CC BY
39
УДК 616-098:591:11
ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ, АЛАНИ-
НАМИНТРАНСФЕРАЗЫ И АСПАРТАТЕМИНОТРАНСФЕРАЗЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЫШЕЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ДЕЛЬТАЭНДОТОКСИНА BACILLUS THURINGIENSIS
М.С. ФЕКЛИНА, Д.В. КАМЕНЕК, Э.К. ЮНУСОВА, Л.К КАМЕНЕК*
Ключевые слова: лактатдегидрогеназа, аланинаминтрансфераза
В настоящее время широко распространены препараты, содержащие спорово-кристаллические комплексы Bacillus thur-ingiensis, занимающие до 90-95% мирового рынка биоинсектицидов [1]. С развитием генной инженерии стали создаваться трансгенные растения, модифицированные геном токсинообразования. Такие растения уже производятся генно-инженерными фирмами в промышленных масштабах. Разработаны новые препараты на основе очищенного от спор и других балластных веществ и предварительно активированного эндотоксина [9, 10]. Уникальная избирательность взаимодействия дельта-эндотоксина с мембранами клеток насекомых дает возможность использовать его для защиты сельскохозяйственных растений и леса от листогрызущих насекомых-вредителей. Существуют данные о безвредности дельта-эндотоксина для млекопитающих, основанные на изучении его прямой токсичности. Попадая в организм животного, дельта-эндотоксин может всасываться в кишечнике и, в первую очередь, имеет возможность взаимодействия с элементами крови. При длительном воздействии токсических веществ в концентрациях, не вызывающих внешне обнаруживаемого эффекта, могут выявляться скрытые изменения ряда биохимических показателей системы крови, которая является чувствительным индикатором, отражающим состояние организма в целом. Метаболизм клетки включает множество разветвленных ферментативных реакций, которые формируют отдельные циклы: гликолиз, цикл трикарбоновых кислот и т.д. При интоксикации накапливаются промежуточные и конечные продукты обмена, оказывающие деструктивное действие на важные системы организма [2].
Сопряженные химические реакции, протекающие в живом организме, и активность ферментов, катализирующих их, характерны почти исключительно для внутриклеточной среды. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ), аланинаминотрасфераза (АлАТ) и ас-партатаминотрансфераза (АсАТ) сыворотки крови являются ферментами, которые способны выходить в межклеточное пространство в результате нарушений целостности клеточных мембран [4]. В этом случае на основании результатов анализов внеклеточных жидкостей (особенно плазмы или сыворотки крови) можно сделать заключение о характере изменений, происходящих внутри клеток разных органов и тканей. Поэтому исследования выше перечисленных ферментов являются важным лабораторным тестом, позволяющим выявить нарушение в работе органов на ранних стадиях токсикации [3].
Цель работы - изучение влияния концентрации дельтаэндотоксина B. thuringiensis subsp. kurstaki, который используется в защите растений, на активность ЛДГ, АсАТ, АлАТ.
Материалы и методы. В исследованиях использовали полугодовалых белых беспородных мышей - самок со средним весом 30±2 граммов. Животным в течении 4 недель дважды в неделю перорально вводили препарат в дозах- 100, 50 или 25 мг на кг массы животного, что составило 0,003, 0,0015 или 0,00075 мг на особь, соответственно. В эксперименте использовавали 360 животных, разделенных на 4 группы, три опытные и одна контрольная. Контрольным животным токсин не вводили. Материалом для исследования служила сыворотка крови. Забор крови для оценки активности проводили еженедельно путем декапитации животных, для усыпления животных использовали эфир.
Сыворотку крови получали методом отстаивания цельной крови и ретракции кровяного сгустка с последующим центрифугированием. Центрифугирование сыворотки проводили при скорости 3000 об/мин в течение 10 мин [7]. Определение активности ферментов проводили в присутствии восстановленной формы кофермента НАДН. В качестве субстрата для определения ЛДГ использовали пируват, АсАТ - L-аспарагиновую кислоту, АлАТ - L-аланин. Инкубационная смесь для определения ЛДГ содержала 2,7 мл 100мМ трис буфера (рН 7,4); 0,1 мл сыворотки;
0,1 мл 23 мМ пирувата натрия; 0,1 мл 5 мМ НАДН. Инкубацион-
*
ная смесь для определения АсАТ содержала 1 мл 80 мМ фосфатного буфера (рН 7,4); 0,1 мл сыворотки; 2 мл 200мМ Ь-аспарагиновой кислоты, 0,02 мл а-кетоглутаровой кислоты; 0,05 мл 18мМ НАДН. Инкубационная смесь для определения АлАТ содержала 1 мл 80мМ фосфатного буфера (рН 7,4); 0,1 мл сыворотки; 2 мл 500 мМ Ь-аланина, 0,02 мл а-кетоглутаровой кислоты; 0,05 мл 18мМ НАДН. Для определения активности ферментов инкубационную смесь помещали в кварцевые кюветы толщиной в 1 см и оценивали скорость окисления НАДН, спектрофотометрически по убыли величины оптической плотности при длине волны 340 нм [8]. Активность ферментов измеряли в нмоль/(с-л), но для удобства активность выражали в %, принимая контроль за 100%, чтобы исключить изменения, связанные с внешними воздействиями на организм животного.
Данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики. Достоверность полученных результатов оценивали с помощью 1-критерия Стьюдента.
Таблица 1
Влияние дельта-эндотоксина на активность лактатдегидрогеназы в крови лабораторных мышей
Сутки Изменение активности ЛДГ,% в зависимости от дозы токсина, мг/кг
Контроль (без токсина) 25 50 100
1 100 103±9 103±15 100±13
7 100 103±11 100±0,11 99±9
14 100 79±8 94±7 91±12
21 100 96±10 93±12 92±21
Примечание: ‘‘‘-р < 0,001 при n = 10, где n - число повторностей
Результаты. Анализ данных указывает на отсутствие существенных изменений активности ЛДГ в сыворотки крови животных во всех исследуемых дозах на протяжении всего эксперимента. Однако прослеживается устойчивая тенденция к снижению активности данного фермента к окончанию эксперимента с увеличением дозы дельта-эндотоксина. На наш взгляд, подобно снижение может быть связано с усилением аэробности условий, которое вызвано действием дельта-эндотоксина. В литературе данный факт описан, как эффект Пастера.
Таблица 2
Влияние дельта-эндотоксина на активность аспартатаминотра-сферазы в крови лабораторных мышей
Сутки Изменение активности АсАТ, % в зависимости от дозы токсина, мг/кг
Контроль (без токсина) 25 50 100
1 100 103±7 102±5 119±14
7 100 107±2 103±3 97±4
14 100 99±2 98±2 97±3
21 100 103±8 108±6 99±5
Примечание: •••-р < 0,001 при п = 10, где п - число повторностей
В активности АсАТ также не было отмечено достоверных изменений во всех исследуемых дозах на протяжении всего эксперимента.
Таблица 3
Влияние дельта-эндотоксина на активность аланинаминотрасфе-разы в крови лабораторных мышей
Сутки Изменение активности АлАТ, % в зависимости от дозы токсина, мг/кг
Контроль (без токсина) 25 50 100
1 100 98±10 106±4 109±23
7 100 118±5 133±13 130±11
14 100 97±13 111±12 91±22
221 100 100±11 96±12 98±8,8
Примечание: ‘‘‘-р < 0,001 при n = 10, где n - число повторностей
Также отсутствуют достоверные изменения для всех исследуемых дозах на протяжении всего эксперимента в активности АлАТ. во всех исследуемых дозах на протяжении всего опыта.
Таким образом, не отмечено существенных изменений активности ЛДГ, АсАТ и АлАТ в сыворотки крови животных для всех исследованных доз на протяжении всего эксперимента. Следовательно, можно констатировать, что в таких количествах дельта-эндотоксин не вызывает разрушения клеток и органов и тканей. Наши результаты подтверждаются ранее полученными данным, согласно которым не было установлено непосредственного токсического эффекта дельта-эндотоксина в высоких дозах
(1000, 500 и 250 мг на кг массы животного) in vitro на клетки крови. Токсин также не оказывал влияния на жизнеспособность эритроцитов периферической крови животных [7]. Угнетающее действие B. thuringiensis in vivo в очень высоких дозах связано, вероятно, с неспецифической реакцией организма на чужеродный белок, способный проникать в кровоток. В малых дозах дельта-эндотоксин не влияет на состояние организма, в средних дозах обладает некоторым иммуностимулирующим действием, а в больших угнетает иммунную систему организма [8] .
Литература
1.Харвуд К. Р. Бациллы. Генетика и биотехнология. М.: Мир. 1992. 530 с.
2.Новожилова О.С. Автореф. дис... канд. биол. наук. Уфа., 2007., 122 с.
3.Бочкарева А.В., Зимин Ю.В., Хомутов А.Е. // Биоло-гия.2008, №5, 86-88 с.
4.Северина, Г.А. Кочетова, М. Функциональная активность ферментов и пути ее регуляции / Под. ред. С.Е. Северина, Г.А. Кочетова. М.: Изд-во МгУ.198і. 180 с.
5.Бардюкова Т.В., Зайцев СЮ., Максимов В.И.
//Ветеринарная медицина//.2006, №2. С. 28.
бМеньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М; 1987, 197 с.
7. Феклина М. С. Действие дельта-эндотоксина на активность клеток периферической крови in vivo и in vitro / М. С. Феклина, Д. В. Каменек, Э. К. Юнусова, Л. К. Каменек , УлГУ. Ульяновск, 2008. 17 с. Деп. в ВИНИТИ 12.05.08 №407.В2008.
8. Феклина М. С. Изменение активности клеток крови под действием дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis / Л. К. Каме-нек, Э. К. Юнусова, Л.Ю.Савельева, В.В. Ногичева // Материалы II Международной научно-практической конференции «Постге-номная эра в биологии и проблемы биотехнологии». Казань: КГУ, 2008. С. 139-140.
9.Каменек Л.К. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis: строение, свойства и использование для защиты растений // Автореф. дисс. докт. биол. н. М., 1998. 40 с.
10.Каменек Л.К. Изучение механизма действия дельтаэндотоксина Bacillus thuringiensis на насекомых // Автореф. дис... канд. биол. н. Л. 1985. 19 с.
УДК 618.2-07
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ БЕРЕМЕННОЙ И ПЛОДА В ПОЗДНИЙ ГЕСТАЦИОННЫЙ ПЕРИОД
А.Н.ЕРОХИН А.Н., Н.В.МЕЗЕНЦЕВА**
Ключевые слова: поздний гестационный период
Особенно актуальным для акушерской практики является разработка комплексной системы пренатальной диагностики. При этом, по мнению ряда авторов, данная система не может быть единообразной у всех, т.к. многие факторы должны быть приняты во внимание: возраст женщины, ее семейный анамнез, состояние репродуктивной системы и др. [1]. Традиционные методы диагностики - ультразвуковой скрининг, функциональные тесты, допплерометрия маточных и плодовых сосудов, многочисленные биохимические показатели - отражают в большей степени частные вопросы диагностики [2,3]. Вместе с тем системный характер гестационных осложнений диктует необходимость интегративных свойств метода, который должен: давать возможность оценивать механизмы регуляции на уровне целого организма, отражать индивидуальные особенности функционирования на этом уровне, быть простым, безопасным, неинвазивным, т.е. пригодным для мониторинга и обладать достаточной информативностью и воспроизводимостью результатов [4]. Особый интерес в плане современных подходов к разработке диагностических методов в акушерстве представляют психосоматические взаимосвязи, реализующиеся в процессе беременности [5]. Функциональное состояние вегетативной нервной системы
Работа выполнена по гранту Министерства образования и науки Российской Федерации, Федерального агентства по образованию, в рамках проекта: «Разработка теоретических основ экологически безопасного регулирования численности вредных организмов дельта-эндотоксинами В асіїїш Шиті^іешів» (код организации: 296, коды ГРНТИ: 62.09.39) Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. ак. Г.А. Илизарова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», г. Курган, 640014, ул М. Ульяновой 6, т. (3522)580880, МУ «Городская больница №2», г. Курган
беременной также оказывает влияние на функциональное состояние плода. Современная система пренатальной диагностики должна сочетать в себе с одной стороны безопасность и информативность, а с другой - комплексность и интегративность, что обеспечивает индивидуальность подхода при сохранении единой методологической базы.
Цель - изучение функционального состояния вегетативной нервной системы и психовегетативного статуса беременных в поздний гестационный период и родильниц в ранний послеродовой период; функционального состояния плода.
Материал и методы. Обследованы 30 беременных в поздний гестационный период, средний возраст которых составил 24,8+0,8 лет. Посредством теста Айзенка определяли психотип беременных, тест САН (самочувствие, активность, настроение) применяли для определения общего уровня работоспособности, опросник Вейна использовали для оценки вегетативного статуса, функциональное состояние плода определяли на основе анализа показателей, полученных при кардиотокографии посредством фетального монитора Sonical Team (ООО «Оксфорд Медикал», Россия, 2004). Вычисляли среднюю и ошибку средней указанных показателей, для определения взаимосвязи между массивами нормированных данных использовали коэффициент корреляции Пирсона. Посредством вариационной пульсометрии [6] в
покое и при ортопробе регистрировали показатели, характеризующие тонус вегетативной нервной системы - моду (Мо, с), амплитуду моды (АМо,%), вариационный размах (ВР,с), индекс напряжения (ИН=АМо/2ВРхМо, у.е.) , а также определяли вегетативную реактивность (ИР) по динамике индекса напряжения в процессе ортопробы. Вычисляли среднюю и ошибку средней этих показателей. Показатели определяли в выборке за 5-7 дней до родов и через 4-5 дней после родов. Статистические различия между данными периодами исследования у одних и тех же пациенток определяли посредством парного t-критерия Стьюдента.
Результаты. При анализе данных показателей выяснилось, что амплитуда моды, отражающая активность симпатического отдела вегетативной нервной системы в положении лежа уменьшается: от 51,8+3,9% в дородовом до 40,2+2,7% в послеродовом периоде (р<0,02), в положении стоя напротив увеличивается: от 43,8+3,6 % до 53,4+3,9% (р<0,1). (рис.1).
Рис.1. Динамика амплитуды моды (АМо,%) в до- и послеродовом периодах
Вариационный размах, характеризующий активность парасимпатического отдела вегетативной нервной системы в покое статистически достоверно увеличивается от 0,12+0,01 с до 0,22+0,02 с (р<0,003), а в положении стоя проявляет тенденцию к уменьшению от 0,16+0,02 с до 0,13+0,02 с (р<0,17) (рис.2). Своеобразной динамикой отличался индекс напряжения (рис.3) - ИН - суммарный показатель, отражающий степень напряжения регуляторных механизмов организма. В покое он статистически достоверно снизился с 411,0+64,1 у.е. до 168,8+38,8 у.е. (р<0,005) и по сути дела вышел из диапазона, соответствующего чрезмерному перенапряжению всех регуляторных механизмов целостного организма и вплотную подошел к рубежу, характерному для умеренного преобладания тонуса симпатического отдела вегетативной нервной системы (от 90 до 160 условных единиц). Вместе с тем, при нагрузке (в положении стоя) этот показатель проявил тенденцию к повышению от 359,0+91,7 у.е. до 611,8+162,2 у.е. (р<0,23). В динамике показателя, характеризующего функциональную основу реактивности (ИР), отразилось статистически достоверное смещение в сторону гиперсимпатикотонии - индекс реактивности вырос от 0,9+0,17 до 4,8+1,27 у.е. (р<0,007) (рис.4).
Оценивая в целом изменения функционального состояния вегетативной нервной системы беременных женщин в перинатальный период, следует отметить, что трофотропная и эрготроп-ная функции претерпевают разнонаправленную динамику. Если в вегетативном обеспечении в состоянии покоя четко прослежива-
