CC BY
16
УДК 636.8.09:57.083.16:579.62
ОКРАШИВАНИЯ УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫМ МЕТОДОМ ПО ГАНС КРИСТИАНУ ГРАМУ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ
ЖИВОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗБУДИТЕЛЯ РАКОВОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КОШКИ
КУЛЯСОВ П.А.,
кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры ветеринарии ФГБОУ ВО «Калмыцкий государственный университет им. Б.Б. Городовикова»; тел. 89374677107, e-mail: Pakulasov@mail.ru.
ХАЛГАЕВА К.Э.,
кандидат сельскохозяйственных наук, ассистент кафедры АТиПСХП, ФГБОУ ВО «Калмыцкий государственный университет им. Б.Б. Городовикова»; тел. 89279941108, e-mail: halgaeva2011@mail.ru.
Реферат. Проведенные экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что молочная железа лактирующих домашних животных является самой уязвимой частью тела по возникновению в ней злокачественных раковых новообразований. Продуцируя молоко, имеющее в своем составе молочный сахар - лактозу, молочная железа является благоприятным местом для заселения в нее жгутообразных колоний бактерий. Размножаясь и становясь половозрелыми особями, в течение 20-ти часов они начинают незамедлительно формировать живые микробные жгуты различной толщины и размера. Охватывая микробной «петлей» определенный отдельный участок живой ткани и образуя плотные жгуты, микробы начинают сдавливать пораженные части - кровеносные сосуды и нервы, замедляя тем самым, а в отдельных случаях и полностью прекращая кровоток. Это приводит к обеднению пораженного органа защитными клетками крови - лейкоцитами. При сдавливании нервных сосудов, замедляется и приостанавливается поступление нервных сигналов от ЦНС в пораженную часть тела. Все эти негативные факторы постепенно приводят к угасанию живого тонуса мышечной ткани, что неминуемо приводит к гибели клеток и разрастанию такового новообразования. Злокачественная раковая опухоль домашних лактирующих животных возникает не от ранее озвученной химической теории Юстуса фон Либиха, а по причине нахождения внутри живых отделов организма - живого биологического возбудителя - жгутообразных палочковидных форм бактерий, способных при неблагоприятных факторах образовывать спору. Окраска по усовершенствованному методу Ганс Кристиана Грама с добавлением вместо генцианвиолета красителя синего цвета - метиленового синего, а вместо фуксина Пфейффера красителя красного цвета - сафранина, позволило нам под оптической иммерсионной системой светового бинокулярного микроскопа с увеличением от 1000 до 1500 кратности раз, увидеть особые жгутообразные извивающиеся петлеобразные формы палочковидных микробов. Они способны создавать неразрывные цепи из своих мельчайших микробных тел, что дает нам основание утверждать их значимую роль в возникновении злокачественных раковых новообразований.
Ключевые слова: новообразование, микробная культура, микроскоп, окраска по Граму, смесь Никифорова, мясо-пептонный бульон (МПБ), генцианвиолет, метиленовый синий, раствор Люголя, спирт этиловый, фуксин Пфейффера, фуксин Циля, красный сафранин, спиртовка, глюкоза.
COLORING BY THE IMPROVED METHOD ON HANS TO CHRISTIAN GRAM FOR IDENTIFICATION OF THE LIVING BIOLOGICAL CAUSATIVE AGENT OF CANCER BREAST CANCER OF CAT
KULYASOV P.A,
candidate of veterinary Sciences, associate Professor of the Department of veterinary medicine of the Kalmyk state University. B.B. Gorodovikova ", tel. 89374677107, e-mail: Pakulasov@mail.ru.
KHALGAEVA K.E.,
candidate of agricultural Sciences, assistant Professor Atiesh IN "Kalmyk state University B.B. Gorodovikova "; tel. 89279941108, e-mail: halgaeva2011@mail.ru.
Essay. Experimental studies have shown that the mammary gland of lactating domestic animals is the most vulnerable part of the body in the occurrence of malignant cancerous tumors in it. Producing milk, which contains milk sugar - lactose, the mammary gland is a favorable place for colonization of flagellated bacteria colonies in it. Breeding and becoming sexually mature individuals, within 20 hours they begin to immediately form live microbial tourniquets of various thicknesses and sizes. Covering a certain separate area of living tissue with a microbial "loop" and forming dense tourniquets, microbes begin to squeeze the affected parts - blood vessels and nerves, thereby slowing down, and in some cases completely stopping blood flow. This leads to depletion of the affected organ by protective blood cells - leukocytes. When squeezing nerve vessels, the flow of nerve signals from the central nervous system to the affected part of the body slows down and stops. All these negative factors gradually lead to the extinction of the living tone of muscle tissue, which inevitably leads to cell death and the growth of such a neoplasm. A malignant cancer tumor of domestic lactating animals does not arise from the previously voiced chemical theory of Justus von Liebig, but because of the presence inside the living parts of the body - a living biological agent - of flagellate rod-shaped forms of bacteria that can form spores under adverse factors. Coloring according to the improved method of Hans Christian Gram with the addition of a dye of blue color - methylene blue instead of a gentian violet, and instead of fuchsin Pfeiffer a dye of red color - safranin, allowed us to see special twisted coils under the optical immersion system of a light binocular microscope with magnification from 1000 to 1500 times loop-shaped forms of rod-shaped microbes. They are able to create inextricable chains from their smallest microbial bodies, which gives us reason to assert their significant role in the occurrence of malignant cancerous tumors.
Keywords: neoplasm, microbial culture, microscope, Gram stain, Nikiforov mixture, meat-peptone broth (MPB), gentian violet, methylene blue, Lugol's solution, ethyl alcohol, Pfeiffer fuchsin, Tsilia fuchsin, red safranin, spirit lamp, glucose.
Введение. Выдающийся немецкий ученый химик Юстус фон Либих, внесший значительный вклад в развитие органической химии утверждал, что процесс брожения, гниения и возникновения известных на тот период инфекционных болезней происходит от какой-то химической реакции, протекающей внутри живых или мертвых тел животных и людей. На основании этого им была разработана химическая теория, основанная на том, что внутри организма запускаются химические реакции, приводящие в итоге к гибели заболевшего организма. Обладая железными доказательствами и несгибаемым авторитетом, Юстус фон Либих, насаждал свое учение среди студенчества, преподавателей и просто обычных людей. Все это продолжалось до тех пор, пока его химическую теорию не попытался опровергнуть другой ученый и химик, но уже французского происхождения Луи Пастер. Проведя опыты в своей лаборатории, он доказал, что причиной бродильных и гнилостных процессов является индивидуальный живой биологический возбудитель, а не химический процесс. Своими исследованиями он
опроверг «химическую» теорию химика Ли-биха. Впоследствии, немецким медицинским врачом Робертом Кохом были найдены и открыты живые биологические возбудители таких болезней, как:
1. Сибирская язва (палочковидный микроб), способный локализоваться в трех формах: вегетативной или стадии размножения, споровой или стадии покоя и капсульной или стадия образования слизи, для защиты своего микробного тела от защитных белых клеток крови - лейкоцитов.
2. Туберкулез (палочковидная бактерия), названная впоследствии палочкой Коха;
3. Холера (извитой вибрион, в виде запятой), названная запятой Коха.
На примере возбудителя туберкулеза, можно пояснить, что палочковидная форма микроба локализуется во всех частях тела живого организма животных и людей.
Существует два заболевания в природе, поражающие все отделы (костный, мышечный, кожный, пищеварительный, дыхательный, мочевыделительный и др.) - это туберкулез и раковая опухоль. До открытия живого
биологического возбудителя туберкулеза Робертом Кохом 24 марта 1882 года в научных кругах существовало мнение, что туберкулез возникает в живом организме от протекания в нем непонятных химических реакций (теория Юстуса фон Либиха). Если корова, пораженная туберкулезом, погибает и, при благоприятных условиях внешней окружающей среды (плюсовая температура и оптимальная влажность) начинает разлагаться и гнить, то, по мнению Либиха, это, якобы химический процесс. И только после обнаружения, путем окрашивания материала, взятого из пораженных частей легкого умершего от туберкулеза человека, Роберт Кох, основываясь на учении Луи Пастера, доказал, что виновником гибели является - живой биологический микроб, а значит это - биологический процесс.
Аналогичная картина наблюдается и со злокачественными раковыми опухолями, так как до сегодняшних дней ученый мир считает, основываясь на учении Юстуса фон Либиха, что смерть пораженных раком животных и людей происходит от самых разнообразных химических факторов, без наличия живого биологического возбудителя. Получается, что туберкулез, как болезнь, возникает, как считалось ранее, от протекающих химических процессов, но после открытия Робертом Кохом живого микроба мнение людей резко поменялось, и они стали признавать биологическую роль в распространении заболевания. До Роберта Коха более сотни ученых из различных стран, смотрели в оптические системы микроскопов, с горечью констатировали, что никаких микробов они не увидели. И только Роберт Кох, взявшись со всей ответственностью за это дело, первым в микроскопии применив окраску препаратов красителем - метилено-вым синим, смог увидеть слегка изогнутые мелкие палочки синеватого цвета. Оказавшись смышленей других микробиологов Роберту Коху с его немецкой педантичностью и аккуратностью удалось путем окраски выявить живого биологического возбудителя самого неразгаданного на тот период инфекционного заболевания и доказать, что туберкулез - это болезнь не химического, а биологического происхождения.
Из этого следует, что возможной причиной злокачественных раковых новообразований, возникновение и развитие которых идет по химическому пути (теория Юстуса фон Либи-ха), на самом деле, также может иметь живого биологического возбудителя. Проводимые
многочисленные микробиологические исследования по обнаружению живого микроба в лаборатории Калмыцкого госуниверситета, подтверждают эти выводы.
Основываясь на своем 17-летнем опыте работы с микробами, нами доказывается совершенно иная теория возникновения злокачественной раковой опухоли, где основным и главным приоритетом является наличие внутри опухоли не химических составляющих, а живого биологического возбудителя - палочковидного микроба.
Цель - доказать нахождение внутри опухолевидного ракового разрастания оперированной молочной железы кошки специфичных для данного заболевания многочисленных жгутообразных колоний спорообразующих микробов палочковидной формы.
Материалы и методы исследования. Экспериментальная работа проводилась в смежных лабораториях №219 и №229 Аграрного факультета Калмыцкого государственного университета. Хирургическим путем в ветеринарной клинике (Элистинская городская станция по борьбе с болезнями животных, ул. Физкультурная, 27) была прооперирована молочная железа кошки с наличием в ней опухолевидного злокачественныго разрастания [9, 10]. В течение 2-х часов был взят патологический материал и оперативно доставлен в кабинет №229, где был внесен в чашку Петри и помещен для дальнейшего роста чистой колонии микробной культуры в термостат при температуре 370С (рисунок 1).
г
Рисунок 1 - Злокачественное опухолевидное новообразование молочной железы кошки
Для разведения чистых микробных культур готовился мясо-пептонный бульон (МПБ). Отдельно приготовленная среда агар-агар не годится, так как в состав его входят только полисахариды, полученные из сухих бурых морских водорослей, а для быстрого размножения микробов необходимы дополнительные питательные вещества.
Для этого, в кипящую воду объемом 1 л добавляли сухой порошок МПБ в количестве 50 г, изготовленный заводским путем из крови убойных животных, стерилизованный и плотно запечатанный в пластмассовые емкости. Содержимое МПБ хорошо размешивали, до полного растворения сухого порошка в кипящей воде, процеживали чуть остывший бульон через двойную марлю или сито с мелкими порами и разливали в 5 стеклянных пробирок с резиновыми пробками, затем помещали в автоклав на 20 мин для стерилизации при 1 атм (12О0С). Данный метод необходим для уничтожения сопутствующей воздушной микрофлоры, попавшей в пробирки воздушно-капельным путем. После остывания стеклянных пробирок в них, с соблюдением правил работы с микроорганизмами, проводился посев 18-ти часовой микробной культуры, предварительно выращенной в термостате при температуре 37 С. Брали бактериологическую петлю, фламбировали ее в пламени огня спиртовки с наличием в ней 96%-го этилового спирта (С2Н5ОН) до покраснения металлической петли. Пробирку удерживали пальцами левой руки, вблизи огня спиртовки открывали резиновую пробку, обеззараживали огнем горлышко пробирки и металлическую петлю в течение нескольких секунд. Не касаясь стенок стеклянной пробирки, правой рукой просовывали бактериальную петлю и захватывали часть бульонной микробной культуры. Разводили ее в капле дистиллированной воды, нанесенной на поверхность предметного стекла. Бактериологическую петлю прежде, чем убрать, подвергались обеззараживанию в огне спиртовки, опять же, до покраснения металлической части. Пинцетом захватывали за край предметного стекла с микробной культурой и осторожно подносили сверху пламени огня, на расстоянии ширины ладони исследуемого и аккуратно подсушивали микробиологический препарат. Предметное стекло с сухой микробной культурой помещали на мостик кюветки и ждали 5 мин, пока оно остынет и будет доступным для дальнейшего окрашивания анилиновыми красителями. По-
верх пятна клали аккуратно нарезанный квадратик белой фильтровальной бумаги и приступали к окраске сложным диагностическим методом по датскому ученому Ганс Кристиану Граму (1884).
Данный метод был максимально усовершенствован и дополнен нами в кабинетах лабораторий № 219 «Технология и переработка продукции растениеводства» и №229 «Микробиология» с заменой двух красителей, первый - генцианвиолет поменяли на метилено-вый синий, и четвертый - фуксин Пфейффера заменили на красный краситель сафранин. Окрашивание усовершенствованным методом позволяет получить более четкую и лучше окрашенную микробную культуру, без красящихся размывов. Излишки использованных красителей хорошо вымываются дистиллированной водой и спиртом 96 %-ой концентрации [3, 4].
Сложный диагностический метод окрашивания по Граму:
1. Краситель фиолетового цвета - генци-анвиолет (метиленовый синий) - 2 мин.
2. Раствор Люголя - 2 мин, состоит из:
а) йод кристаллический - 1 г;
б) йодистый калий - 2 г;
в) вода дистиллированная - 300 мл.
3. Этиловый спирт 96%-ой концентрации - 30 сек.
Первый раз обильно промываем препарат дистиллированной водой.
4. Краситель красного цвета - фуксин Пфейффера (сафранин) - 2 мин., состоит из:
а) фуксин Циля - 1 мл;
б) вода дистиллированная - 9 мл.
5. Фуксин Циля состоит из:
а) фуксин основной сухой кристаллический красный - 1 г;
б) спирт этиловый 96 %-ой концентрации -10 мл;
в) фенол (карболовая кислота) сухой кристаллический порошок - 5 г;
г) глицерин, густая тягучая жидкость - 5
мл;
д) вода дистиллированная - 100 мл.
Вместо генцианвиолета мы рекомендуем
использовать метиленовый синий (легко смывающийся водой) а вместо фуксина Пфейффе-ра - сухой красный порошок сафранин (не оставляющий пятен).
Второй раз обильно промываем препарат дистиллированной водой для полного смывания красителя [1, 2].
Приготовленный окрашенный мазок фиксировали (высушивали) над пламенем огня спиртовки (96 % этанол) до полного его высушивания. Фиксация микробного мазка преследовала три основные цели:
1. Убить живых микробов вирулентного характера.
2. Мертвые микробы лучше пропитываются и окрашиваются красителями.
3. Для прочного удерживания микробной культуры на предметном стекле.
Близко приближать мазок к пламени спиртовки ни в коем случае нельзя, по причине его неминуемого и быстрого растрескивания. Это подтверждается при микроскопии под световым микроскопом характерным наличием в поле видимости окуляра (10х и объектива 100х), при увеличении в 1000х кратности раз или (15х и объектива 100х), при увеличении в 1500х кратности раз тонких и заостренных с обоих концов прямых или чуть изогнутых темного цвета узких полосок (рисунок 2).
/1
ж-
V \
Рисунок 2 - Неправильная окраска микробного мазка
Сравнить это явление можно с так называемым процессом растрескивания дна высохшей лужи от палящих солнечных лучей в жаркий период времени года, которая после полного испарения воды оставляет тонкие, ровные и беспорядочно отмеченные трещины высохшего грунта.
Фиксацию готовых окрашенных мазков проводили двумя аналогичными способами:
1. Физическим - при помощи пламени огня спиртовки с наличием 96%-го этилового спирта;
2. Химическим - при помощью смеси Никифорова (равные части 1:1 этилового спирта 96%-ной концентрации и эфира, применяемого для наркоза). Предметное стекло с окрашенным микробным мазком опускали в спирто-эфирную жидкость и после непродолжительного (несколько секунд) выдерживания вынимали и
ожидали полного испарения и высыхания. Этиловый спирт + наркотический эфир почти моментально испаряются на воздухе, что обеспечивает прочную и надежную фиксацию препарата [5, 6, 7].
Окрашенная и зафиксированная физическим или химическим путями микробная культура отныне называется - мазок [2].
После завершения первой основной части лабораторных работ (окрашивания), когда на мазке предметного стекла анилиновыми красителями были отмечены возможные бактерии, незамедлительно приступили к завершающему этапу микробиологических исследований, а именно, к рассматриванию микроскопической картины в световой бинокулярный (два окуляра + два тубуса) оптический микроскоп [8].
Наблюдая в окуляр 10х, достаточно оперативно смогли запечатлеть и сфотографировать микроскопический мир исследуемого объекта.
Были обнаружены однотипные палочковидные формы микробов, вьющие различной толщины жгуты. При окрашивании по усовершенствованному методу Грама, все микробы окрасились в красный цвет, т.е. по определению Гр (-) отрицательные.
Результаты исследования и их обсуждение. Экспериментальные исследования позволили выяснить следующие основные закономерности палочковидных форм микробов. Было визуально, через увеличительную оптику (окуляры, объективы) светового микроскопа увидено, что жгутообразные микробы - это живые микроскопические организмы, способные для своей выживаемости использовать физиологические нормы и питательные элементы высшего живого млекопитающего.
Отмечено, что, на примере стаи морских рыб, микробы также способны сбиваться в кучу, уплотняясь в количестве, создавая тем самым огромное число особей в одном месте. Прижимаясь ближе друг к другу, они образуют жесткие толстые «жгуты», которые живому организму животного своими силами невозможно разорвать. Без помощи биологических методов уничтожения микроорганизмов (вакцин, сывороток и антибиотиков) разорвать этот «замкнутый круг» микробов не представляется возможным. Опоясывая внутренний паренхиматозный орган, они, тем самым, нарушают его крово- и лимфообращения, приводя отдельные участки тканей к некрозу и омертвлению. Мертвая ткань живого тела животного - это доступная кормовая среда для дальнейшего развития палочковидных форм микробов.
Рисунок 3 - Жгутообразные петли палочковидных форм микробов при злокачественной раковой опухоли молочной железы кошки
Рисунок 4 - Ярко-красный антибиотик, полученный из зерен пшеницы
Скрепляясь в плотные образования, они не дают возможности защитным клеткам крови -лейкоцитам и лимфоцитам выполнять свои прямые обязанности - уничтожать чужеродного микробного возбудителя (рисунок 3). Дополнительно к этому, при неблагоприятных условиях для своей жизнедеятельности жгу-тообразные бактерии способны образовывать споры - защитную оболочку, спасающие их на несколько десятилетий.
Окраска по усовершенствованному методу Ганс Кристиана Грама позволило нам увидеть под оптической иммерсионной системой большое число микробов и детально рассмотреть их плотные жгутообразные колонии. Единственным безопасным антибактериальным препаратом, используемым человеком для подавления жгутообразных форм микробов, является ярко-красный антибиотик, выделяющийся из слизи-сто-плесневого грибка, растущего внутри сычуга млекопитающих, внутри корневой системы
растений и в растворе химических стойких хлористых соединений (ХСХС) пшеничных зерен (рисунок 4).
Вывод. Работа была выполнена из опухолевидного материала, обработанного лабораторным путем с использованием специального микроскопического лабораторного оборудования (чашки Петри, кюветки, пробирки, световые микроскопы и термостаты) кабинетов №219 «Технология и переработка продукции растениеводства» и №229 «Микробиология» Аграрного факультета Калмыцкого государственного университета им. Б.Б. Городовикова.
1. Проведенная хирургическая операция при общем наркозе на кошке по удалению патологического воспалительного опухолевидного разрастания в молочной железе, позволила нам уже через несколько часов вырастить в термостате чистую микробную культуру палочковидных форм и выявить особые закономерности их
развития внутри живого организма высшего животного.
2. Используя анилиновые красители, на примере метиленового синего, раствора Люго-ля, красного сафранина, окрашивая препарат по аналогичному сходному способу Ганса Кристиана Грама, можно в кратчайшие сроки выявить под увеличением светового микроскопа в 1000-кратности раз мельчайших, но хорошо видимых глазом через его оптическую систему палочковидных форм бактерий. Они способны образовывать плотные жгуты, препятствуя тем самым поеданию лейкоцитами своих микробных тел и способных нанести ощутимый губительный вред животному организму.
3. Собранные воедино данные, позволят дополнить недоработанные страницы учебных изданий по ветеринарной медицине, понять сущность возникновения раковых новообразований в целом и выяснить вредоносную патологическую роль палочковидных форм бактерий при жизни живого организма и после его смерти.
4. Наблюдая скопления жгутообразных бактерий со спорами, нами было высказано предположение, что раковая опухоль - это не что иное, как естественный инкубатор для дальнейшего насаждения в нем чистых микробных колоний жгутообразных форм.
Список использованных источников
1. Руденко А.В. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: учебное пособие // Элиста, 2012. - 224 с.
2. Кулясов П.А., Босхомджиева Е.Д. Лабораторный практикум по микробиологии и микологии: учебное пособие // Элиста: Изд-во Калм. ун-та, 2018. - 243 с.
3. Аристовская Т.В., Владимирская М.Е., Голлербах М.М. Большой практикум по микробиологии: учебное пособие. - М.: «Высшая школа», 1962. - 490 с.
4. Мишустин Е.Н. Микробиология. - М.: «Колос», 1970. - 320 с.
5. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии: учебное пособие. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. - 307 с.
6. Панкратов А.Я. Микробиология. - М.: «Колос», 1981. - 248 с.
7. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. - М.: «Агро-промиздат»,1987. - 239 с.
8. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. - М.: «Дрофа», 2005. - 256 с.
9. Эпизоотологический метод исследования / В.В. Макаров, А.В. Святковский, В.А. Кузьмин, О.И. Сухарев. - СПб.: Изд-во «Лань», 2009. - 224 с.
10. Салимов В.А. Практикум по патологической анатомии животных. - СПб.: Изд-во «Лань». -2013. - С. 256.
List of sources used
1. Rudenko A.V. Guide to practical classes in microbiology: a training manual // Elista, 2012. - 224 p.
2. Kulyasov P.A., Boskhomdzhieva E.D. Laboratory workshop on microbiology and mycology: a training manual // Elista: Kalm Publishing House. University, 2018 .-- 243 p.
3. Aristovskaya T.V., Vladimirskaya M.E., Gollerbach M.M. A large workshop on microbiology: a textbook. - M.: "Higher School", 1962. - 490 p.
4. Mishustin E.N. Microbiology. - M.: Kolos, 1970. - 320 p.
5. Egorov N.S. Workshop on microbiology: a training manual. - M.: Publishing House Mosk. University, 1976. - 307 p.
6. Pankratov A.Ya. Microbiology. - M.: Kolos, 1981. - 248 p.
7. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Workshop on microbiology. - M.: "Agropromizdat", 1987. - 239 p.
8. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Workshop on Microbiology. - M.: "Bustard", 2005. -256 p.
9. Epizootological research method / V.V. Makarov, A.V. Svyatkovsky, V.A. Kuzmin, O.I. Sukharev. -St. Petersburg: Publishing House "Doe", 2009. - 224 p.
10. Salimov V.A. Workshop on the pathological anatomy of animals. -SPb .: Publishing house "Doe". -2013. - S. 256.
