CC BY
137
Д. В. Каменек, О. Н. Ильинская, Е. В. Никитина,
Л. К. Каменек
ДЕЙСТВИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА BACILLUS THURINGIENSIS VAR. SOTTO НА ИОННЫЙ ТРАНСПОРТ В КЛЕТКАХ КУЛЬТУРЫ HeLa
Ключевые слова: дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis, Mg2*-зависимая K*, Ыэ+-АТФазы, транспорт ионов в клетке.
Показано нарушение активного транспорта ионов K*, Na*, Ca2* и Mg2* через цитоплазматическую мембрану клеток культуры HeLa после 15 мин их инкубации с дельта-эндотоксином Bacillus thuringiensis var. sotto 617. Изменению концентрации ионов предшествует активирование Mg2*-зависимой K*, Na^-АТФазы (до 6 - 7раз), начиная с 1 мин после добавления токсина. Такие эффекты характерны для действия разобщителей процессов окислительного фосфорилирования и дыхания.
Keywords: delta-endotoxin Bacillus thuringiensis, Mg2 *-dependent K *, Na *-ATPase, transport of ions in the cell.
It is shown violation of ion active transport K *, Na *, Ca2 * and Mg2 * through the cytoplasmic membrane cell culture HeLa after 15 min of incubation with delta-endotoxin Bacillus thuringiensis var. sotto 617. Changes in ion concentration precedes activation Mg2 *-dependent K *, Na *-ATPase (up to 6 - 7 times), from 1 min after the addition of toxin. Such effects are characteristic to the uncouplers of oxidative phosphorylation and respiration.
Введение
Известно, что основными токсическими компонентами В. thuringiensis являются белковые дельтаэндотоксины [1,2]. Многочисленные подвиды В. thuringiensis продуцируют дельта-эндотоксины, гомологичные по составу, но различные по специфичности действия на насекомых. Так, синтез дельтаэндотоксинов генетически детерминирован [3] и токсины В. thuringiensis subsp. thuringiensis являются продуктами генов Cry1Ia10 и Cry1Ba1 и патогенны для чешуекрылых [4]. Дельта-эндотоксины организованы в виде параспоральных кристаллов. Показано, что эндотоксины формируют в мембране ион-специфические поры, нарушают ионный транспорт через мембрану [5], В последние годы значительный интерес в мировой науке уделяется спорообразующей кристаллофорной бактерии Bacillus thuringiensis, поражающей многие виды насекомых и используемой при получении инсектицидных препаратов для защиты растений. До недавнего времени В. thuringiensis рассматривали исключительно как энтомопатогенный микроорганизм. Однако в последние годы установлено, что помимо инсектицидного действия он проявляет цитотоксическую активность в отношении некоторых бактерий, фитопатогенных грибов и раковых клеток [1].
Известно, что B. thuringiensis продуцирует дельта-эндотоксин с молекулярной массой от 60 до 150 кДа, при этом наиболее представлены полипептиды около 70-90 кДа, до которых диссоциируют кристаллы в слабощелочной среде кишечника насекомого в присутствии специфических протеиназ (в том числе протеолитических ферментов бактерии-продуцента). Именно данные токсические компоненты обусловливает комплекс патологических проявлений, возникающих под его воздействием в различных клеточных культурах. Установлено, что строение и химические свойства токсинов, продуцируемых разными подвидами бактерии, имеют значительное сходство [2]. Токсины способны оказывать цитостатическое воз-
действие на мембраны клеток кишечного эпителия восприимчивых насекомых. Показано так же, что дельта-эндотоксин способен связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматических мембранах клеток кишечного эпителия насекомых, а затем проникать в них, формируя каналы-поры, приводящие к нарушению активного транспорта ионов через мембрану [3, 4]. Под влиянием дельта-
эндотоксинов отмечали также активирование АТРаз клеток насекомых, уплотнение митохондриального матрикса, разрушение ядерного хроматина и, наконец, лизис клеток. Считают, что перечисленные нарушения метаболизма и последующий лизис клеток-мишеней могут являться следствием протонофорной активности белкового токсина [5]. Имеются данные, показывающие, что первичным действием дельтаэндотоксина является разобщение окислительного фосфорилирования и дыхания в митохондриях чувствительных к нему клеток, обусловленное его протонофорными свойствами. Способность разобщать при этом не зависит от источника происхождения токсина (в пределах патотипа), но прямо пропорциональна его концентрации [6].
Однако имеющиеся в литературе данные касаются только механизма действия дельтаэндотоксина на клетки насекомых. В доступной литературе имеется очень мало сведений, освещающих механизм действия дельта-эндотоксина на раковые клетки. Вместе с тем есть основания полагать, что оба механизма имеют общие черты.
Целью настоящей работы являлось изучение действия дельта-эндотоксина B. thuringiensis var. sotto 617 на активный транспорт ионов в клетках культуры НеЬа (рака шейки матки человека).
Материалы и методы исследования
В работе использовали штамм 617 подвида B. thuringiensis subsp. sotto, полученый из ФГУП Гос-НИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Данный подвид продуцирует дельтаэндотоксин, токсичный для чешуекрылых (патотип А) и кодируемый генами Cry I - класса [7]. Поверхност-
ное культивирование осуществляли в термостатах при 27°С в чашках Петри на агаризованной питательной среде РПА, рН = 7,2-7,5. Биомассу В. thuringiensis, содержащую кристаллы эндотоксинов и споры продуцента, отмывали дистиллированной водой от компонентов питательной среды и водорастворимых токсинов. Кристаллы предварительно выделяли в чистом виде, используя двухфазную систему: 1% водный раствор сульфата натрия - четыреххлористый углерод [8]. При этом кристаллы переходили в водную фазу, из которой их осаждали центрифугированием. Щелочную экстракцию дельта-эндотоксина выполняли по методу Кукси [9]. Затем раствор подвергали диализу и доводили водой до необходимой концентрации. рН раствора снижали до 7,8 осторожным титрованием
0,1 н. НС1. Разделение токсичных полипептидов проводили методом хроматографии на колонке Lephadex-в-200 размером 2,54x10 см. Поскольку компоненты низкомолекулярных фракций могут являться гидролизатами кристаллов, продуцирующих низкомолекулярные эндотоксины, для проведения экспериментов их исключали, подвергая исходные щелочные гидролизаты разделению методом колоночной хроматографии и собирая только фракции с Мг выше 60 кДа. Их масса составляла не менее 90% от общей массы белка. Соответствие полученных экстрактов эндотоксинам подтверждали электрофоретически с использованием следующих маркерных белков: бычий сывороточный иммуноглобулин в (Мг 150 кДа), трансферрин (Мг 80-90 кДа), альбумин (Мг 67 кДа), цитохром с (Мг 13,37 кДа). Очистку дельта-эндотоксинов завершали микрофильтрацией через бактериальные фильтры (диаметр пор 0,4 мкм), которая являлась одновременно и стерилизацией. В экспериментах использовали свежеприготовленные растворы дельта-эндотоксина
[10].Уровень белка определяли по методике Лоури
[11].
Культуру перевиваемой линии клеток НеLa (рак шейки матки женщины) выращивали на питательной среде Грейса с добавлением телячьей сыворотки при рН=7.2. Титр культуры составлял 1 млн клеток на 1 мл суспензии [12].
Определение концентрации ионов проводили следующим образом. Для изучения действия дельтаэндотоксина на уровни концентрации ионов 0,1 мл клеточной суспензии инкубировали в течение различных промежутков времени с раствором эндотоксина и отделяли центрифугированием в течение 5 мин при 5000 об/мин. Затем клетки растворяли в концентрированной НЫО3. Концентрацию ионов К+, Ыа+, Са2+ и Мд2+ измеряли с помощью атомно-адсорбционного спектрофотометра марки С-115 или Регкш-Е1тег-360, Ыа+ и К+ в буфере 0,5% Сб2С!+, а Мд2+ и Са2+ - 0,5% ЬпС12. Натрий, калий и кальций определяли в режиме эмиссии, магний — в режиме абсорбции. Результаты выражали в мкмоль/л [13].
Активность Мд2+ -зависимой АТФазы устанавливали по выделению неорганического фосфата (Фн) из АТФ в результате реакции ферментативного гидролиза [14]. Реакционная смесь содержала в конечном в объеме 2 мл (в мМ): 5 МдС12; 20 КС!; 100
NaCl; 5 АТФ№2; 40 трис-HCl, pH 7,4 и препарат клеток, содержащий 0,2-0,3 мг белка. Препарат фермента получали в результате размораживания клеток и последующей их гомогенезации. При изучении действия дельта-эндотоксина на АТФазу in vitro в реакционную смесь добавляли необходимое в опыте количество раствора токсина. В качестве контроля использовали смесь, содержащую все компоненты кроме препарата фермента, или содержащую его, но в этом случае трихлоруксусную кислоту приливали до введения в смесь ферментного препарата. После 20 мин инкубации при 37оС реакцию прекращали, приливая холодную трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5%. Для определения содержания неорганического фосфата к исследуемому раствору приливали дистиллированную воду до 3,6 мл, добавляли 0,5 мл 6,6%-ного раствора молибдата аммония, 0,5 мл 7,5 н H2SO4 и 0,4 мл раствора сульфата железа (II). Раствор сульфата железа готовят, растворяя 1г FeSO4*7H2O в 10 мл H2O, затем добавляют 0,2 мл 7,5 н раствора H2SO4. После добавления указанного раствора пробы перемешивали, оставляли при комнатной температуре на 40 мин.
Концентрацию Фн регистрировали на спектрофотометре марки СФ-26 ЛОМО отечественного производства в кюветах кварцевого стекла с толщиной слоя 1 см при 625 нм по изменению интенсивности окраски раствора, вызванной образованием фосфорномолибденового комплекса. Делали поправку на спонтанный гидролиз АТФ и концентрацию начально присутствовавшего в растворе Фн. Активность фермента выражали в мг неорганического фосфата, выделившегося в течение 1 ч при действии на АТФ ферментного препарата, содержащего 1 мг белка (мг Фн-мг -1 белка-ч -1). Количество неорганического фосфата определяли по калибровочному графику. Каждое определение проводили не менее, чем в трех повторностях. Содержание белка устанавливали по методу Лоури, как описано ниже.
Во всех случаях оценивали достоверность полученных различий признаков в опыте по сравнению с контролем или пар признаков с использованием соответствующих алгоритмов. В лабораторных исследованиях использовали критерий достоверности Стьюдента [15].
Влияние хлорированных фуранонов на жизнеспособность бацилл
Для разрешения получения более полной картины действия дельта-эндотоксина на систему ионного транспорта через цитоплазматическую мембрану, было проведено измерение уровней концентрации ионов в различные моменты времени после начала действия токсина. Данные, представленные в таблицах 1 и 2, показывают, что, начиная с 15 минут после добавления токсина, значительно изменялась концентрация всех определяемых ионов в клетках HeLa. Наибольшие отклонения от нормы наблюдали в концентрации ионов Na+, причем степень повышения уровня зависела от количества добавляемого токсина. Максимальное увеличение составляло 203% через 30 мин для 100 мкг/мл токсина и 182% через 1 ч для 50
мкг/мл. Существенно снижалась концентрация ионов K , достигая 61% от исходного значения через 30 мин для 100 мкг/мл и 60% через 1 ч для 50 мкг/мл. Для Mg2+ отмечено снижение до 78% через 30 мин для 100 мкг/мл и 71% через 1 ч для 50 мкг/мл, соответственно. Концентрация ионов Ca2+, наоборот, повышалась через тот же период времени до 130 и 136%, соответственно.
Наблюдения с помощью светового микроскопа показали. Что в этот период (от 15 мин и далее) происходит нарастание процесса вакуолизации клеток, связанной с нарушением транспорта ионов через цитоплазматическую мембрану. Нарушение транспорта ионов, и в первую очередь нерегулируемый приток в клетки № , приводит к увеличению скорости пассивного транспорта воды в нее, что и является непосредственной причиной вакуолизации.
Получены достоверные данные, показывающие значительное изменение концентрации ионов Ca2+ и Mg2+. Поддержание постоянства концентрации этих ионов чрезвычайно важно из-за высокой их биологической активности. Оба эти иона присутствуют в клетке не в свободном виде, а находятся в комплексе с другими веществами. Ca2+, вероятнее всего, связан с цитратом [16], а Mg2+ с АТР. Ca2+ в основном находится в органеллах - митохондриях, эндоплазматиче-ском ретикулуме, кальцисомах, а не в цитозоле. Таблица 1 - Влияние дельта-эндотоксина (50 мкг/мл) на концентрацию ионов в клетках ИвЬа
Результаты, представленные в таблице 3, показывают значительное активирование K ,Na - АТ-Фазы культур клеток ИвЬа. Активирование начиналось уже через 1 мин после добавления токсина и составляло 59%. Максимальных значений активность фермента достигала через 15 мин и составляла и 213%. Полученные данные показывают, что изменение активности фермента предшествует изменению концентраций
ионов в клетках и, следовательно, является первичным по отношению к ним. Такой эффект характерен для действия веществ, разобщающих процессы дыхания и окислительного фосфорилирования.
Таблица 2 - Влияние дельта-эндотоксина (100 мкг/мл) на концентрацию ионов в клетках культуры ИвЬа
Примечание: * р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001 при п = 20 (п - число пар измерений)
Известно, что К+, Na+ - АТФазы ответственны за активный перенос ионов через цитоплазматическую мембрану и мембраны внутриклеточных структур [17, 18]. В описанных выше экспериментах показано, что наряду с изменением концентрации неорганических катионов в клетках, происходит существенное активирование Mg2+ -зависимой К+, №+-АТФазы, локализованной в различных мембранных структурах клетки, включая цитоплазматическую мембрану. Активирование фермента происходило раньше (1 мин), чем изменение концентрации неорганических катионов (15 мин). К моменту начала изменения концентрации ионов активность фермента достигала существенного значения (638% от исходного в клетках ИеЬа). Такое существенное увеличение активности фермента противоречит концепции прямого нарушения концентрации ионов за счет их пассивного транспорта по градиенту концентрации через образованные токсином водные поры. В этом случае следовало бы ожидать угнетение ферментативной активности из-за нарушения активного транспорта. Поскольку активность фермента характеризовала его способность к гидролизу субстрата (АТФ), и известно, что эта способность резко повышается в условиях разобщения окислительного фосфорилирования и дыхания, активирование данной ферментной системы фактически отражает степень деэнергизации клетки. Следствием деэнергизации является связанная с нарушением ионного транспорта и притоком в клетку воды вакуолизация, приводящая в конечном итоге к разрушению клетки.
Время после обра- ботки, мин Концентрация ионов (мкмоль х10 5 клеток)
К+ % N8+ % Са2+ % Мд2+ %
исход- ная 127,7 ± 4,9 10 0 32,8±3,2 10 0 14,1 ± 1,2 10 0 25,7±2, 6 10 0
5 139,2 ± 16,5 10 9 32,9±6,1 10 0 13,7± 1,7 97 25,6±1, 8 10 0
10 128,3 ± 3,9 10 1 35,8±2,1 10 9 14,9±2,4 10 6 23,6±2, 1 92
15 104,7 ± 12,6 82 41,7±4,8 12 7 16,2± 1,3 11 5 21,6±2, 2 84
30 99,7 ± 4,6** * 78 50,2±3,6 *** 15 3 17,3± 1,0 * 12 3 18,2±1, 7* 71
60 76,6 ± 10,4* ** 60 59,7±5,2 *** 18 2 19,2±0,9 ** 13 6 18,4±1, 1* 71
180 80,7 ± 6,0** * 63 53,1 ±4,1 *** 16 2 18,1 ± 1,8 12 8 19,5±1, 6* 76
Примечание: * р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001 при п = 20 (п - число пар измерений).
Время после обработки, мин Концентрация ионов (мкмоль х105 клеток)
К+ % Ыа+ % Са2+ % Mg2+ %
исходная 127,6± 4,9 100 32,8± 3,2 100 14,1± 1,2 100 25,7± 2,6 100
5 128,2± 5,2 101 31,5± 1,6 96 13,6± 2,0 96 +1 ОО^ ^ 2 111
10 123,8± 6,3 97 +1 <4 °°, 3 101 14,5± 1,9 103 +1 СО 40 ГЧ 2 102
15 89,3±4, 8*** 70 +1 * 7* 54 165 +1 * 6* 10 125 +1 <ч °°, 2 94
30 +| ^ 72 7 61 +1 * 72 203 18,3± 1,3** * 130 +1 * 0* О , 22 78
Таблица 3 - Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis (50 мкг/мл) на Мд2+-зависимую K+,Na+ - АТФазу в клетках культуры HeLa
Время после обработки, мин HeLa
А (мг Рн х 105 белка % от исходной А
исходная 0,058+0,007 100
1 0,085+0,013 147
5 0,285+0,018*** 491
10 0,305+0,019*** 526
15 0,370+0,032*** 638
30 0,355+0,026*** 612
6 0 0,299+0,028*** 516
120 0,250+0,048*** 431
Примечание: - р < 0,05; - р < 0,01; - р < 0,001
при п = 20 (п - число пар измерений).
Для того чтобы выяснить, не является ли способность к гидролизу АТФ свойством самого дельтаэндотоксина, были проведены опыты по изучению его действия на этот субстрат в условиях, в которых обычно проводили ферментативную реакцию, но в отсутствии фермента. Было обнаружено, что эндотоксин не способен катализировать гидролиз АТФ с высвобождением фосфата. Исследование же дельтаэндотоксина в отсутствии, как фермента, так и субстрата (АТФ) показало, что он не может являться поставщиком свободного (неорганического) фосфата в реакционную среду.
Транспортные АТФазы выполняют две сопряженные функции: транспорт ионов и гидролиз АТФ, энергетически обеспечивающий транспорт. Согласно современным представлениям [19] процесс осуществляется согласно следующей схеме:
транспорт моновалентного ионаГДОаЧ
Na+[TC+), М-21"—Ei~ Ф АТф + Е _
(1) Е + АДфьфн
транспорт
аминокислот
де Е - транспортная АТФаза, Е1 ~ Ф и Е2 ~ Ф - ее активированные фосфатом переходные комплексы.
Как видно из схемы, торможение транспортной функции приводит к накоплению промежуточных продуктов реакции: АДФ и Фн (стадия (1)), что и регистрируется в наших экспериментах, как усиление гидролитической активности АТФазы.
Повышение концентрации ионов N8 в клетке приводит к задержке в ней воды, которая вызывает значительную вакуолизацию. Положение усугубляет-
ся тем, что нарушение активного транспорта ионов приводит к нарушению зависимого от первого вторичного активного транспорта сахаров и аминокислот, согласно приведенной схемы. В результате происходит “набухание” клеток, цитоплазматические мембраны лопаются, клетки разрушаются. Для транспортных АТФаз очень характерны антипортные системы, в которых транспорт моновалентного иона в одну сторону сопровождается не транспортом другого иона металла в противоположную, а переносом протона [20].
Литература
1. Т.Г. Юдина, Л.И. Бурцева // Микробиология. 66, 1,25-31. (1997).
2. G.G.Chestukhina, L.I.Kostina, A.L.Mikhailova, S.A.Yurin, F.S.Klepikova, V.M.Stepanov. Arch. Microbiol, 132, 159-162 (1982).
3. J.Carroll, D.J. Ellar, Eur. J. Biochem, 214, 771-778 (1993).
4. L.B.Tran, V.Vachon, J.L.Schwartz, R.Laprade Appl. Environ. Microbiol, 67, 4488 - 4494 (2001).
5. Каменёк, Л.К. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis: строение, свойства и использование для защиты растений. Автореф. дисс. д.б.н. - М., 1998. - 40 с.
6. Д.В.Каменек, О.Н.Ильинская, Л.М.Цофина, Л.К. Каме-нек, Ученые записки Казанского государственного университета, Сер. Естественные науки. 150, 1, 69-76 (2008).
7. H.Höfte, H.Whiteley J. DNA Sequens. Mapp. 1, 97 -106 (1990).
8. I.R.Pendleton, R.B.Morrison, Nature. 212, 228-229 (1966).
9. K.E. Cooksey // Biochem.J. 106, 445 - 454 (1968).
10. Бакеева, Л.Е. Средства защиты растений. - Новосибирск, 1986. - С. 19-22. Изменение структуры митохондрий в ответ на функциональные воздействия / Л.Е.Бакеева, А.А.Ясайтис // В сб.: Митохондрии. Молекулярные механизмы ферментативных реакций. - М.: Наука. - 1972. - С. 56-64.
11. М. А.Дронина, Л. П.Ревина, Л. И.Костина, Л. А.Ганушкина, И. А.Залунин, Г. Г.Честухина Биохимия, 71, 2, 173 - 181 (2006).
12. O.H.Lowry, N.J.Rosenbrough, A.L.Farr, R.T.Randall, J. Biol. Chem, 193, 265 - 275 (1951).
13. Методические указания по определению микроэлементов в почвах, кормах и растениях методом атомноабсорбционной спектроскопии. - М.: ЦИНАО, 1985. - 96 с.
14. Писарева Л.Н. Цитология. 10. 988-994 (1968).
15. Н.А. Плохинский Математические методы в биологии / // - М.: МГУ, 1978. - 265 с.
16. Ю.В.Наточин, Р.Г.Парнова // Ж.. эвол. биохим. Физиол, 22, 594 - 595 (1886).
17. J.C. Skou, Physiol. Rev. 45, 596 - 617 (1965).
18. R.W. Albers, Ann. Rev. Biochem. 36, 727-756 (1967).
19. G.A. Kimmich, Biochem. 9, - P. 3669-3677 (1970)
20. R.O. Turbeck, S. Nedergaard, H. Kruse, Biochim. Biophys. Acta. 163, 354-361 (1968).
г
© Д. В. Каменек - к.б.н., ст. препод. каф. общей и биологической химии Ульяновского госуд. ун-та, KamenekVM@ulsu.ru; О. Н. Ильинская - д.б.н., проф., зав. каф. К(П)ФУ, olga.ilinskaya@ksu.ru; Е. В. Никитина - к.б.н., доцент каф. технологии пищевых производств КНИТУ, elenik@mail.ru; Л. К. Каменек - - д.б.н., проф., зав. каф. общей и биологической химии Ульяновского госуд. ун-та.
