CC BY
10УСЛОВИЯ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ПОЛУЧЕНИЕ БЕЗОПАСНЫХ И ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ИНАКТИВИРОВАННЫХ ВАКЦИН ГЕПАТИТА А.
Значимость гепатита А в инфекционной патологии человека и особенно среди инфекционных гепатитов возрастает (И.Л. Шаханина, Л.А. Осипова, 1999). Как результат отмечается более пристальное внимание инфекционистов к разработке мероприятий по профилактике данной инфекции. Наиболее радикальным компонентом в профилактических мероприятиях гепатита А является вакцинация, В настоящее время основным препаратом для этих целей является культуральная инактивированная очищенная вакцина гепатита А.
В связи с этим разработка биологического контроля, обеспечивающего производство безопасного и эффективного препарата для профилактики гепатита А, является чрезвычайно важной.
Инактивированная вакцина против гепатита А готовится из очищенного вируса, предварительно размноженного в культуре клеток с последующей инактивацией его по технологии, подобной изготовлению "убитой" полиомиелитной вакцины. Инактивация вируса -один из важнейших этапов производства препарата, и поэтому этот процесс должен быть тщательно изучен и оценен. Вакцины, изготовляемые в настоящее время, показали высокую иммунологическую эффективность при использовании двух различных адьювантов, в том числе гидроокиси алюминия или липосом. Проведенные испытания таких вакцин показали их высокую эффективность.
Для размножения и накопления вируса гепатита А используются либо диплоидные клетки человека (ДКЧ), либо перевиваемые линии клеток почек обезьян зеленых мартышек (КПЗМ), либо диплоидные клетки обезьян макака резус - FRhL-2. При этом данные клеточные системы должны отвечать современным требованиям Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) к использованию клеток животных как субстрата для производства биологических препаратов (WHO, TRS № 878, Geneva, Annex 1, 1998), а также быть одобрены и зарегистрированы национальными контрольными органами - Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.
Наибольшим потенциальным риском, который влияет на получение безопасного препарата, является использование клеток животных для накопления вакцинных вирусов. Он связан с тремя категориями неблагоприятных факторов, которые могут повлиять на качество вакцин. Первый из них - возможная контаминация клеточного субстрата посторонними вирусами и/или другими контаминантами, такими например, как микоплазмами, бактериями, грибами. Второй фактор - остаточная клеточная ДНК перевиваемых линий клеток, если последние использовались как субстрат для изготовления вакцины. И третий фактор - белки, усиливающие рост.
С целью обеспечения возможности получения производственных культур клеток из перевиваемых линий используют систему производственного и рабочего банков клеток (V. Grachev, 1990). При этом производственный банк клеток получают, как правило, из селективного клона клеток. Рабочий банк перевиваемых линий клеток готовят из одной или нескольких ампул производственного банка.
Клеточная линия должна быть проверена на отсутствие контаминации бактериями, микоплазмами, грибами и инфекционными вирусами, а также потенциально-онкогенными агентами (WHO, TRS № 878, eneva, 1998, Annex 1). Специальное внимание должно быть уделено тем вирусам, которые могут происходить из источника животного происхождения данной клеточной системы. Посевные клетки должны быть полностью свободны от всех посторонних агентов. Однако некоторые перевиваемые линии клеток экспрессируют эндогенные вирусы, т.е. ретровирусы. При этом должны быть разработаны соответствующие тесты, способные определить такие агенты, и результаты таких определений должны быть описаны. Необходимо разработать методики, которые позволят либо инактивировать, либо удалить в процессе производства биопрепарата специфические контаминанты, идентифицированные как эндогенные агенты в производственном и рабочем банках клеток. Одновременно должны быть описаны и представлены используемые методы оценки (WHO, Geneva, 1997).
Необходимо иметь данные по характеристике перевиваемой клеточной линии, используемой для производства вакцины гепатита А. Эта информация должна включать: историю клеточной линии, детальные описания получения клеточных банков, включая методы и реагенты, используемые в культуре, уровень пассажа культуры "in vitro", условия хранения, результаты тестов на посторонние инфекционные агенты, результаты контроля на возможную контаминацию этой клеточной системы клетками других клеточных линий, включая такие методы, как биохимические, иммунологические или морфологические (цитопатические
изменения в клетках). Кроме того, должны быть представлены сведения по изучению туморогенной активности этой клеточной линии, включая опубликованные в литературе данные.
В то время как перевиваемые линии клеток имеют неограниченный срок жизни, туморогенные свойства клеток проявляются на определенном уровне пассажа, и с увеличением количества пассажей усиливаются эти неблагоприятные свойства. В связи с этим, весьма важно установить этот уровень для каждой конкретной линии и использовать для производства клетки заведомо ниже данного уровня (V. Grachev, 1990).
Сыворотка, используемая для культивирования перевиваемой клеточной линии, должна быть проверена на бактериальные, грибковые и микоплазменные контаминанты, свободна от инфекционных вирусов, а также иметь сертификат, что она получена из хозяйства, свободного от бычьей энцефалопатии крупного рогатого скота ("коровье бешенство") (WHO, Geneva, 1997). Трипсин, применяемый для перевивания клеток, должен быть аттестован в соответствии с действующими международными требованиями (TRS № 878, Geneva, 1998) в отношении отсутствия посторонних агентов.
Вирусные штаммы гепатита А, применяемые для производства инактивированной вакцины, должны быть одобрены национальными контрольными органами. Производственный штамм вируса необходимо идентифицировать и иметь полную информацию, включая происхождение вируса. Штамм должен полностью отвечать современным международным требованиям к гепатитным вакцинам A (WHO, TRS № 858, Geneva, 1995), а также доказать в процессе полевых испытаний безопасность и эффективность вакцины, изготовленной из данного штамма.
При этом необходимо подчеркнуть, что изготовление инактивированной вакцины против гепатита А основано на системе посевного вируса. Рабочий посевной вирус, используемый для изготовления серий препарата, должен быть изготовлен из производственного вируса с использованием методов, одобренных национальными контрольными органами. Каждая серия как производственного, так и рабочего посевного вируса должна быть строго проконтролирована в соответствии с действующими требованиями. Методы контроля должны включать прежде всего идентификацию вируса гепатита А. Для этих целей используются серологические методы, включая энзиматическую иммунную реакцию или реакцию нейтрализации с применением референс сывороток или моноклональных антител к вирусу гепатита А. Посевные вирусы должны быть также проверены на бактериальную, грибковую и микоплазменную стерильность. Кроме того, каждая серия посевного вируса должна быть тщательно проверена в культурах клеток на контаминацию посторонними вирусными агентами.
Как уже подчеркивалось выше, в технологии производства вакцин особое внимание должно быть уделено процессу инактивации вируса гепатита А. При этом обращается внимание на два фактора: полноту инактивации вируса и сохранение антигенности полученного препарата. Вирус перед инактивацией подвергается очистке с целью удаления клеточного детрита, что гарантирует полноту его инактивации при последующей обработке. Кроме того, очистка каждой объединенной партии производится такими методами, которые позволяют удалять остаточную клеточную ДНК до уровня 10 нг на одну прививочную дозу человека (WHO, TRS № 878, Geneva, 1998, Annexl), Данный процесс должен быть оценен, запротоколирован и согласован с национальными контрольными органами. Процесс инактивации вируса должен быть тщательно изучен, определена кинетика инактивации и методы ее оценки при обязательном согласовании этих условий с национальными контрольными органами.
Каждая партия полуфабриката вакцины гепатита А должна быть проверена на эффективность инактивации с использованием проб полуфабриката, взятых на разных временных точках процесса инактивации вируса, в том числе за три четверти и в конце этого периода, применяя на упомянутых уровнях не менее 1500 доз для человека на каждую пробу. Исследование проб полуфабриката на полноту инактивации проводят в чувствительной клеточной системе.
Готовая серия препарата проверяется по целому ряду параметров в соответствии с международными требованиями ВОЗ (WHO, TRS № 858, Geneva, 1995) и национальными контрольными органами. Этот перечень контролен включает следующие тесты: идентичность, потентность, стерильность, общая безопасность (инокуляция мышей и морских свинок), содержание эндотоксинов, консервантов, определение количества белка и количества адьювантов, остаточная влажность.
В настоящее время в России зарегистрированы следующие вакцины для профилактики гепатита А: отечественная вакцина против гепатита А-культуральная концентрированная очищенная инактивированная сорбированная (ГЕП-А-ин-ВАК) (Н.В.Медуницын, 1999), "Хаврикс" фирмы "Smithkline Beecham", Бельгия (В.И.Сергевнин, И.С.Шарипова, 1998),
"Аваксим", фирмы "Пастер Мерье Каннот", Франция (М.А.Горбунов и др., 1999). Кроме того, инактивированные вакцины для профилактики гепатита А выпускают Швейцарская фирма вакцин и сывороток (Берн) и др.
Инактивированные вакцины против гепатита А являются безопасными (М. Justand, R. Berger, 1992, М. Горбунов и др., 1995) и высокоиммуногенными препаратами (В.И. Сергевнин, И.С. Шарипова, 1998; Л.Г. Карпович и др., 1995; R. Richtmann et al., 1996; М.А. Горбунов и др., 1998, 1999).
B.П. Грачев, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова, РАМН.
ДЕЛЬТА ИНФЕКЦИЯ.
Исследованиями последних 20 лет показано, что значительная часть заболеваний печени является следствием одновременного инфицирования вирусами гепатитов В (HBV) и D (HDV-дельта). Число HDV- инфицированных лиц в мире превышает 15 млн. чел. (М.С. Балаян, М.И. Михайлов, 1999).
Возбудитель дельта инфекции открыт в 1977 году (М. Rizzetto et.al.,1980). Это единственный представитель семейства сателлитов - вироидов, патогенный для человека (SJ. Hadziyannis,1997). Изучена структура его РНК (1679 нуклеотидов), пептидных компонентов вириона (антигены L,S,HBsAg) (E.B. Рыжова и др., 1998). Уникальными особенностями HDV являются участие в его жизненном цикле вируса помощника HBV (S.E. Davies et.al., 1992), механизм синтеза PHK-HDV- одвойной катящийся круг», рибозимная активность РНК-HBV, клеточно-опосредованная РНК-зависимая репликация, пострепликативная модификация и фосфорилирование L-антигена (М.М. Lai 1995; D.J. Gail, 1995). Недостаточно изучены механизмы проникновения вируса в клетку, открыт вопрос об «изолированной» HDV-инфекции, неясной остается роль часто сочетаного выявления HDV и HGV (S. Heringlake et.al., 1996). Изучение дельта вирусной инфекции возможно при экспериментальном заражении различных животных: человекообразных обезьян, лесных сурков, пекинских уток, тупайя (J.M. Cullen et.al.,1995; Q. Li et.al.,1995; М.С. Балаян, М.И. Михайлов, 1999). HDV генетически гетерогенен - выявлены 3 генотипа и несколько субтипов вируса (J.L. Casey et.al. 1993;
C.Н.Соринсон,1998).
HDV приводит как к прямому повреждению ткани печени, так и к ряду аутоиммунных сдвигов в организме. Описано цитопатическое действие вируса на гепатоциты (А.С. Логинов и др., 1982, 1989, 1993). HDV ассоциирован с широким спектром аутоантител, в том числе LKM-3, роль которых в патогенезе неясна (Т. Philipp et.al., 1995; М.Р. Manns, 1997). Гепатит D, как и гепатит В, считается строго антропонозной инфекцией, распространяющейся с кровью больных. Выделяют географические зоны высокой, средней, низкой и очень низкой эндемичности по HDV (М. Rizzetto et al.,1980; C.O. Вязов и др. 1989; Д. Кренычек, 1990). За последние годы на фоне резкого снижения активной HDV-инфекции в развитых странах, как следствие вакцинации против HBV, регистрируется широкое распространение HDV в среде наркоманов (С.А. Navasaus et al.,1995).
Дельта инфекция протекает в форме суперинфекции и коинфекции (A. Luk et.al., 1985; Sh. Sherlock, J. Dooley, 1997). Течение дельта суперинфекции можно разделить на 3 фазы: активной репликации HDV, хронической и фазы развития ЦП, или гепатомы, или ремиссии (J.C. Wu et . al., 1995). Коинфекция чаще всего - самоограничивающийся процесс (Ш.Шерлок, 1999; П.Р. МакНелли, 1999). Независимо от механизма возникновения, хронический гепатит (XT) D отличается чаще всего прогрессирующим течением и высокой циррозогенностью (С.Н. Соринсон, 1998). Типичны обострения с высокой активностью гепатита (А.П. Куперштейн и др., 1990; Y.F. Liaw, 1995). Естественное течение ХГ-D бимодально. У 10-15% больных заболевание быстро прогрессирует до печеночной недостаточности. У 85-90% течение бессимптомно в течение многих лет, но цирроз печени (ЦП) развивается и в этом случае. Так, по нашим данным, ЦП диагносцировался у 78,8% HDV-позитивных больных и лишь у 42% при изолированных HBV-поражениях печени (Б.Н. Левитан, 1994, А.В. Дедов, 1995). Это объясняет факт, что наиболее ранним проявлением HDV является в 21,24% случаев отечно-асцитический синдром против 2,28% дельта-негативных ХГ (А.В. Дедов, 1995). Достоверно чаще (р<0.05) при дельта инфекции наблюдались астенический синдром, лихорадка, желтуха, периферические отеки, асцит, спленомегалия, высокая лабораторная активность процесса по сравнению с HBV(+)). У HDV(+) ХГ быстро прогрессирующие формы наблюдались у 69,1% против 32,;% у HBV(+) (р<0.001) (А.В. Дедов, 1995). Вместе с тем HDV, по- видимому, играет незначительную роль в гепатокарциногенезе (S. Cronberg et.al., 1984; T.J. Huo,1996 et.al.).
На течение дельта инфекции влияет фенотип HLA больных. При исследовании больных выявлено значительное повышение частоты HLA-B35 (RR=3.37,p<0.01) и HLA-B8 (RR=6.88,p<0.01) у русских и HLA-B35(RR=3.77,p<0.01) и HLA-B40 (RR=2.55,p<0.01) у казахов
