CC BY
12
УДК 57.083.16:579.64:636.2(470.47)
УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ МЕТОД ПО ГАНС КРИСТИАНУ ГРАМУ ПРИ ОКРАСКЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КОШКИ
КУЛЯСОВ П.А.,
кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры ветеринарии ФГБОУ ВО «Калмыцкий государственный университет им. Б.Б. Городовикова», тел. 89374677107, e-mail: Pakulasov@mail.ru.
БОЛАЕВ В.К.,
кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры зоотехнии ФГБОУ ВО «Калмыцкий государственный университет им. Б.Б. Городовикова», тел. 89613982359, e-mail: v.bolaev@mail.ru.
ХОДЖАЕВ В.Ю.,
магистрант кафедры зоотехнии ФГБОУ ВО «Калмыцкий государственный университет им. Б.Б. Городовикова» тел. 89615984689, e-mail: hodyaev@mail.ru.
ДЖАНАЕВ А.А.,
магистрант кафедры зоотехнии ФГБОУ ВО «Калмыцкий государственный университет им. Б.Б. Городовикова», тел. 896139753348, e-mail: yanaev@mail.ru.
ДЖАНАЕВА А.В.,
магистрант кафедры зоотехнии ФГБОУ ВО «Калмыцкий государственный университет им. Б.Б. Городовикова», тел. 89615982360, e-mail: yanaeva@mail.ru.
Реферат. Окраска по усовершенствованному методу Ганс Кристиана Грама с добавлением вместо генцианвиолета красителя синего цвета - метиленового синего, а вместо фуксина Пфейффера красителя красного цвета - сафранина, позволило нам под оптической иммерсионной системой светового бинокулярного микроскопа с кратностью увеличения от 1000 кратности раз, увидеть особые жгутообразные формы палочковидных форм микробов, способных создавать неразрывную цепь из своих мельчайших микробных тел. Данные микроорганизмы, опоясывая внутренний паренхиматозный орган (печень, почки, селезенку), сдавливают прохождения кровеносных и лимфатических сосудов, нарушая, таким образом, питания органа, что приводит к омертвлению отдельных участков живой ткани. Разорвав эту цепь, с помощью биологических методов, например антибиотиков мы можем спасти заболевшее животное от гибели. Взятый хирургическим путем патологический материал от заболевшей злокачественным новообразованием кошки и путем микробиологических лабораторных исследований, позволило нам, в короткий период (18-20 часов) вырастить из ее содержимого палочковидных микробов, способных образовывать удлинения в виде цепей, создавая плотные скопления микробных тел или микробные жгуты. Задача ветеринарного врача заключается в том, чтобы путем окраски по усовершенствованному методу Грама выявить данных микробов из злокачественной опухоли и, используя антимикробные средства добиться выздоровления животного.
Ключевые слова: новообразование, микробная культура, микроскоп, среда Чапека, окраска по Граму, генцианвиолет, метиленовый синий, раствор Люголя, спирт этиловый, фуксин Пфейффера, фуксин Циля, красный сафранин, спиртовка, глюкоза.
AN IMPROVED METHOD BY HANS CHRISTIAN GRAM FOR COLORING A MALIGNANT NEOPLASM OF THE CAT'S BREAST
KULYASOV P.A.,
candidate of Veterinary Sciences, Associate Professor of the Department of Veterinary Medicine, FSBEI HE "Kalmyk State University named after Bb Gorodovikova, tel. 89374677107, e-mail: Pakulasov@mail.ru.
BOLAEV V.K.,
candidate of Agricultural Sciences, Associate Professor, Department of Zootechnics, FSBEI HE "Kalmyk State University named after Bb Gorodovikova, tel. 89613982359, e-mail: v.bolaev@mail.ru.
Khodzhayev V.Yu.,
master student of the Department of Zootechnics, FSBEI HE "Kalmyk State University them. Bb Gorodovikova "tel. 89615984689, e-mail: hodyaev@mail.ru.
DZHANAEV A.A.,
master student of the Department of Zootechnics, FSBEI HE "Kalmyk State University them. Bb Gorodovikova, tel. 896139753348, e-mail: yanaev@mail.ru.
DZHANAEVA A.V.,
master student of the Department of Zootechnics, FSBEI HE "Kalmyk State University them. Bb Gorodovikova, tel. 89615982360, e-mail: yanaeva@mail.ru.
Essay. Coloring by the improved method of Hans Christian gram with the addition of a blue dye instead of gentian violet - methylene blue, and a red dye instead of Pfeiffer fuchsin - safranin, allowed us to see under the optical immersion system of a light binocular microscope with a magnification factor of 1000 times, special flagellate forms of rod-shaped forms of microbes that can create an unbroken chain of their smallest microbial bodies. These microorganisms, encircling the internal parenchymal organ (liver, kidney, spleen), compress the passage of blood and lymphatic vessels, thus disrupting the nutrition of the organ, which leads to the necrosis of individual sections of living tissue. By breaking this chain, using biological methods, such as antibiotics, we can save a sick animal from death. Surgically taken pathological material from a cat with a malignant neoplasm and by microbiological laboratory studies, allowed us, in a short period (18 hours) to grow from its contents rod-shaped microbes that can form elongations in the form of chains, creating dense clusters of microbial bodies or microbial bundles. The task of a veterinarian is to identify these microbes from a malignant tumor by coloring according to the improved gram method and using antimicrobial agents to achieve recovery of the animal.
Keywords: neoplasm, microbial culture, microscope, Chapek medium, gram staining, gentian violet, methylene blue, Lugol solution, ethyl alcohol, Pfeiffer fuchsin, ZIL fuchsin, red safranin, alcohol lamp, glucose.
Введение. Проникая в живые ткани организма, микробы разрушают целостность клеток и превращают их из: типичных в атипичные. Возникает раковое новообразование, способное от неблагоприятных факторах разрастаться до неимоверных размеров. Быстрый рост пораженных тканей постоянно сужает все близлежащие кровеносные сосуды. Прекращается поступление в пораженную область питательных и защитных соединений, что приводит к заражению и разрастанию близлежащих тканей [9].
Для своего питания микробы используют биологические составные, в том числе и глюкозу, получаемую из других областей тела. Постепенно передвигаясь по кровеносным, но чаще, по лимфатическим сосудам, палочковидные микробы охватывают большие участ-
ки организма, нарушая тем самым все жизненно важные функции всех его внутренних структур. Лейкоциты (движущиеся клетки), способны уничтожить любого вредоносного микроба, но, справится с огромной «стаей» микробов им не под силу.
Материалы и методы исследования. Экспериментальная работа проводилась в смежных лабораториях №219 и №229 Аграрного факультета «КалмГУ». Оперативным хирургическим путем в ветеринарной клинике была оперирована молочная железа кошки с наличием в ней опухолевидного разрастания [9,10]. В течение 2-х часов был взят патологический материал, доставлен в кабинет №229, помещен в стеклянные пробирки и поставлен для дальнейшего роста микробной культуры в термостат при температуре 370С (рисунок 1).
Рисунок 1 - Опухолевидное новообразование молочной железы кошки
Для разведения и получения чистой микробной колонии готовилась среда Чапека. Отдельно приготовленная среда Агар-агар не годится, так как в состав его входят только полисахариды, полученные из сухих морских водорослей, а для быстрого размножения микробов необходимы дополнительные питательные вещества.
Для этого, в кипящую воду, объемом 1 л добавляли сухой порошок среды Чапека в количестве 50 г, изготовленную заводским путем из следующих компонентов: воды дистиллированной - 1000 мл, тростникового сахара - 30 г, ди-гидроортофосфата калия - 1 г, сульфата магния - 0,5 г, хлорида калия - 0,5 г, сульфата железа -0,01 г.
Хорошо размешивали содержимое, до полного растворения сухого порошка в воде, процеживали чуть остывший бульон через двойную марлю и разливали в 5 стеклянных пробирок с резиновыми пробками и помещали в автоклав для 20 мин стерилизации при 1 атм. Данный метод необходим для уничтожения сопутствующей воздушной микрофлоры, попавшей в пробирки воздушно-капельным путем. После остывания стеклянных пробирок в них, с соблюдением правил работы с микроорганизмами, проводился посев 18-ти часовой микробной культуры, предварительно выращенной в термостате при температуре 370С. Брали бактериологиче-
скую петлю, фламбировали ее в пламени огня спиртовки с наличием в ней 96%-го этилового спирта (С2Н5ОН) до покраснения металлической петли. Пробирку удерживали пальцами левой руки, вблизи огня спиртовки открывали резиновую пробку, обеззараживали огнем горлышко пробирки и металлическую петлю в течение нескольких секунд. Не касаясь стенок стеклянной пробирки, правой рукой просовывали бактериальную петлю и захватывали часть бульонной микробной культуры. Наносили ее в каплю дистиллированной воды, нанесенной на поверхность предметного стекла. Бактериологическую петлю, прежде чем убрать, подвергалась обеззараживанию в огне, опять же, до покраснения металлической части. Пинцетом захватывали за край предметного стекла с микробной культурой и осторожно подносили ее сверху пламени огня, на расстоянии ширины ладони исследуемого и аккуратно высушивали препарат. Предметное стекло с сухой микробной культурой помещали на мостик кюветки и ждали 5-10 мин, пока оно остынет и будет доступным для окрашивания. Поверх пятна клали аккуратно вырезанный квадратик белой фильтровальной бумаги и приступали к окраске сложным диагностическим методом по датскому ученому Ганс Кристиану Граму (1884).
Данный метод был максимально усовершенствован и дополнен нами в кабинетах лабораторий №219 «Технология и переработка продукции растениеводства» и №229 «Микробиология» с заменой двух красителей, первого -генцианвиолет поменяли на метиленовый синий, и четвертого - фуксин Пфейффера заменили на красный краситель сафранин. Окрашивание усовершенствованным методом позволяет получить более четкую и лучше окрашенную микробную культуру. Излишки использованных красителей хорошо вымываются дистиллированной водой и спиртом 96%-ой концентрации [3,4].
Сложный диагностический метод окрашивания по Граму:
1. Краситель фиолетового цвета - генциан-виолет - 2 мин.
2. Раствор Люголя - 2 мин, состоит из:
а) йод кристаллический - 1 г;
б) йодистый калий - 2 г;
в) вода дистиллированная - 300 мл.
3. Этиловый спирт 96%-ой концентрации -30 сек.
Первый раз обильно промываем препарат дистиллированной водой.
3. Краситель красного цвета - фуксин Пфейффера - 2 мин., состоит из:
а) фуксина Циля - 1 мл;
б) вода дистиллированная - 9 мл.
Фуксин Циля состоит из:
а) фуксин основной сухой кристаллический красный - 1г;
б) спирт этиловый 96%-ой концентрации -10 мл;
в) фенол (карболовая кислота) сухой кристаллический порошок - 5г;
г) глицерин, густая тягучая жидкость - 5 мл;
д) вода дистиллированная - 100 мл.
Вместо генцианвиолета, мы рекомендуем
использовать метиленовый синий (легко смывающийся водой) а вместо фуксина Пфейффера - сухой красный порошок сафранин (не оставляющий пятен).
Второй раз обильно промываем препарат дистиллированной водой, для полного смывания красителя [1,2].
Приготовленный окрашенный мазок фиксировали (высушивали) над пламенем огня спиртовки (96% этанол) до полного его высушивания. Фиксация микробного мазка преследовала три основные цели:
1. Убить живых микробов, вирулентного характера.
2. Мертвые микробы лучше пропитываются и окрашиваются красителями.
3. Для прочного удерживания микробной культуры на предметном стекле.
Близко приближать мазок к пламени спиртовки ни в коем случае нельзя, по причине его неминуемого и быстрого растрескивания. Это подтверждается при микроскопии под световым микроскопом характерным наличием в поле видимости окуляра (10х и объектива 100х), при увеличении в 1000х кратности раз тонких и заостренных с обоих концов прямых или чуть изогнутых темного цвета узких полосок (рисунок 2).
Сравнить это явление можно с так называемым процессом растрескивания дна высохшей лужи от палящих солнечных лучей в жаркий период времени года, которая после полного испарения воды оставляет тонкие, ровные и беспорядочно отмеченные трещины высохшего грунта.
Фиксацию готовых окрашенных мазков проводили двумя аналогичными способами:
1. Физическим - при помощи пламени огня спиртовки с наличием 96%-го этилового спирта;
2. Химическим - при помощью смеси Никифорова (равные части 1:1 этилового спирта 96%-ной концентрации и эфира применяемого для наркоза). Предметное стекло с окрашенным микробным мазком опускали в спирто-эфирную жидкость и после непродолжительного (несколько секунд) выдерживания вынимали и ожидали полного испарения и высыхания. Этиловый спирт + наркотический эфир почти моментально испаряются на воздухе, что обеспечивает прочную и надежную фиксацию препарата [5,6,7].
Рисунок 2 - Неправильная окраска микробного мазка
Окрашенная и зафиксированная физическим или химическим путями микробная культура отныне называется - мазок [2].
После завершения первой основной части лабораторных работ (окрашивания), когда на мазке предметного стекла анилиновыми красителями были отмечены возможные бактерии, незамедлительно приступили к завершающему этапу микробиологических исследований, а именно, к рассматриванию микроскопической картины в световой бинокулярный (два окуляра + два тубуса) оптический микроскоп [8].
Наблюдая в окуляр 10х, достаточно оперативно смогли запечатлеть и сфотографировать микроскопический мир исследуемого объекта.
Были обнаружены различные палочковидные формы микробов. При окрашивании по усовершенствованному методу Грама, все микробы окрасились в красный цвет, т.е. по определению Гр (-) отрицательные.
Рисунок 3 - Утолщенные жгуты палочковидных форм микробов при злокачественной раковой опухоли молочной железы кошки
Результаты исследования и их обсуждение. Экспериментальные исследования, проведенные в кабинете лаборатории «Микробиология» позволили выяснить следующие основные закономерности палочковидных форм микробов. Было визуально, через оптическую систему микроскопа увидено, что микробы - это живые объекты и способны для своей выживаемости использовать физиологические основы для сохранения своей популяции от уничтожения.
Отмечено, что, на примере стаи морских рыб, микробы также способны сбиваться в кучу, создавая тем самым огромное число особей в одном месте. Прижимаясь, ближе друг к другу, они образуют жесткие толстые «жгуты», которые живому организму животного своими силами, невозможно разорвать. Без помощи биологических методов уничтожения микроорганизмов (вакцин, сывороток и антибиотиков) разорвать этот «замкнутый круг» микробов не представляется возможным. Опоясывая внутренний паренхиматозный орган, они, тем самым, нарушают его крово- и лимфообращения, приводя отдельные участки тканей к некрозу и омертвлению. Мертвая ткань живого тела животного - это доступная кормовая среда для дальнейшего развития палочковидных микробов.
Скрепляясь в плотные образования, они, не дают возможности защитным клеткам крови -лейкоцитам и лимфоцитам выполнять свои прямые обязанности - уничтожать чужеродного микробного возбудителя (рисунок 3).
Окраска по усовершенствованному методу Ганс Кристиана Грама позволило нам увидеть
под оптической иммерсионной системой большое разнообразие микробов и детально рассмотреть их плотные жгутообразные колоний.
Вывод. Работа была выполнена с использованием опухолевидного материала, обработанных лабораторным путем с использованием специального микроскопического лабораторного оборудования (кюветки, пробирки, микроскопы и термостаты) кабинетов №219 «Технология и переработка продукции растениеводства» и №229 «Микробиология» Аграрного факультета Калмыцкого государственного университета им. Б.Б. Городовикова.
1. Проведенная хирургическая операция при общем наркозе на кошке по удалению патологического воспалительного опухолевидного разрастания в молочной железе, позволило нам уже через несколько часов, вырастить в термостате чистую микробную культуру палочковидных форм и выявить особые закономерности их развития внутри живого организма высшего животного.
2. Используя анилиновые красители, на примере метиленового синего, раствора Лю-голя, красного сафранина, окрашивая препарат по аналогичному сходному способу Ганса Кристиана Грама, можно в кратчайшие сроки выявить под увеличением светового микроскопа в 1000 кратности раз мельчайших, но хорошо видимых глазом через его оптическую систему - палочковидных форм бактерий. Они способны образовывать плотные жгуты, препятствуя тем самым поеданию лейкоцитами своих микробных тел и способных нанести ощутимый вред животному организму.
3. Собранные воедино данные, позволят дополнить недоработанные страницы учебных изданий по ветеринарной медицине, понять сущность возникновения раковых ново-
образований в целом и выяснить вредоносную патологическую роль палочковидных форм бактерий при жизни живого организма и после его смерти.
Список использованных источников
1. Руденко А.В., Генджиева О.Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учебное пособие. - Элиста, 2012. - 224 с.
2. Кулясов П.А., Босхомджиева Е.Д. Лабораторный практикум по микробиологии и микологии. Учебное пособие. - Элиста: Изд-во Калм. ун-та, 2018. - 243 с.
3. Аристовская Т.В., Владимирская М.Е., Голлербах М.М. Большой практикум по микробиологии: Учебное пособие. - М.: «Высшая школа», 1962. - 490 с.
4. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. - М.: «Колос», 1970. - 320 с.
5. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии: Учебное пособие. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. - 307 с.
6. Панкратов, А.Я. Микробиология. - М.: «Колос», 1981. - 248 с.
7. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. - М.: «Агропромиздат»,1987. - 239 с.
8. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. - М.: «Дрофа», 2005. - 256 с.
9. Эпизоотологический метод исследования / В.В. Макаров, А.В. Святковский, В.А. Кузьмин, О.И. Сухарев. - СПб.: Изд-во «Лань», 2009. - 224 с.
10. Салимов В.А. Практикум по патологической анатомии животных. - СПб.: Изд-во «Лань», 2013. - С. 256.
List of sources used
1. Rudenko A.V., Genzhieva O.B. Guide to practical classes in microbiology: a textbook // Elista. -2012. - 224 p.
2. Kulyasov P.A., Boskhomdzhieva E.D. Laboratory workshop in microbiology and mycology. Textbook. - Elista: Kalm Publishing House. University, 2018. - 243 p.
3. Aristovskaya T.V., Vladimirskaya M.E., Gollerbach M.M. A large workshop on microbiology: Textbook. - M.: "Higher School", 1962. - 490 p.
4. Mishustin E.N., Yemtsev V.T. Microbiology. - M.: Kolos, 1970. - 320 p.
5. Egorov N.S. Workshop on Microbiology: Textbook. - M.: Publishing House Mosk. University, 1976. - 307 p.
6. Pankratov, A.Ya. Microbiology. - M.: Kolos, 1981. - 248 p.
7. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Workshop on Microbiology. - M.: "Agropromizdat", 1987. - 239 p.
8. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Workshop on Microbiology // M.: "Bustard", 2005. - 256 p.
9. Epizootological research method / V.V. Makarov, A.V. Svyatkovsky, V.A. Kuzmin, O.I. Sukharev // St. Petersburg: Publishing House "Doe", 2009. - 224 p.
10. Salimov, V.A. Workshop on the pathological anatomy of animals. - St. Petersburg: Publishing House "Doe", 2013. - S. 256.
