CC BY
19ДЕЛЬТА ГЕПАТИТ (ВИРУСОЛОГИЯ, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ, ПАТОМОРФОЛОГИЯ).
1. Дельта вирус: таксономия, структура, молекулярная биология, жизненный
цикл.
Этиологический агент гепатита дельта является наиболее необычным среди всех гепатотропных вирусов человека. Новейшие данные по молекулярной биологии HDV подтверждают его место среди так называемых «сателлитов» (спутников) в семействе субвирусных агентов, некоторые из которых являются патогенными для высших растений. HDV - единственный известный представитель семейства сателлитов, заражающий ряд видов животных и человека (Hadziyannis S J.,1997; Балаян М.С. , Михайлов М.И.,1999).
Возбудитель дельта инфекции открыт М. Rizzetto в 1977 году. Он имеет форму сферы диаметром 28 - 39 нм и состоит из однонитевой циркулярной молекулы РНК (примерно 1700 нуклеотидов), двух дельта - антигенов (DAg) -p24(DAg-Sma!l) и р27 (DAg-Large) и «оболочки», составленной из больших (large), средних (middle) и малых (small) покровных белков, кодируемых геномом вируса гепатита В (L, М и S-протеины) (Рис.1). D-Ag -p24 стимулирует скорость репликации вирусной РНК, a D-Ag-p27 тормозит ее (соответственно их называют «геномный» и «антигеномный» белки). Белок р27 способствует перемещению компонентов вируса на периферию клетки и самосборке готовых вирионов. Такая структура D-Ag обусловливает изменчивость репликативной активности вируса на протяжении инфекционного процесса, а также позволяет предположить существование более и менее активных штаммов HDV. DAg-Small и DAg-Large имеют общие эпитопы, к которым в инфицированном организме образуются антитела. DAg-Large больше, чем DAg-Small, на 19 карбокситерминальных аминокислотных остатков. Имеются антитела, специфичные именно для этой зоны, что позволяет изучать внутриклеточное распределение соответствующих антигенов (Bonino F. et al., 1981; Sureau С. et al.,1993; Семилетен Ю.А. и др., 1993; Xia Y.T., Lai M.M., 1992; Макнайт С.Л.,1991; Вазыхова Ф.Г., Вязов С.О., Ананьев В.А., 1989; Gail D.G.,1995).
Уникальной особенностью HDV является его теснейшая связь с HBV. Хотя «выживать» в печени и синтезировать DAg вирус дельта может и в отсутствие определяемых количеств HBV, зрелые вирионы, способные заражать новые клетки, формируются исключительно при наличии покровных белков, кодируемых HBV (Chen P.H. et al. 1992; Davies S.E. et al. 1992; Ryley N.G. et al.,1992).
Неоднократно высказывались предположения, что может иметь место так называемый «автономный» или изолированный гепатит D (особенно в отношении трансплантатов печени). Однако дальнейшие исследования доказали, что HBV необходим для формирования полноценных частиц HDV во всех случаях. В самое последнее время получены экспериментальные данные, что HDV может размножаться в организме приматов
СХЕМА'СТРОЕШ Я ВИРУСА ГЕПАТШЛО (HDV^
без участия HBV, причем никаких повреждений не наблюдается. Предположительно наружная оболочка дельта вируса формируется при этом из клеточных белков, вследствие чего его обнаружение затруднено (Балаян М.С. , Михайлов М.И., 1999; Smedile A., 1998).
Находясь в одном организме, два вируса оказывают влияние друг на друга, что выражается понятием «интерференция вирусов». Чаще всего HDV подавляет репликацию «вируса-помощника». Одним из возможных объяснений этого факта являются данные о стимуляции HDV внутриклеточного синтеза интерферона, который вызывает ингибирование репликации HBV. Поэтому, забегая вперед, следует указать, что одним из признаков хронической дельта инфекции нередко являются низкие титры сывороточного HBsAg, отсутствие HbeAg, малое количество НВс-позитивных гепатоцитов в биоптатах печени, определяемых методом иммунофлуоресценции. В ряде случаев это подавление столь сильно, что маркеры HBV полностью исчезают из жидкостей организма. При этом иногда на какое-то время замедляется прогрессирование имеющегося у больного хронического гепатита НВ-вирусной этиологии. И если не определять маркеры HDV, к которым относятся DAg, anti-D- антитела (anti-D-Ab) - суммарные или изолированно IgG и IgM, то может быть поставлен ошибочный диагноз «криптогенного» или «токсического» гепатита или ЦП (Ryley N.G. et al.,1992; Raimondo G. et al., 1991; Ivarsson S., 1992; Lay J.G., 1992).
Малоизученной проблемой является взаимодействие между HDV и мутантами HBV (Wu-JC. et al., 1996).
Достаточно часто встречаются случаи микст инфекции HBV+HDV+HCV, обычно протекающие тяжелее изолированных поражений печени. При множественной гепатотропной инфекции ЦП развивается чаще. Сочетанная инфекция B+C+D ассоциирована с пониженной репликацией HCV. У пациентов данной группы HCV RNA и маркеры репликации HBV были негативными в 80% случаев (Mathurin-P,, 2000).
Интерес представляет информация о частом одновременном инфицировании больных ХДЗП новым гепатотропным вирусом HGV, достигающем 16% при HBV, 20% при HCV и до 36% при дельта инфекции. Клиническое значение этого факта неясно, но, по-видимому, HGV не оказывает существенного влияния на течение сопутствующего вирусного XT (Heringlake S. et al, 1996).
Механизм прикрепления, проникновения в клетку и «раздевания» HDV в клетках мало изучен. По-видимому, в прикреплении участвует HbsAg (через пептиды pre-Sl, pre-82, S). Инфицированные гепатоциты содержат как геномные (+), так и антигеномные (-) молекулы РНК HDV в соотношении 5-30:1. РНК HDV представлена линейными и циклическими формами. Общее число молекул РНК HDV может достигать 1-3*10Л5 копий в одной клетке.
РНК HDV способна аутокаталитически расщепляться и вновь соединять себя в единое целое (ribozyme activity). РНК подвергается РНК-зависимой репликации через механизм «двойного катящегося круга» (double rolling circle mechanism). По-видимому, этому способствует клеточная ДНК-зависимая РНК-полимераза II и модифицированные внутриклеточные механизмы транскрипции. Возможно, антигеномные нити РНК сворачиваются в кольцо с последующим синтезом (+)- цепи. В процессе репликации HDV-РНК подвергается специфическому «редактированию» (editing)- пострепликативной модификации с расширением открытой рамки считывания. При этом образуется «большой» DAg -р27. Рибозимная активность, клеточио-опосредованная РНК-зависимая репликация HDV- РНК и «редактирование» РНК являются некоторыми из уникальных особенностей молекулярной биологии HDV. Имеются сообщения о наличии еще одной формы D-Ag, образующейся в процессе репликации генома. Новая форма не формируется во всех инфицированных клетках, однако к ней образуются антитела. Молекулярно-геиетические исследования указывают на обязательность фосфорилирования специфических участков (sites) DAg-Large, но не DAg-Small в клетках инфицированной печени. Значение этого процесса не вполне выяснено. Полученные данные указывают на сложность экспрессии генов при инфицировании и репликации HDV(Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999;
Lai M.M.,1995; Bicliko V.V., Khudyakov Y.E., Taylor J.M.,1996; Bichko V.; Barik S.; Taylor J., 1997).
Сравнение последовательностей аминокислот из полуконсервативного региона от 14 изолятов HDV-PHK показало, что существует не менее 3 генотипов HDV(Casey J.L. et al., 1993).
Генотипы HDV разделяют на типы I, II и III. Наиболее широко и повсеместно распространен генотип I, характерный для Европы, Северной Америки, Среднего Востока, Южной части Тихоокеанского региона и Азии, а также для России. Он разделяется на субтипы 1а и 1b. При этом ХГ-D, вызываемый субтипом 1а, протекает легче, а субтипом 1в, который чаще встречается у наркоманов, тяжелее. Тип II обнаруживается только в Японии. Генотип III регистрируется преимущественно на Севере Южной Америки. Все генотипы относятся к одному серотипу, поэтому образующиеся к ним антитела универсальны. Выявлены несколько изолятов HDV, также имеющих некоторые генетические различия (By Schmid R., Blum H.E., Maier K.P. et al.,1996; Соринсон С.Н., 1998; Smedile A. 1994; Niro G.A. etal, 1997).
В настоящее время ген, кодирующий DAg, хорошо изучен, выделен и клонирован с помощью обратной транскриптазы и ПЦР путем введения вектора в E.coli. Наблюдалась выраженная экспрессия DAg в бактериальной клетке. Одновременно экспрессировались «малые» и «большие» формы антигенов в бактериальных линиях с мутацией Sup Е. Разработан лабораторный метод для выявления anti-D-Ab в крови больных на основе полученных при клонировании рскомбинантных форм Dag (Рыжова Е.В., Ивашошина В.А., Грудшшн М.П. и ДР,1998).
Исследовалась и такая важная проблема, как стабильность генома HDV. Считается, что одной из возможных причин спонтанных реактиваций, чрезвычайно характерных для дельта инфекции, может быть спонтанная эволюция вируса. Доказано, что состав PHK-HDV, то есть последовательность ее нуклеотидных пар, меняется на протяжении болезни у одного и того же больного. Происходит мутация вируса, причем с довольно значительной скоростью. Момент изменения структуры вируса часто связан с переходом от острой фазы к хронической, а также с обострениями ХГ- дельта. Клинической вариабельности, по мнению исследователей США, па биологическом уровне соответствует чрезвычайная молекулярная гетерогенность HDV (Логинов А.С., Блок Ю.Е., 1987; Kate ten F.J., Schalm S.W., Willemse P.J. et al., 1992; Lee C.M., Bih F.J., Chao Y.C. et al., 1992).
Методом секвеиационного анализа изучены генетические повреждения вирусной РНК в 9 ежегодно собиравшихся пробах от 1 больного и в парных сыворотках, взятых от б больных хронической дельта инфекцией попарно с интервалами от 2 до 10 лет (исследования шведских вирусологов). При этом были обнаружены только мутационные изменения, но не вставки или делеции, а преимущественно замены нуклеотидов. Установлено, что шведский изолят HDV мутирует со средней скоростью 1Д*10Л-3 замен на 1 нуклеотид в год, что соответствует скорости мутации других РНК-овых вирусов (ZhangY.Y., Hansson B.G., 1996).
Экспериментальные данные, полученные на животных моделях (лесных сурках) при многократном пассаже HDV, секвенировании и молекулярном клонировании генетического материала HDV, не выявили значительных изменений генома. (Для этого вначале была проведена трансфекция полностью секвеиированной 1679- нуклеотидиой комплиментарной ДНК). Установлена неизменность 32% клонов; в остальных случаях обнаружены единичные замены нуклеотидов, в основном У->Ц и А->Г. Значительная часть из 40 выявленных изменений- 35% (14 из 40) приходилась па зону из 8 нуклеотидов, включающих позицию 1012, - место пострепликативной модификации вируса (Niro G.A., 1997). В структуре РНК HDV были обнаружены и консервативные регионы, окружающие зону посттрансляционных изменений и так называемую полиадениловую сигнальную область ((WuJ.C. etal., 1995).
Наибольшая стабильность генома выявлена в зонах аутокаталитического расщепления, соединений между средней и карбокситерминальной третями доменов, и средним доменом открытой рамки считывания для D-Ag- на антигеномной РНК HDV. В этих регионах дивергенция нуклеотидпых пар была минимальной (Wu J.C. et al., 1996).
Таким образом, молекулярно-гепетические исследования позволили, в основном, расшифровать первичную структуру HDV. а также разобраться в механизмах патогенеза дельта инфекции. Однако некоторые нюансы еще требуют своего изучения (Modahl L.E.; Lai M.M., 2000),
2. Экспериментальные модели дельта инфекции.
Вирус гепатита D может быть обнаружен в гепатоцитах и в крови больных острой и хронической дельта инфекцией. Экспериментальное заражение дельта вирусом человекообразных обезьян - носителей HbsAg и лесных сурков (Woodchucks), хронически инфицированных вирусом гепатита сурков (WHV), вызывало острую суперинфекцию. При этом через 2 недели после заражения в гепатоцитах определялся DAg. Другой лабораторной моделью является воспроизведение дельта инфекции при заражении пекинских уток (Anas domesticus) -носителей вируса гепатита пекинских уток (DHV) (Балаян М.С., Михайлов М.И., 1991).
У лесных сурков, инфицированных HDV, не обнаружено различий в распределении DAg-Small и суммарного DAg - в основном они оба находятся в ядрах гепатоцитов. У очень малого числа клеток выявлялось цитоплазматическое окрашивание на DAg. Чаще всего наблюдалось полное или частичное зернистое окрашивание нуклеоплазмы и ядрышек гепатоцитов. В течение 31 дня инфекции 0.1-19% (в среднем - 7,4%) всех гепатоцитов содержало DAg. Из них D-Ag-Large содержали 0-100% клеток (в среднем 39%), и количество повышалось в течение 1 месяца инфекции. Количество D-Ag- позитивных ядрышек и % окрашивания на D-Ag-Large уменьшались по мере хронизации, коррелируя со снижением уровня виремии. Таким образом, D-Ag-Large имеет то же внутриклеточное распределение, что и D-Ag-Small, и обнаруживается в повышенном количестве в ядрах инфицированных клеток во время острой инфекции. Эти данные, по-видимому, можно экстраполировать на человека(Си!1еп J.M. et al 1995).
На основании того факта, что DAg-Small инициирует вирусную репликацию, a DAg-Large ее ингибирует, выдвинута гипотеза, согласно которой эффективность пострепликативной модификации HDV- РНК, то есть внутриклеточное соотношение L/S геномов, может быть определяющим фактором течения инфекции. Исследования на лесных сурках методом секвенационного анализа с определением L/S геномов (в %) дали следующие результаты. На ранней стадии инфицирования доля L- генома была больше, чем в поздней стадии во всех случаях. При этом % L-генома был выше в случаях с транзиторной виремией, чем при персистировании виремии. Относительно большее снижение L- генома наблюдалось позднее у животных с транзиторной виремией по сравнению с теми, у кого виремия персистировала. Предлагается гипотеза патогенеза HDV, предсказывающая исход острой инфекции. Предлагается генно-терапевтический подход к данному заболеванию, основанный па внутриклеточном, накоплении (повышении содержания) L- генома (Yang A. et al., 1995).
Модель HDV- инфекции на лесных сурках использована и для оценки стабильности генома дельта вируса (Niro G.A.,1995).
Новая модель дельта инфекции разработана китайскими исследователями. Использовалась тупайя - древесная землеройка, зараженная HBV методом инокуляции человеческой HBV-ДНК позитивной сыворотки. При последующем введении HDV удалось воспроизвести картину как дельта коинфекции, так и суперинфекции. Удалась также трансмиссия HDV/HBV от животного к животному. В ряде случаев зафиксировано персистирование дельта вируса с развитием хронической дельта инфекции. При этом регистрировалось повышение уровня сывороточных АЛТ и гепатитоподобные изменения в ткани печени, аналогичные таковым у инфицированных шимпанзе. По-видимому, тупайя является удачной экспериментальной моделью дельта инфекции (Li Q.,1995).
Недавно установлен факт выживания, персистирования гепатоцитов у трансплантированных особей того же или родственного вида. Достигнуто длительное приживление человеческих гепатоцитов у грызунов, в частности у мышей (Ohashi К. et al., 2000). Это гораздо более совершенная и перспективная модель, чем трансгенные мыши, экспрессирующие геном HBV.
Экспериментальные модели дельта гепатита являются абсолютно необходимым инструментом при изучении патогенеза и разработке новых противовирусных препаратов. Создание их является важнейшим вкладом в вирусологию.
3. Патологическая морфология дельта инфекции.
Присутствие HDV в гепатоцитах приводит к развитию достаточно характерных патологических изменений. Описывается феномен «песочно-клеточных ядер» цитопатическое действие вируса. Гепатоциты могут становиться двуядерными или гигаитоядерными. Однако клетки с подобными патопюмоничными признаками встречаются нечасто. Морфологические исследования обычно выявляют постоянно высокую активность воспаления в печеночной ткани при дельта инфекции. Выражена инфильтрация портальных трактов, с некрозами разной степени, разрушением пограничной пластинки. Отмечается повреждение желчных протоков, расширение синусоидов с их капилляр изацией, дегенерация и дистрофия гепатоцитов в сочетании с разрастанием грубой фиброзной соединительной ткани. При переходе ХГ в ЦП появляются ложные дольки, порто -портальные тяжи и фиброзные поля, инфильтрированные лимфоидными клетками. В единичных биоптатах обнаруживают целые поля дельта - позитивных гепатоцитов (иммунофлуоресцегщия). Но, в основном, дельта- антиген определяется только в отдельных клетках или небольших клеточных группах, расположенных центролобулярно. Их можно видеть среди впутридольковых инфильтратов, в зонах ступенчатых некрозов, а также среди неизмененных гепатоцитов. Выявление в биоптатах единичных некротизированных гепатоцитов, не окруженных элементами воспалительного инфильтрата, в отличие от гепатита В, подтверждает наличие прямого цитопатического действия HDV и иммунного цитолиза, индуцированного HBV.
Б.Н. Левитан, А.В. Дедов, Астраханская Государственная медицинская академия.
КЛИНИКО-ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА В У ДЕТЕЙ. Хронические воспалительные заболевания печени у детей продолжают оставаться одной из современных проблем педиатрии (Апросина З.Г., Серов В.В., 1996; Рахманова А.Г., Мурадпазарова Т.Б. с соавт,, 1990; Рахманова А.Г., Яковлева А.А.,1999; Учайкин В.Ф., Чередниченко Т.В., 1992; Ш.Шерлок, Дж.Дули, 1998), Вирусный гепатит В является основной 'Причиной развития хронических заболеваний печени. По данным ВОЗ на земном шаре более 350 млн. человек инфицированы вирусом гепатита В (Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999).
Одной из интересных и нерешённых проблем является выявление причин, приводящих при одном и том же типе возбудителя к различным исходам болезни - от выздоровления до перехода в хронический гепатит (Соринсон С.Н., 1998; Hogihara M. et al., 1997). Исследованиями многих авторов (Алиев Ш.Р.,1998; Бопдаренко А.Л., 1999; Журкин А.Т., 1990; I-Iameed F., Ahmed A.P., 1993; Lo Y.U., 1.993 и др.) установлено, что гепатит В является иммунологически опосредованной инфекцией, и изучение биологической роли комплекса HLA позволило выявлять существование генетического контроля иммунного ответа организма (Chernushova L., Puzik M.,1996; Hameed F., Ahmed A.P., 1993). В Туркменистане изучению хронического гепатита В в детском возрасте посвящены единичные публикации (Мамедова М.М., Эсенов Н.Э. с соавт., 1986, Рахманова А.Г. с соавт., 1990).
Целью настоящей работы являлось определение роли иммуногенетических факторов в сопоставлении с клипико-биохимическими и иммуногенетическими показателями в формировании различных вариантов течения и исходов хронических вирусных гепатитов В.
