CC BY
19
When testing treatment regimens for cows with mastitis, it was found that the therapeutic efficacy of lactobay was higher in comparative aspect with mastilex and amounted to 94.7 % with catarrhal mastitis, while 93.1 % of the udder was cured. The use of mastilex led to the recovery of 89.5 % of cows suffering from catarrhal mastitis, while 85.7 % of the quarters of the udder were cured.
Key words: cows, mastitis, blood, microflora of milk, lakebay, mastiles.
-♦-
УДК 57.083.16:579.64:636.2(470.47)
Усовершенствование метода Ганса Кристиана Грама при определении основных закономерностей деятельности пищеварительного тракта животных*
П.А. Кулясов, канд. ветеринар. наук; К.Э. Халгаева, канд. с.-х. наук;
Ц.Б. Тюрбеев, канд. с.-х. наук; В.К. Болаев, канд. с.-х. наук;
Д.З. Чавлинов, магистрант, В.Ю. Ходжаев, магистрант
ФГБОУ ВО Калмыцкий государственный университет
Микроскопический метод предусматривает изучение представителей микробного (бактерии, бациллы, клостридии и плектридии) и дрожжевого (хлебопекарные, плодоовощные, ягодные и виноградные дрожжи) мира в окрашенном или неокрашенном состояниях с помощью бинокулярного светового микроскопа. В статье представлена усовершенствованная и дополненная методика знаменитого датского микробиолога Ганса Кристиана Грама при окрашивании микрофлоры кишечника жвачных животных. Показано, что окраска микробных культур достигается благодаря красителю - сафранину. Окраска по усовершенствованному методу Ганса Кристиана Грама с добавлением вместо фуксина Пфейффера красителя красного цвета - сафранина позволила под оптической иммерсионной системой светового бинокулярного микроскопа с кратностью увеличения от 1000 до 1500 раз увидеть огромное многообразие гнилостных микробов. Данные микроорганизмы участвуют в брожении и разложении кормовых частиц частично внутри тонкого и полностью толстого отделов кишечника. Попадание кормовых частиц из желудка в кишечник сопровождается увеличением микробной популяции в численности, что ведёт к образованию избыточного количества конечных продуктов их жизнедеятельности, вредных для живого организма жвачных.
Ключевые слова: пищеварительный тракт, коровы калмыцкой породы, микробы, световой микроскоп, окраска по Гансу Кристиану Граму, фуксин Пфейффера, фуксин Циля, сафранин.
На планете Земля существуют два мира - растительный и животный, которые прочно заняли ведущее место в жизни планеты. Повсеместно, в любой её точке, имеются животные и растения. В настоящее время на Земле обитают свыше 1 млн видов животных и около 500 тыс. видов растений. Кроме растений, животных и людей существует и другой мир - мельчайших микроскопических организмов - микробов, грибков, дрожжей, простейших, риккетсий, вирусов. Мир многоклеточных организмов постоянно «заигрывает» с миром одноклеточных существ в надежде остаться бессмертными. И на протяжении нескольких десятков лет они выигрывают эту войну. Удивительно то, что живые ткани людей, млекопитающих и растений ни в коем случае не подвергаются прижизненному гниению и разложению под действием гнилостной микрофлоры [1]. Но всегда наступает конец. Находящиеся внутри пищеварительной системы гнилостные микроорганизмы неминуемо завершают жизненный путь любого живого организма.
Материал и методы исследования. Работа по сбору доказательной базы была проведена на коровах калмыцкой мясной породы. Начиная с 2015 г. и по сегодняшний день ведётся постоянный мониторинг и анализ выживаемости коров калмыцкой породы и обитающих в аридной зоне Южного федерального округа других видов травоядных животных - овец и лошадей [2].
Таким образом, основываясь на постоянном наблюдении за их жизнью в Калмыкии, удалось выяснить, что при внезапной гибели животных мёртвые тела калмыцких коров и быков в любом случае подвергались процессу гниения и разложения. Т.е. независимо от их возраста и пола при полной остановке сердца и всего кровеносного русла их тела на 3 - 4-е сутки при благоприятных погодных условиях (плюсовой температуре окружающей среды и оптимальной влажности) начинали гнить и разлагаться. Данный процесс вызывают обширные колонии сапрофитных гнилостных бактерий [2] (рис.1).
* Работа выполнена с использованием специального микроскопического лабораторного оборудования (микроскопы и термостаты) кабинета микробиологии и Центра коллективного пользования (ЦКП) «Биовет» аграрного факультета Калмыцкого государственного университета им. Б.Б. Городовикова.
Рис. 1 - Гнилостные микробы пищеварительной системы жвачного животного
Из степных видов растений, растущих в полупустынных аридных зонах Республики Калмыкии, идущих в корм животным с многокамерным и однокамерным желудками, на первом месте находятся кормовые полукустарники - терескен серый и прутняк стелющийся [3, 4].
Выдающийся датский микробиолог Ганс Кристиан Грам в 1884 г. предложил для окрашивания микробов использовать сложный диагностический метод, названный впоследствии окраской по Граму, с использованием трёх видов анилиновых красителей и концентрированного 96%-ного этилового спирта. Следуя этому методу, на чистое предметное стекло, извлечённое из жидкой смеси Никифорова (равные части этилового спирта и наркотического эфира) и предварительно про-фламбированное (обеззараженное) над пламенем огня спиртовки с наличием в ней 96%-ного этилового спирта, наносили несколько капель готового субстрата корма, взятого отдельными порциями из первых трёх камер преджелудков убойных жвачных животных - рубца, сетки, книжки и сычужной камеры - сычуга [5, 6].
Предварительно разбавленное содержимое желудков помещали в две стеклянные пробирки с добавлением дистиллированной или дважды прокипячённой, но заранее остуженной водопроводной воды, с последующей постановкой готового препарата в термостат при температуре +27 °С [7 - 10]. Это металлическое оборудование, в котором длительный период времени поддерживается установленная плюсовая температура (от 0 °С до +35 °С), даёт возможность в короткое время вырастить чистые микробные колонии. Культуру подсушивали над пламенем огня спиртовки, и после остывания предметного стекла сверху на пятно помещали ровный квадратик белой фильтровальной бумаги. Наносили первый краситель - метиленовый синий в таком количестве, чтобы полностью пропитать
фильтровальную бумагу. Выдерживали 2 мин. Пинцетом снимали фильтровальную бумагу, выбрасывали в стеклянную кюветку и наносили второй краситель - раствор Люголя, состоящий из 1 г сухого кристаллического йода, 2 г йодистого калия и 300 мл дистиллированной воды. Выдерживали 2 мин.
После завершения окрашивания лишний люголевский краситель удаляли с предметного стекла в стеклянную кюветку и добавляли третий химический компонент - несколько капель 96%-ного этилового спирта на 30 сек. Передерживать этанол (С2Н5ОН) дольше положенного времени не следует по причине возможного обесцвечивания им микробного препарата. Первый раз после 3-го красителя мазок обильно промывали дистиллированной водой и по методу Грама должны были нанести четвёртый краситель - фуксин Пфейффера, который состоял из 1 мл фуксина Циля + 9 мл дистиллированной воды [11].
В состав фуксина Циля входят следующие химические компоненты:
1. Фуксин (основной, сухой, кристаллический, красный) - 1 г;
2. Спирт этиловый (96%-ной концентрации) -10 мл;
3. Фенол, или карболовая кислота (сухой кристаллический порошок) - 5 г;
4. Глицерин (тягучая густая жидкость) - 5 мл;
5. Дистиллированная вода - 100 мл.
К 1 мл готового фуксина Циля добавляли 9 мл дистиллированной воды и получили четвёртый, заключительный краситель для сложного диагностического метода окрашивания по Гансу Кристиану Граму.
В Калмыцком ГУ вместо фуксина Пфейффера использовали красный сухой порошкообразный краситель сафранин. Его разбавляли дистиллированной водой в соотношении 1:50. Выдерживали 2 мин. и вторично после четвёртого красителя
обильно промывали дистиллированной водой. Готовый окрашенный мазок фиксировали (высушивали) над пламенем огня спиртовки до полного его высыхания. Фиксация мазка преследовала главные цели: убить живые микробы и дрожжи, так как мёртвые микробы и дрожжи лучше окрашиваются красителями и удерживаются на предметном стекле [11].
Ни в коем случае нельзя близко приближать мазок к пламени спиртовки по причине его неминуемого и быстрого растрескивания. Это подтверждается при микроскопии под световым микроскопом характерным наличием в поле видимости окуляра (7х, 10х, 15х и объектива 40х, 100х) тонких и заострённых с двух противоположных друг от друга концов прямолинейных или чуть изогнутых полосок тёмного цвета (рис. 2).
Рис. 2 - Неправильная окраска дрожжевого мазка
Сравнить это явление можно с так называемым процессом растрескивания дна высохшей лужи воды от палящих солнечных лучей, которая после своего полного испарения оставляет тонкие, ровные и беспорядочно отмеченные трещины [11, 12].
Фиксацию готового окрашенного мазка можно проводить двумя аналогичными способами:
1. При помощи пламени огня спиртовки с наличием 96%-ного этилового спирта.
2. С помощью смеси Никифорова (равные части 1:1 этилового спирта 96%-ной концентрации и наркотического эфира). Предметное стекло с окрашенным микробным мазком опускали в спирто-эфирную жидкость и после непродолжительного (несколько секунд) выдерживания вынимали и ожидали полного испарения и высыхания. Спирт + эфир почти моментально испаряются на воздухе, что обеспечивает прочную фиксацию препарата. Таким образом получали окрашенную и зафиксированную над пламенем огня спиртовки микробную культуру - мазок.
После завершения первой - основной части лабораторных работ (окрашивания), когда на мазке предметного стекла анилиновыми красителями были отмечены возможные бактерии, незамедлительно приступили к завершающему этапу, а именно к рассматриванию и изучению картины в световом бинокулярном оптическом микроскопе.
Для этого был использован световой микроскоп с увеличительной способностью окуляра 15х и объектива 100х, что дало многократность увеличения в полторы тысячи раз (15 • 100 = 1500). Предварительно на готовый мазок наносили одну каплю иммерсионного (кедрового) масла. Одной капли масла достаточно по причине малого размера фронтальной (наружной) линзы объектива 100х. Движением рукоятки макрометрического винта (от себя по часовой стрелке) приподнимали предметный столик учебного светового бинокулярного микроскопа до тех пор, пока линза объектива 100х не соприкасалась с иммерсионным (кедровым) маслом. Сразу после погружения линзы в масло кручение макрометрического винта по часовой стрелке прекращали и начинали крутить на себя, против часовой стрелки. При этом создавалось условное мысленное обозначение, выражающееся в так называемой форме «суть песочных часов», при которой верхняя их часть - это объектив, а нижняя - иммерсионное масло [12, 13].
Вытягивающаяся вертикально тонкая серединная часть - это и есть состояние иммерсионного (кедрового) масла, позволяющее искусственному световому лучу, испускаемому электрической лампой, располагающейся под конденсором на верхней передней части основания светового микроскопа, проходить внутри себя, минуя в своём движении:
- открытую ирисовую диафрагму;
- увеличительные стекла конденсора;
- отверстие предметного столика;
- предметное стекло;
- иммерсионное (кедровое) масло;
- окрашенный микробный мазок,
и проникая в линзу иммерсионного объектива 100х. Это даёт возможность увидеть в окуляр микроскопа изображение.
Наблюдая в окуляр 15х, мы достаточно оперативно смогли запечатлеть и сфотографировать микроскопический мир исследуемого объекта.
Были обнаружены колонии гнилостных микробов, результатом активной деятельности которых являлось продвижение корма по всему кишечному тракту животного и выделение ими конечных продуктов своей микробной жизнедеятельности - индола, скатола, меркаптана и сероводорода. Существует два цвета окраски по Граму - синий и красный. Гнилостные бактерии при окраске по усовершенствованному методу по
Гансу Кристину Граму окрашивались в красный цвет Гр (-) отрицательные.
Результаты исследования. Экспериментальное исследование, проведённое в 2015 - 2019 гг. в Республики Калмыкии на коровах калмыцкой породы, позволило выяснить следующие основные закономерности деятельности пищеварительного тракта животных.
1. Желудок служит хранилищем для временного хранения кормовых масс и частичной их бактериологической и химической переработки.
2. У жвачных животных желудок представляет собой четыре соединённые между собой камеры, три из которых являются преджелудками (рубец, сетка и книжка) и одна камера - истинный желудок (сычуг).
3. Кормовые массы поступают из желудка в кишечник отдельными порциями, и такой процесс хорошо выражен у жвачных животных - из рубца в сетку, из сетки в книжку, затем корм достигает последней камеры - сычуга.
4. Сычужная камера жвачных, как и желудок у однокамерных животных, имеет свойства расщеплять, обезвреживать и всасывать кормовые остатки благодаря наличию всасывающих пищеварительных желёз.
5. Корм, а вместе с ним и сотни тысяч самых различных микробов, обитающих повсеместно во внешней среде, попадая в желудок, сразу обволакиваются и пропитываются желудочным соком.
6. У коров калмыцкой породы внутри туловища имеется желудок и в составе желудочного сока находится желудочная соляная кислота.
7. Жвачные животные для утоления голода потребляют корм, который распадается на пять главных основных компонентов: белки, углеводы, жиры, витамины и минералы.
8. В сычужной камере происходит бурная химическая реакция расщепления основного корма на доступные для всасывания и усвоения питательных компонентов: например, белки расщепляются до аминокислот, углеводы до сахаров, жиры до жирных кислот, витамины до жиро- и водорастворимых частиц, а минералы до микро-и макроэлементов. Всё остальное инородное и чужое для живых отделов земного тела, все эти -микробы, бактерии, вирусы, простейшие, грязевые микрочастицы должны отфильтровываться и выводиться стенками желудка и кишечника во внешнюю окружающую среду через тонкий и толстый отделы кишечника [11].
9. В содержимом тонкого и толстого отделов кишечника находится огромное число гнилостных микроорганизмов, участвующих в разложении кормовых частиц.
10. Окраска по усовершенствованному методу Ганса Кристиана Грама позволила увидеть под оптической иммерсионной системой большое разнообразие гнилостных микробов.
Выводы
1. Проведение патолого-анатомического вскрытия павших или убойных животных позволило визуально отметить закономерную цепь продвижения кормовых масс по пищеварительному пути: ротовая полость, глотка, пищевод, отделы многокамерного желудка (рубец, сетка, книжка и сычуг), заканчивая начальными отделами тонкого кишечника (двенадцатиперстная, тощая и подвздошная кишки) и в конце - толстым отделом кишечника (слепая, ободочная и прямая кишки).
2. Используя анилиновые красители на примере метиленового синего, раствора Люголя, красного сафранина, окрашивая препарат по аналогичному, сходному способу Ганса Кристиана Грама, можно в кратчайшие сроки выявить под увеличением светового микроскопа в 1000- и 1500-кратности раз мельчайшие, но хорошо видимые глазом через его оптическую систему палочковидные формы бактерий гнилостного характера, отвечающие за разложение кормовых масс в кишечнике до и после смерти жвачного животного.
3. Собранные воедино данные позволят дополнить недоработанные страницы учебных изданий по зоотехнии и ветеринарии, понять сущность пищеварения в целом и выяснить вредоносную патологическую роль гнилостных микроорганизмов при жизни живого организма и после его смерти.
Литература
1. Кулясов П. А. Роль химических стойких хлористых соединений и ярко-красного антибиотика в жизнедеятельности растений и животных // Животноводство юга России. 2017. № 5 (23). С. 20 - 23.
2. Радионов Г.В. Животноводство. СПб.: Изд-во «Лань», 2014. 560 с.
3. Каминов Ю.Б. Прутняк стелющийся - ценный кормовой полукустарник для улучшения аридных пастбищ северо-западного Прикаспия // Кормопроизводство. 2008. № 2. С. 28 - 31.
4. Каминов Ю.Б. Терескен серый - перспективный кормовой полукустарник // Земледелие. 2009. N° 3. С. 46.
5. Синещеков А.Д. Биология питания сельскохозяйственных животных. М., 1965. 399 с.
6. Салимов В.А. Практикум по патологической анатомии животных. СПб.: Изд-во «Лань», 2013. 256 с.
7. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. М.: Колос, 1970. 320 с.
8. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии: учебное пособие. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. 307 с.
9. Панкратов А.Я. Микробиология. М.: «Колос», 1981. 248 с.
10. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: «Агропромиздат», 1987. 239 с.
11. Кулясов П. А. Окраска микробной культуры по методу Ганса Кристиана Грама для идентификации живого биологического возбудителя злокачественной раковой опухоли // Научная жизнь. 2019. № 6. С. 995 - 974.
12. Кулясов П.А., Босхомджиева Е.Д. Лабораторный практикум по микробиологии и микологии. Учебное пособие. Элиста: Изд-во Калм. ун-та, 2018. 243 с.
13. Химическая реакция желудка млекопитающих и птиц / П.А. Кулясов, Ц.Б. Тюрбеев, В.К. Болаев [и др.] // Социально-экономические и экологические аспекты развития Прикаспийского региона: сб. стат. Междунар. науч.-практич. конф. Элиста, 2019. С. 272 - 283.
Кулясов Пётр Александрович, кандидат ветеринарных наук, доцент Халгаева Кермен Эрдниевна, кандидат сельскохозяйственных наук Тюрбеев Цеден Бадмаевич, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Болаев Валерий Канурович, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Чавлинов Джангар Зулаевич, магистрант Ходжаев Виктор Юрьевич, магистрант
ФГБОУ ВО «Калмыцкий государственный университет имени Б.Б. Городовикова» Россия, 358000, Республика Калмыкия, г. Элиста, ул. Пушкина, 11
E-mail: Pakulasov@mail.ru; halgaeva2011@mail.ru; tyurbeev.tceden@mail.ru; v.bolaev@mail.ru; chavlinov@mail.ru; hodyaev@mail.ru
Improving the Hans Christian Gram method to determine the basic laws of digestive tract activity in animals
Kulyasov Petr Aleksandrovich, Candidate of Veterinary Sciences, Assistant Professor
Khalgaeva Kermen Erdnievna, Candidate of Agriculturs
Tyurbeyev Zeden Badmaevich, Candidate of Agricultum, Assistant Professor
Bolaev Valery Kanurovich, Candidate of Agricultum, Assistant Professor
Chavlinov Dzhangar Zulaevich, Masters degree student
Khodzhaev Viktor Yurievich, Masters degree student
Kalmyk State University named after BB Gorodovikova
11, Pushkina St., Elista, Republic of Kalmykia, 358000, Russia
E-mail: Pakulasov@mail.ru; halgaeva2011@mail.ru; tyurbeev.tceden@mail.ru; v.bolaev@mail.ru; chavlinov@mail.ru; hodyaev@mail.ru
The microscopic method involves the study of living or killed representatives of the microbial (bacteria, bacilli, clostridia and plectridia) and yeast (baking, fruit and vegetable, berry and grape yeast) world in a stained or unpainted state using a binocular light microscope. This scientific article provides an improved and augmented technique of the famous Danish microbiologist Hans Christian Gram when staining the intestinal microflora of ruminants. It was shown that the staining of microbial cultures was achieved due to the last fourth dye - safranin. Coloring according to the improved method of Hans Christian Gram with the addition of another red dye, safranin, instead of fuchsin Pfeiffer, allowed us to see a huge variety of putrefactive microbes under the optical immersion system of a light binocular microscope with a magnification of 1000 to 1500 times. These microorganisms are involved in the fermentation and decomposition of feed particles partially inside the thin and completely thick intestines. All that the animal eats useful (proteins, carbohydrates, fats, vitamins and minerals) must be digested and absorbed by the walls of the abomasum into the blood, since the ingestion of feed particles from the stomach into the intestine is accompanied by an increase in the microbial population in numbers, which leads to the formation of an excess of final products of their vital activity, harmful to the living organism of ruminants.
Key words: digestive tract, cows of Kalmyk breed, microbes, light microscope, staining according to Hans
Christian Gram, fuchsin Pfeiffer, fuchsin Tsilya, safranin.
-♦-
УДК 619:616.006:636.8
Клинический случай множественной злокачественной мастоцитомы у кота (плеоморфный низкодифференцированный вариант)
В.В. Гречко, канд. ветеринар. наук; Л.Ф. Бодрова, д-р ветеринар. наук, профессор;
Д.К. Овчинников, канд. ветеринар. наук
ФГБОУ ВО Омский ГАУ
Мастоцитома - злокачественная пролиферация тучных клеток (мастоцитов) - может возникать у собак или кошек в виде множественных или единичных новообразований кожи Объектом исследования был кот в возрасте 4 лет, беспородный, кастрат, проходивший регулярные обработки от экто- и эндопаразитов, вакцинацию в соответствии с графиком. У пациента установлен плеоморфный вариант мастоцитомы с низкой дифференцировкой. Проведена цитологическая диагностика и окраска Азур-эозином по Романовскому, что является достаточно точным методом диагностики для постановки диагноза мастоцитома, а также помогает предположить степень дифференцировки. В ходе лечения выявлена неэффективность протокола химиотерапии АСОР, соблюдение которого привело к положительной динамике только в первые месяцы терапии. Авторы полагают, что лечение надо было начинать с протокола, включающего в себя препарат Ломустин. Проведение химиотерапии не предупредило и не повлияло на появление отдалённых метастазов
