему: 1%-ный водный раствор сульфата натрия - четыреххлористый углерод [7]. Щелочную экстракцию дельта-эндотоксина выполняли по методу Кукси [8]. Разделение токсичных полипептидов проводили методом хроматографии на колонке Lephadex-G-200 размером 2.54 х 10 см. Уровень белка определяли по методике Лоури. Особенности строения дельта-эндотоксина изучали методами ИК- и ЯМР-спектроскопии.
ИК-спектры в диапазоне волновых чисел 4000-400 см- были записаны с помощью ИК-спектрофотометра марки Perkin-Elmer-325, который был использован в режиме линейной спектральной поглощательной способности. Образцы готовили в виде таблеток с бромистым калием или растворов в абсолютном пиридине.
ЯМР-спектры снимали на ЯМР-спектрометре марки Varian на 60 Мгц с электромагнитом и разверткой спектра по полю, предназначенном для резонанса на ядрах Н1. В качестве внешнего стандарта использовали тетраметилси-лан (ТМС), сигнал от которого принимался за точку отсчета для измерения химических сдвигов протонов (8-шкала). В качестве растворителей использовали дейтериевую воду (В2О), щелочной буфер, приготовленный на Б2О, и диме-тилсульфоксид (ДМСО).
Разобщающие свойства эндотоксина оценивали по действию его на искусственные фосфолипидные азолектиновые мембраны.
Мембраны получали на круглом отверстии диаметром 1 мм в тефлоновой ячейке. Для приготовления мембран использовали раствор азолектина и липидов, выделенных из гусениц тутового шелкопряда, в н-декане в концентрации 20 мг/мл. Реакцию проводили в трис-HCl буфере, рН 7.0. Подаваемое напряжение составляло 100 мВ. Изменение сопротивления мембраны регистрировали с помощью рН-метра и потенциометра. В опытах применяли неполяризующиеся хлорсереб-ряные электроды с агаровыми мостиками на 0.01-1.0 М растворе KCl [9].
2. Результаты и обсуждение
Известно, что обычные белки дают одинаковую картину полос поглощения в ИК-области спектра [10]. На рис. 1 представлены спектры поглощения в ИК-области дельта-эндотоксина B. thuringiensis var. galleriae штамм 69-6. Такая картина поглощения в ИК-области характерна для всех изученных эндотоксинов.
Рис 1. ИК-спектры дельта-эндотоксина B. thurinfiensis subsp. galleriae штамм 69-6, полученного методом щелочного гидролиза: 1) в пиридине, 2) в бромистом калии (стрелкой указана полоса поглощения неионизированной СООН-группы)
Для спектров всех эндотоксинов (рис. 1, кривая 2) характерно наличие основных белковых полос поглощения. Это полосы в области 3300, 3080, 1440— 1460, 1240-1260 и 550-700 см-1, обусловленные колебаниями NR-групп; 2960, 2920, 2840 и 1440-1460 см-1, связанные с поглощением С-Н-связей; 10501070 см- , обусловленные колебаниями пептидной группы -СО-NH-C-. Полосы поглощения ионизированной карбоксильной группы СОО- при 1370-1383 сми колебаний С-О-связи в СООН-группе при 1170 см-1 присутствуют на всех ИК-спектрах. Все полученные спектры не обладают какими-либо полосами, не свойственными для обычных белков, кроме полосы в области 1080-1150 см- в спектрах культур, характерной для углеводного компонента.
Более информативным оказалось сравнение спектров в бромистом калии и абсолютном пиридине (рис. 1). Особенностью спектра в бромистом калии является наличие очень сильной полосы поглощения при 1730 см-1 (кривая 2, полоса поглощения указана стрелкой). Эта полоса характерна для неонизированной карбоксильной группы СООН и обусловлена валентными колебаниями С-О-связи. Полоса исчезает при снятии спектра в пиридине (кривая 1), так как пиридин ионизирует карбоксильную группу до СОО-. При растворении же кристаллов эта группа освобождается в результате утраты четвертичной и третичной структуры белка и обладает лабильным («кислым») протоном Н+, который легко может быть отдан дельта-эндотоксином.
ЯМР-спектры дельта-эндотоксина, полученного методом щелочного гидролиза, были сняты в апротонном биполярном растворителе диметилсульфок-сиде (ДМСО) и в ДМСО с добавлением дейтериевой воды (Б2О). В качестве внешнего стандарта использовали тетраметилсилан (ТМС), сигнал от которого принимался за точку отсчета для измерения химических сдвигов протонов (8-шкала) (рис. 2).
Сущность исследования заключалась в том, что если в ДМСО ожидали полного спектра сигналов от протонов дельта-эндотоксина, то при внесении Б2О некоторые наиболее подвижные (лабильные, «кислые») протоны должны
24
18
12
Химический сдвиг (5), м. д.
Рис. 2. ЯМР-спектры дельта-эндотоксина B. thuringiensis subsp. galleriae штамм 69-6, снятые в смеси ДМСО и D20 (1) и в ДМСО (2); 5 - безразмерная величина, отвечающая миллионным долям поля (м. д.)
были заместиться на дейтерий, в результате чего химический сдвиг сигнала и его интенсивность должны измениться. При сравнении спектров, представленных на рис. 2, было обнаружено, что довольно сильный сигнал в области 12 м. д. (обозначен стрелкой на спектре 2), проявляющийся в ДМСО, совершенно исчезает при добавлении D20 (спектр 1). Именно в этой области расположен сигнал карбоксильного протона в карбоновых кислотах [11]. Следует отметить, что аналогичная картина получена для всех изученных дельта-эндотоксинов, спектры которых лишь незначительно отличались величиной химического сдвига.
Следовательно, дельта-эндотоксин обладает лабильными протонами, которые он способен легко отдавать после растворения в щелочном содержимом кишечника насекомого. Большое количество «кислых» протонов обусловлено доминирующим содержанием в составе белкового дельта-эндотоксина аспара-гиновой и глутаминовой аминокислот. Вещества природного или синтетического происхождения, обладающие лабильными протонами, могут являться разобщителями процессов окислительного фосфорилирования (синтеза АТР), происходящего в митохондриях, если они обладают способностью проникать через биологические мембраны.
Нативный кристалл следует рассматривать как четвертичную белковую структуру дельта-эндотоксина, о чем свидетельствуют результаты электронно-микроскопических и кристаллографических исследований [12]. В стабилизации такой высоко регулярной структуры безусловно участвуют все возможные в полипептидных структурах химические взаимодействия, в том числе и некова-лентные связи, образование которых обусловлено наличием большого количества аспарагиновой и глутаминовой кислот (до 25%). В щелочной же среде происходит частичное расщепление S-S-связей, а также освобождение карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой кислот. В результате кристалл распадается на гидрофильные субъединицы кислой природы, способные осу-
6
Табл. 1
Влияние дельта-эндотоксина на сопротивление искусственной фосфолипид-ной мембраны
Штамм Изменение сопротивления, Ом-Ю10,
В. thuringiensis в зависимости от концентрации токсина, мкг/мл
16 50 100
аПвпав 69-6 1.93 ± 0.20* 0.72 ± 0.19 0.52 ± 0.16
galleriae 13-7 2.08 ± 0.18 0.83 ± 0.17 0.51 ± 0.18
thuringiensis 202 2.01 ± 0.17 0.77 ± 0.18 0.48 ± 0.20
аеи 204 1.89 ± 0.21 0.80 ± 0.20 0.32 ± 0.24
^•оПо 617 1.91 ± 0.16 0.73 ± 0.17 0.50 ± 0.25
ки^аШ 2-52 1.80 ± 0.18 0.86 ± 0.22 0.60 ± 0.25
dendrolimus-502 2.11 ± 0.26 0.70 ± 0.16 0.45 ± 0.15
исходное сопротивление 2.00 ± 0.27 2.00 ± 0.27 2.00 ± 0.27
мембраны
*среднее квадратическое отклонение.
ществлять протонодонорную функцию. Очевидно, именно эта функция обеспечивает дельта-эндотоксину возможность осуществлять разобщение окислительного фосфорилирования и дыхания в митохондриях кишечных клеток насекомых.
Установлено, что разобщители являются переносчиками протонов через мембрану, изменяя таким образом разность потенциалов на ней. Этот эффект может быть обнаружен с помощью искусственных фосфолипидных («черных») мембран, сопротивление которых снижается под действием разобщителей [10].
Было обнаружено, что дельта-эндотоксин, полученный методом щелочного гидролиза, не оказывал влияния на искусственную азолектиновую мембрану в концентрации 16 мкг/мл, а в концентрации 50 и 100 мкг/мл вызывал падение ее сопротивления (табл. 1).
Разница между этими величинами достоверна (при п = 16 Р < 0.01). Таким образом, сопротивление уменьшалось в 2-3 раза под действием токсина в концентрации 50 мкг/мл и 3-5 раз - в концентрации 100 мкл/мл. Некоторые синтетические разобщители, способные свободно проникать через липидную мембрану и переносить таким образом протоны (так называемые проникающие ионы) снижают сопротивление, как правило, на несколько порядков. Показываемый дельта-эндотоксином эффект сравнительно невелик по отношению к эффекту разобщителей типа проникающих ионов. Однако разобщающее действие дельта-эндотоксина бесспорно. Полученные данные соответствуют известному из литературы факту о способности белка-токсина ассоциироваться (или интегрироваться) с фосфолипидами мембраны, создавая таким образом каналы, через которые могут поступать лабильные протоны в составе токсичного полипептида [4].
Summary
L.K. Kamenek, O.N. Ilinskaya, L.M. Cofina, L.K. Kamenek. Bacillus thuringiensis Delta-endotoxin As a Natural Protonophore: IR and NMR Spectroscopy Analysis.
It is stated that delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis are able to decrease the resistance of artificial phospholipid membranes, in direct proportion to the endotoxin concentration. Delta-endotoxin in concentration of 70 mkg/ml reduces the inner mitochondrial membrane potential by 40% during 12 min incubation. IR and NMR spectroscopy have shown that endotoxin is a potential natural protonophore-uncoupler due to the presence of a large amount of labile protons.
Key words: delta-endotoxine, NMR, IR spectroscopy.
Литература
1. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. Действие дедьта-эндотоксинов четырех подвидов B. thuringiensis на различных прокариот // Микробиология. - 1997. - Т. 66, № 1. -С. 25 31.
2. Chestukhina G.G., Kostina L.I., Mikhailova A.L., Yurin S.A., Klepikova F.S., Ste-panov V.M. The main features of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin structure // Arch. Microbiol. - 1982. - V. 132. - P. 159-162.
3. Carroll J., Ellar D.J. An analysis of Bacillus thuringiensis endotoxin action on insect midgut membrane permeability using a light scattering assay // Eur. J. Biochem. - 1993. -V. 214. - P. 771-778.
4. Кагава Я. Биомембраны. - М.: Высш. шк., 1985. - 303 с.
5. Каменек Л.К. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis: строение, свойства и использование для защиты растений: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - М., 1998. - 43 с.
6. Höfte H., Whiteley H. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis delta-endoto-xins determined by compilation analysis // J. DNA Sequens. Mapp. - 1990. - V. 1. -P. 97-106.
7. Pendleton I.R., Morrison R.B. Separation of the spores and crystals of Bacillus thuringiensis // Nature. - 1966. - V. 212. - P. 228-229.
8. Cooksey K.E. Purification of a protein from Bacillus thuringiensis toxic to a larvae of Lepidoptera // Biochem. J. - 1968. - V. 106. - P. 445-454.
9. Либерман Е.А., Мохова Е.Н., Скулачев В.П., Топалы В.П. Действие разобщителей окислительного фосфорилирования на бимолекулярные фосфолипидные мембраны // Биофизика. - 1968. - Т. 13. - С. 188-193.
10. Чиргадзе Ю.Н. Инфракрасные спектры и структура полипептидов и белков. - М.: Наука, 1965. - 135 с.
11. Ионин Б.И., Ершов Б.А. ЯМР-спектроскопия в органической химии. - Л.: Химия, 1967. - 32 с.
12. Ануфриев Э.Ф. Электронно-микроскопическое изучение кристаллов эндотоксина Bacillus thuringiensis var. dendrolimus // Энтомопатогенные бактерии и грибы в защите растений. - Новосибирск: Изд-во СО ВАСХНИЛ, 1985. - С. 135-145.
Поступила в редакцию 05.09.07
Каменек Дмитрий Валерьевич - старший преподаватель кафедры общей и биологической химии Ульяновского государственного университета. E-mail: kamenekvm@ulsu.ru
Ильинская Ольга Николаевна - доктор биологических наук, профессор, член-корр. АН РТ, заведующий кафедрой микробиологии Казанского государственного университета.
E-mail: Olga.Ilinskaya@ksu.ru
Цофина Лиля Мироновна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института проблем передачи информации им. А. А. Харкевича РАН, г. Москва.
Каменек Людмила Кирилловна - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой общей и биологической химии Ульяновского государственного университета.
E-mail: kamenekvm@ulsu.ru
