Изучение морфологических свойств изолятов бруцелл в Sи R-формах электронно-микроскопическим методом Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 619:616.22/23-002

A.Р. Сансызбай, Б.А. Еспембетов,

B.Л. Зайцев,

Н.Н. Зинина,

Н.С. Сырым,

К.Т. Султанкулова, М.К. Сармыкова, Р.К. Нисанова

ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ БРУЦЕЛЛ В S- И R-ФОРМАХ ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Ключевые слова: бруцеллез, Br. meli-tensis, Br. abortus, Br. suis диссоциация, R- и S-формы, электронная микроскопия.

Введение

Бруцеллез относится к наиболее распространенным заболеваниям, и полная его ликвидация является актуальной задачей, стоящей перед ветеринарной и медицинской наукой. Сложность этой проблемы обусловливается рядом особенностей биологии возбудителя этого заболевания.

Все виды возбудителей этой болезни — бактерии рода Brucella — по степени патогенности относятся к группе микробов особо опасных инфекций. Из 118 нозологических единиц, включенных в список МЭБ, три вида возбудителя бруцеллеза сельскохозяйственных животных представлены как отдельные нозологические единицы — Br. abortus, Br. melitensis и B. suis.

Морфологически все три вида бруцелл трудноотличимы друг от друга. Это мельчайшие бактерии шаровидной, овоидной или более удлиненной формы. Диаметр шаровидных форм достигает 0,3-0,4 ц, а бакте-

рии удлиненной формы имеют длину от 0,4-0,8 до 2,2-3,0, ширину — 0,4-0,8 ц. В электронном микроскопе они более крупные, палочковидные с закругленными концами, кокковые формы встречаются редко. Бруцеллы неподвижны, спор не образуют, при некоторых условиях приобретают разнообразные формы и размеры, а также способны образовывать капсулы.

У бруцелл описаны явления диссоциации с образованием R- и S-формы [1-3]. Также имеются сообщения о выделении из организма животных и человека диссоциированных форм бруцелл. Инагглютинабельные культуры бруцелл нередко выделяли из крови людей и органов животных, преимущественно при хроническом течении бруцеллеза [3, 4].

На основе вышеприведенных данных можно утверждать, что либо в инфицированном организме, на определенном этапе развития инфекционного процесса, либо при действии внешних факторов создаются условия для проявления лизогении бруцелл и превращения возбудителя болезни из S-форм в R-форму и обратно.

В хозяйствах с длительным неблагополучием по бруцеллезу наиболее сильно проявляется действие различных факторов (иммунное состояние, действие фагов и т.д.) при трансформации антигенной структуры бруцелл. Нарастает количество атипичных и диссоциированных биоваров микроба [5, 6].

Анализ данных по изучению культур бруцелл, изолированных от сельскохозяйственных животных, показывает, что диссоциированные варианты чаще встречаются в «старых» очагах, где практически не отмечались аборты бруцеллезной этиологии.

Важно отметить, что исследователи находят четыре варианта морфологических признаков у диссоциированных форм бруцелл [7, 8]. Клетки первого и второго вариантов по строению более резко отличаются от бруцелл в S-форме. Характерным для них признаком является наличие капсулоподобного вещества в виде рыхлого осмио-фильного слоя. Бруцеллы третьего морфологического варианта имеют лишь фрагменты капсулоподобного вещества, а клетки четвертого варианта часто лишены его, т.е. становятся подобными микробным телам недиссоциированных форм.

При частичном сохранении S-компонентов культуры бруцелл имеют свои отличительные особенности. Так, при окраске колоний по Уайт-Вильсону можно найти большое множество разнообразий степени окрашивания их кристаллвиолетом. Отдельные виды бруцелл (Вг. ovisи др.) находятся в стабильной R-форме и в организме животных вызывают выраженные патологические изменения.

Необходимо отметить, что при определении таксономических видов и изучении биологических свойств культур бруцелл в основе работ отечественных ученых по номенклатуре и классификации бруцелл, как правило, использовался микробиологический подход ив том числе электронномикроскопический. Это объясняется тем, что различные виды бруцелл отличаются по морфологическим, биохимическим, культуральным свойствам и патогенности, формируя тем самым хорошо очерченные группы внутри рода, коррелирующие с паразитизмом на строго определенных видах хозяев. Электронная микроскопия — метод морфологического исследования бруцелл с помощью потока электронов, позволяющих изучить структуру культур на макромолеку-лярном и субклеточном уровнях.

Объективный характер электронномикроскопических исследований подтверждается выявлением влияния микроорганизмов, вызывающих в процессе своей жизнедеятельности деструктивные измене-

ния как в окружающей среде, так и в организме животных.

В практике работы микроскопическое исследование в большинстве случаев имеет значение ускоренной ориентировочной диагностики. Основными задачами микроскопии служат выявление возбудителя в клиническом материале, ориентировочная идентификация на основании определения характерных морфологических и тинкториальных признаков бактерий.

Анализ данных литературы позволил предположить, что только при совместном исследовании морфобиологических особенностей бруцелл можно получить полную и углубленную информацию о функциональных характеристиках бруцелл.

Таким образом, определение таксономических видов популяций бруцелл, циркулирующих в различных по своей характеристике эпизоотических очагах бруцеллезной инфекции на основе изучения морфологических свойств электронно-микроскопическим методом позволит правильно оценить эпизоотическую ситуацию по бруцеллезу сельскохозяйственных животных.

Целью исследований является изучение морфологических свойств выделенных изо-лятов электронно-микроскопическим методом.

Материалы и методы

В опытах использовали 13 проббиомате-риала, содержащего бактерии рода Brucella, полученного от крупного рогатого скота в ходе экспедиции по ЮжноКазахстанской области.

В процессе бактериологических исследований использовали агар для бруцелл

(Brucella Agar BaseM074), 4-шаговый набор для окраски по Граму (BDGramStainKit), нейтральный акрифлавин фирмы Sigma (SigmaA-8126), пипетки DifcoBD с реактивом каталазы производства BD261203, пипетки DifcoBD с реактивом оксидазы производства BD 261181, сероводородные полоски

(Leadacetatetestpaper), тионин, фуксин

(BasisFuchsinspecialforflagella), моноспецифи-ческие сыворотки antiabortus, antimelitensis). В качестве контролей использовали коллекционные эталонные штаммы бруцелл.

Идентификацию и дифференциацию видов и биотипов бруцелл проводили по методике и схеме ФАО/ВОЗ, утвержденной подкомитетом по таксономии бруцелл Международного комитета экспертов [9].

Препараты для электронной микроскопии готовили методом ультратонких срезов и негативного контрастирования проб. Варианты бруцелл выделяли из среды культивирования с помощью низкоскоростного центрифугирования при 2000 об/мин. в течение 10 мин. и последующего центрифуги-

рования надосадочной жидкости при 15000 об/мин. в течение 20 мин.

Для негативного контрастирования бактерии адсорбировали на сетки с форм варовой подложкой, напыленный углем в электростатическом поле тефлоновой пластины. Время адсорбции составляло 10 мин. После адсорбции пробы контрастировали в течение 5 мин. 2%-ным водным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты с рН 6,8-7,0.

Для приготовления тонких срезов осадок бактерий фиксировали 2%-ным раствором глутаральдегида на 0,2 М какодилатном буфере в течение 2 ч, с последующей фиксацией 2%-ным осьмиевым фиксатором Шестранда. Фиксированные пробы обезвоживали в этиловом спирте возрастающей концентрации от 60% до абсолютного. 70%-ный спирт содержал 2%-ным уранил-ацетата. Обезвоженные образцы заливали в смесь эпоксисмолЭпон812-аралдит М (1:1). После полимеризации блоки с материалом использовали для ультратомии. Срезы готовили стеклянными ножами на ультратоме LKB 8800 (Швеция). Среды монтировали на сетки с подложкой и контрастировали 2%-ным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по Реинольдсу.

Готовые препараты исследовали в электронном микроскопе JEM 100 СХ II фирмы JEOL (Япония) при ускоряющем напряжении 80 ^ и увеличении 5-20 тыс. Измерения параметров бактериальных частиц проводили на фотонегативе измерительной лупой. Для обсчета использовали не менее 100 частиц каждого варианта.

Морфометрический анализ размеров бактерий проводили на полученных негативных фотопластинах с помощью увеличительной лупы со шкалой деления 0,1 мм. Для анализа использовали замеры не менее 100 бактерий.

Результаты исследований

При индикации золятов на первом этапе исследований провели по изучению культурально-морфологических свойств бактерий и постановку ориентировочной реакции агглютинации на стекле со специфической бруцеллезной сывороткой.

При просмотре пробирки с культурой отмечали, что изучаемые культуры микроорганизмов вегетировали в виде бледных полупрозрачных круглых колоний цвета меда с ровными краями, на пластинке скошенного агара они также представляли собой бесцветные колонии в виде холмиков (рис. 1).

Как видно на рисунке 1, рост культуры сухой, колонии круглые, плотные, гладкие, менее выпуклые с металлическим оттен-

ком. В проходящем свете янтарные, бактериальная масса с трудом снимается бактериологической петлей.

Рис. 1. Рост культуры

При микроскопии изучаемой культуры было установлено, что тестируемые микроорганизмы являются грамотрицательными коккобациллами, окрашиваются в розовый цвет.

С целью установления рода изучаемых культур, провели постановку ориентировочной реакции агглютинации на предметном стекле со специфической бруцеллезной сывороткой. В капле специфической бруцеллезной сыворотки отчетливо видна агглютинация частиц тестируемой культуры микроорганизма, выраженные хлопья образовались сразу на первой минуте проведения данного теста.

Редуцирующая активность тестируемой культуры бруцелл в отношении красок — основного фуксина и тионина в разведении 1:50000, 1:100000. При этом наблюдали

сплошной рост изолята.

Наблюдали интенсивный рост изучаемой культуры на среде с содержанием 100 ЕД пенициллина.

Результаты изучения культуральных свойств изолированных микроорганизмов (особенностей вегетации на питательных средах), их морфологии (микроскопия мазков), а также РА на стекле дали нам основание утверждать, что изучаемые изоляты микроорганизмов являются бруцеллами.

Выделенные изоляты показали по чувствительности каталазы и оксидазы положительными.

Выявление наличия признаков диссоциации в культурах бруцелл проводили с помощью пробы с акрифлавином.

Результаты типирования культур бруцелл с помощью фагов

Результаты определения чувствительности к фагу штамма бруцелл, выделенного от крупного рогатого скота, показал, что на бактериальном газоне этой культуры виден лизис разведенным фагом агаровых культур бруцелл.

Гладкие колонии бруцелл (S-форма) остаются во взвеси, а шероховатые колонии сразу агглютинируют. Этот тест свидетельствует о том, что в культуральном материале присутствуют бруцеллы как в S-форме, так и R-диссоциированные клетки бруцелл. Для этой цели 2-суточные колонии бруцелл в чашках Петри подвергли окраске по методу Уайт-Вилсона. По результатам окрашивания колоний бруцелл кристаллвио-летом для дальнейшей дифференциации изолятов бруцелл нами были отобраны культуры в S-форме. Гладкие колонии выглядят белыми. Они не воспринимают эту краску, т.е. культуры находятся в S-форме. R-диссоциированные колонии окрашены различными оттенками лилового цвета (рис. 2).

При более детальном изучении культурально-морфологических и биологических свойств бактерий из 13 культур были отнесены: 7 культур к B. abortus 3 биовара,

3 культуры к B. abortus6 биовара, а три оставшиеся культуры в R-форме — диссоциан-там.

S-формы

Рис. 2. Окрашенные колонии по методу Уайт-Вилсона

Далее было проведено изучение морфологических свойств электронно-микроскопическим методом краевых культур бруцелл, выделенных от крупного рогатого скота из неблагополучных хозяйств ЮжноКазахстанской области.

S-формы

Рис. 3. Электронная микроскопия препаратов бактерий Brucella: негативное контрастирование 2%-ным раствором ФВК (рН 6,8). Ув. х 21000

Из рисунка 3 следует, что морфометрия клеток Brucella непосредственно на фотонегативах с помощью лупы с измерительной шкалой выявила существенные колебания размеров поперечника и длины бактерий. Размер поперечника овоидных форм составлял в поперечнике 0,3-0,6 и

0,4-0,7 мкм, длине 3,0-1,5, и 0,3-2,5 мкм соответственно, что присуще бактериям Brucella abortus.

В популяциях обоих вариантов преобладают овальные и палочковидные формы диаметром 400-550 нм и длиной 600-950 нм. В препаратах R-формы обнаружены как коккоподобные диаметром 350-400 нм. Наружная мембрана большей части имеет бугристо-складчатый или шероховато-зернистый рельеф. На поверхности клеточной стенки у R-формы присутствуют шипообразные структуры. В популяциях бактерий бруцелл в S-форме были выявлены бактериальные клетки с гладкозернистой структурной поверхностью и палочковидной формы. Во всех случаях представлены три слоя: наружный — клеточная стенка с пептидогликановым слоем, внутренний — цитоплазматическая мембрана и промежуточный — переплазматический слой.

Обсуждение

Некоторые виды бруцелл (Br.melitensis, Br.abortus, Br.suis) изначально находятся в S-форме, но при различных неблагоприятных условиях или при паразитировании в нетипичном хозяине могут легко диссоциировать в R-форму. В соответствующих благоприятных условиях они снова реверсируют в S-форму (переход бруцелл из S-формы в R носит название диссоциации, а из R- в S — реверсии).

Они различаются между собой по строению клеток и характеру метаболизма. Главным же антигенным отличием является отсутствие у R-вариантов полисахаридной цепи S-эндотоксина, где антигенными детерминантами, определяющими бруцеллезную специфичность, являются структуры альфа-2-маннопиранозы.

Внимание на антигенных особенностях возбудителя, связанных с диссоциацией, акцентировано неслучайно. В нашей стране диагностика бруцеллеза проводится только с диагностикумом, выявляющим заражение классическими S-вариантами бруцелл. Практически все R-варианты возбудителя не определяются, следовательно, и болезнь не диагностируется.

При глубокой диссоциации бруцелл происходят существенные изменения в генетическом аппарате бактериальной клетки. Белки и другие составные элементы микробного тела приобретают при этом новую

специфичность. В этом случае прижизненное диагностирование заболевания может быть достигнуто только при использовании соответствующих препаратов, изготовление которых требует установление локализации в бактериальной клетке биологически активных веществ, разработки способов их извлечения и дифференциации.

По данным литературы, строение бру-целл типично для большинства грамотрица-тельных бактерий. В полной мере это относится и к наиболее активной в иммунологическом отношении клеточной стенке. Стенка микробной клетки состоит из трех основных для этих бактерий слоев: цитоплазматической мембраны клетки, пептидогли-канового слоя, создающего жесткий остов, и наружной мембраны.

При проведении электронно-микроскопического анализа данного препарата на электронном микроскопе JEM 100 CX, JEOL была определена морфология и тонкая структура бактерий. Размер бактериальных клеток варьировал в пределах 0,4 до 2,5 мк в длину и от 0,4 до 0,6 мк в ширину, что присуще бактериям вида Brucella abortus.

Таким образом, проведенная нами в сравнительном аспекте электронная микроскопия срезов генетически стойких R- и S- форм бруцелл показала, что они имеют одни и те же основные структурные элементы (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, нуклеоид). Однако наряду с этим нашими исследованиями обнаружена кокковидность формы диссоцированных R-форм бруцелл и имелись выраженные, чем у S-форм бруцелл, С-образные инвагинаты оболочки, и присутствует выраженный бугристо-складчатый рельеф, а у S-формы были выявлены бактериальные клетки палочковидной формы с гладкозернистой структурной поверхностью.

Библиографический список

1. Первушин Б.П. Вопросы микробиоло-

гической и иммунологической диагностики бруцеллеза у человека. — М.: Медгиз,

1962. — 246 с.

2. Косилов И.А. Изменчивость бруцелл и ее значение в проблеме бруцеллеза сельскохозяйственных животных: дис. ... докт. вет. наук. — Омск, 1974. — 382 с.

3. Потапов Н.М. Некоторые особенности бруцеллеза крупного рогатого скота в Приморье в связи с изменчивостью бруцелл: автореф. дис. ... канд. вет. наук. — Троицк, 1974. — 28 с.

4. Власов А.Г., Коновалов А.Н. О вакцинации коров и нетелей против бруцеллеза на благополучных фермах и особенности штаммов бруцелл, выделенных от привитых

животных // Ветеринария. — 1961. — № 11. - С. 49-50.

5. Тычина О.Ф. Изучение свойств культур бруцелл, выделенных в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах различных зон Казахстана: дис. ... канд. вет. наук. — Алма-Ата, 1966. — 191 с.

6. Сафронов Н.В., Студенцов К.П., Бе-лобаб В.И. Изменчивость бруцелл в иммунном организме // Меры борьбы с туберкулезом и бруцеллезом в Казахстане: матер. республ. семинара-совещания вет.

специалистов. — Алма-Ата, 197З. —

С. 71-7З.

7. Высоцкий В.В. Ультраструктура бру-целл. Процесс диссоциации // ЖМЭИ. — 1968. — № 8. — С. 42-47.

8. Тетерина В.З. Изучение ультраструктуры бруцелл: автореф. дис. ... канд. вет. наук. — Фрунзе, 1971. — 19 с.

9 Techniques for the brucellosis laboratory.institut national de la гє^єг^й agronomique 147, rue de I'Universite, 75007, IJRA Paris J. — 1988. — ISB № — 2 — 7З80 — 0042-8. — Р. 145.

+ + +

УДК 619:616.98:579 О.Б. Бадмаева,

Базаррагчаа Баянжаргал,

В.Ц. Цыдыпов

ЭПИЗООТОЛОГИЯ ЛИСТЕРИОЗА В МОНГОЛИИ

Ключевые слова: Монголия, листериоз, неблагополучный пункт, заболеваемость, летальность, удельный вес, коэффициент очаговости.

Введение

Листериоз регистрируется почти в 60 странах мира. Ареал листериоза значителен, спорадические случаи отмечаются и в нашей стране. Заболевание животных лис-териозом устанавливается в различных природно-климатических условиях на всех континентах Земного шара [1, 2].

Листериоз наносит большой экономический ущерб животноводству Монголии, складывающийся из потерь при гибели животных, затрат на проведение ветеринарносанитарных мероприятий. Проявление лис-териоза имело наибольшую напряженность в 2001 г., характеризовавшееся высоким

показателем заболеваемости (0,98) на 10000 поголовья животных [3].

Развитие инфекционного процесса связано с условиями содержания и кормления, во многом зависит от резистентности организма животных и факторов окружающей среды [4]. В связи с этим вопросы борьбы с листериозом, профилактики болезни остаются острой проблемой в животноводстве страны.

Цель работы — определение интенсивности проявления листериоза сельскохозяйственных животных на территории Монголии,

его удельного веса в инфекционной патологии животных.

Материал и методы

Работа выполнялась на кафедре микробиологии, вирусологии и ветсанэкспертизы ФГБОУ ВПО «Бурятская ГСХА им. В.Р. Филиппова», в Центральной ветеринарной лаборатории г. Улан-Батор Монголии. Были проанализированы и подвергнуты статистическим и линейно-графическим исследованиям данные, полученные в результате эпи-зоотологического мониторинга за течением эпизоотического процесса листериоза животных, данные отчетности Ветеринарного управления Монголии за 2003-2012 гг. Индекс заболеваемости исчисляли на 10000 среднегодового поголовья. Летальность, удельный вес болезни в общей заболеваемости животных определяли по общепринятым методикам [5].

Результаты исследований

В настоящее время темпы развития животноводства в Монголии во многом зависят от возникновения и характера проявления инфекционных болезней. Поголовье основных видов сельскохозяйственных животных в Монголии в 2012 г. составляло 40432,9 тыс. гол., что в 1,6 раза больше, чем в 2003 г. Для частных хозяйств, в которых, по данным 2010 г., находится 98,8% скота страны, заболевание и гибель животных от листериоза представляют одну из наиболее острых проблем (табл.).