CC BY
46НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ТРЕБОВАНИЙ К РЕКОМБИНАНТНЫМ ВАКЦИНАМ ГЕПАТИТА В.
Рекомбинантная вакцина для профилактики гепатита В является одним из первых препаратов, изготовляемых с помощью генноинженерных методов и широко применяемых в медицинской практике во всем мире, особенно после включения этой инфекции в расширенную программу иммунизации (РПИ) Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) для районов, эндемичных по этому заболеванию.
Требования к контролю рекомбинантных вакцин против гепатита В должны включать такие методы, которые бы обеспечили возможность получения высокоэффективного и безопасного препарата. При этом необходимо иметь в виду общие особенности ДНК технологии, в том числе и используемой для производства генноинженерной вакцины против гепатита В. Они заключаются прежде всего в том, что требуют уделить особое внимание очистке полученного иммуногена. Это вытекает из теоретической предпосылки о том, что во время экспрессии HBsAg могут параллельно ко-экспрессироваться другие нежелательные белки. Например, если транскрипция инициируется в нескольких сайтах или если происходят изменения, которые могут повлиять на транскрипцию, инициацию или конечный процесс, или экспрессию других генов в векторе или в клеточном субстрате.
Кроме того, в конечный препарат могут попасть биологически активные компоненты, такие как ДНК, белки, эндогенные ретровирусы, происходящие из клеточной системы, используемой для экспрессии HBsAg. И, наконец, активные вещества, используемые в процессе очистки конечного продукта. Все это ведет к тому, что при изготовлении вакцины против гепатита В по данной технологии особое внимание должно быть уделено контролю вакцины на этапах производства, начиная с характеристики исходного субстрата с включенной плазмидой, несущей ген, кодирующий поверхностный белок вируса гепатита В, и кончая полной характеристикой конечного препарата (Grachev, Magrath, 1993). При этом методы контроля включают тесты, применяемые для оценки инактивированных вирусных вакцин, изготовляемых по традиционной, классической технологии, такие, например, как стерильность, пирогенность, токсичность, содержание антигена, иммунологическая активность (WHO, TRS № 889, Geneva, 1999) и т.д. Однако специальное внимание, которое вытекает из особенностей ДНК технологии, уделяется оценке и характеристике рекомбинантной технологии, используемой при производстве генноинженерной вакцины гепатита В (WHO, TRS № 878, Geneva, 1998), имея в виду следующее.
Должна быть представлена полная характеристика биологических свойств клеточного субстрата и вектора экспрессии, включая генетические маркеры клеток и контроль на вирусоподобные частицы, сходные с ретровирусами, конструкция и генетические свойства вектора экспрессии, идентификация клонированного гена, физиологические показатели, используемые для промотора и контроля экспрессии клонированного гена в клеточном субстрате. Особое внимание должно быть уделено демонстрации стабильности системы экспрессии во время хранения рабочего посевного банка клеток. Должны быть также представлены описания нуклеотиднои последовательности введенного гена и примыкающих сегментов промотора, а также реструкционно-энзимная карта вектора, содержащего введенный ген.
Должны использоваться такие методы контроля, которые дают возможность показать идентичность рекомбинантного полипептида природному, включая аминокислотную композицию и аминокислотную последовательность поверхностного антигена.
Методы очистки HBsAg из культуральной жидкости, как уже было подчеркнуто, должны включать такие процедуры, которые гарантированно обеспечивают на каждом этапе очистки антигена удаление или инактивацию биологических субстанций, происходящих из клеточного субстрата или культуральной среды, особенно посторонние вирусные частицы, белки, нуклеиновые кислоты. Если в процессе очистки используются антитела, то должно быть дано их происхождение и характеристика. Методы очистки моиоклопальных антител, полученных из гибридомных клеточных линий, а также критерии очистки от остаточной клеточной ДНК и мышиных вирусов должны быть строго документированы. Все эти методы
должны соответствовать требованиям ВОЗ к вакцинам против гепатита В, изготовляемым с помощью ДНК технологии (TRS № 786, Geneva, 1989, TRS № 889, Geneva, 1999).
На основе данных электронной микроскопии, а также физико-химических методов, например, с применением центрифугирования в градиенте плотности, должна быть представлена морфологическая характеристика частиц HBsAg, В дополнение к этому должны быть проведены контроли на количественное содержание белка, липидов, нуклеиновой кислоты и карбогидрата.
Должна быть установлена композиция белка с помощью электрофореза. Для подтверждения получения ожидаемого HBV продукта с помощью встроенного гена проводится его идентификация с помощью методики чувствительной окраски или с применением специфических антител, где это возможно. Идентификация белков устанавливается с помощью анализа последовательности аминокислотного анализа N - и С -терминалов.
Рекомбинантная ДНК вакцина против гепатита В должна индуцировать образование антител у человека в той же степени, как и вакцина, изготовленная из плазмы крови человека, и эффективность которой проверена в полевых испытаниях. В соответствии с требованиями ВОЗ антитела, индуцируемые у человека, должны быть оттитрованы и охарактеризованы в аспекте их активности против соответствующих детерминант вируса гепатита В.
Производство рекомбинантной вакцины против гепатита В, также как и других вакцин с применением перевиваемых клеточных линий, должно быть основано на системе посевных клеток (TRS № 878, Geneva, 1998). При этом должна быть дана полная характеристика посевных клеток (клетки-хозяина в комбинации с системой вектора экспрессии), включая результаты контроля на посторонние агенты и генетическую гомогенность. Должен быть проведен анализ нуклеотидной последовательности HBsAg и представлен соответствующий протокол. Должна быть также получена пептидная карта и/или дана последовательность аминокислот продуктов гена. Банк рабочих посевных клеток должен поддерживаться в замороженном виде в соответствии с требованиями ВОЗ, сохраняя при этом фенотип и генотип рекомбинантного ДНК вектора, а также самих клеток, в которых включен ген, без изменений в процессе всего срока хранения.
Полученный в процессе производства HBsAg в соответствии с требованиями ВОЗ должен быть подвергнут очистке. При этом количество первичных сборов, используемых для сведения в объединенную серию полуфабриката, согласуется с национальными контрольными органами. Применяются адекватные методы очистки, основанные на использовании нескольких этапов, с применением различных принципов на каждом этапе. Это дает возможность снизить концентрацию клеточного материала в конечном продукте. Методы, используемые для очистки HBsAg, должны быть, согласованы и одобрены национальными контрольными органами.
Производственный опыт нескольких фирм, производящих рекомбинантную вакцину против гепатита В, показал, что возможно производить препарат, содержащий HBsAg в количестве по меньшей мере 95% от общего объема белка. Одним из методов очистки белков, который позволяет получить такого рода препарат, является электрофорез в полиакриламидном геле (WHO, № 786, Geneva, 1989). Необходимо подчеркнуть, что степень очистки, выраженная в процентах, зависит еще от применяемого метода измерения. Чистота рекомбинантной дрожжевой вакцины гепатита В фактически оценивается в 100% (J.Stephenne, 1990). Полиакриламидный электрофорез и окраска проб полуфабриката голубой кумасси показывает степень очистки полуфабриката в процессе промышленного производства на уровне 98-99% (J. Stephenne, 1990). Другими словами, очищенный полуфабрикат вакцины можно получить с содержанием очищенного специфического белка в пределах 98% и ДНК менее 10 pg на дозу при использовании метода гибридизации ДНК.
Современные рекомбинантные вакцины против гепатита В производятся с использованием нескольких биологических субстратов, в том числе Saccharomyces cerevisiae, трансформированных плазмидой, несущей ген наибольшего поверхностного белка S вируса гепатита В (HBV) (P. Valenzuela et al., 1982; N, Harford et al., 1983), или клеток яичника китайского хомячка (СНО), трансформированных ДНК, имеющей ген, кодирующий PreS + S
часть генома вируса гепатита В (M.L. Michel et al., 1984). Наиболее ранняя биологическая система, используемая для производства генноинженерной вакцины гепатита В, - это дрожжевые клетки, продуцирующие липопротеиновые частицы, содержащие S белок, в то время как СНО система продуцирует частицы, содержащие S и М белки в соотношении примерно 2:1. Очищенные HBs (S) или HBs (S, M) липо-протеиновые частицы адсорбируют на гидроокись алюминия в процессе приготовления вакцины.
В настоящее время в России зарегистрированы следующие вакцины для профилактики гепатита В: Рекомбивакс НВ, Merck Sharp & Dohme; Энджерикс В, Smithkline Beecham Biologicals; Хебербиовак, АО Эвер Биотек, Куба; Элвакс производства Южной Кореи и отечественная вакцина Комбиотех.
Кроме того, фирма Pasteur Merieux Serum et Vaccins выпускает вакцину Геневак. Генноинженерные вакцины гепатита В начали применяться в широкой медицинской практике с 1984-1985 гг. Вначале были лицензированы дрожжевые вакцины (J. Maynard et al, 1988), далее с применением клеточных субстратов животных (P. Tiollais and M. Michel, 1986; Т. Lee et al., 1989, A. Caputo et al., 1988 and H. Samanta and B. Youn, 1989). Рекомбинантные вакцины являются безопасными препаратами, обладают высокой иммунологической активностью (J. Fonseca et al., 1990; P. Dentico et al., 1990; V. Perez et al., 1990) и эффективностью (С. Goilav et al., 1990, N. Scheiermann et al, 1990). Кроме того, показано, что генноинженерные вакцины могут вводиться одновременно с другими вакцинами, такими как БЦЖ, АКДС и полно (R. Ellis, 1993) или в другом сочетании (Н. Медуницын, 1999). В.П. Грачев, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. МЛ. Чумакова РАМН.
ПРАКТИКА ПРИМЕНЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С в КАЧЕСТВЕ СТАНДАРТА в ЦЕПНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ РЕАКЦИИ.
Вирус гепатита С (ВГС), как и все РНК-содержащие вирусы, существует в форме квазивида. Гетерогенность популяций вируса, по-видимому, обуславливает персистенцию вируса в организме и ускользание от иммунитета. Более того, есть данные о том, что комплексность гипервариабельного района 1 у квазивида может быть фактором, предсказывающим неэффективность терапии интерфероном альфа у пациентов с хроническим гепатитом С (Moribe T.et al, 1995). Наличие в геноме ВГС консервативных районов является основой для развития тест-систем, использующих полимеразную цепную реакцию (ГТЦР). Эти консервативные районы располагаются в 5'-нетранслируемом районе и в гене, кодирующем белок капсида ВГС.
Поэтому была сконструирована плазмида, содержащая 5'-концевой не транслируемый район и последовательность, кодирующую капсидный белок. С этой плазмиды с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы нарабатывалась рекомбинантная РНК ВГС длиной около 800 нуклеотидов, которая изучалась в качестве стандарта в ПЦР (Мошков Е.А., Асади Мобархан А.Х. и др., 1999). Полученные результаты свидетельствуют о полной идентичности рекомбинантной РНК вирионной РНК при постановке ПЦР с использованием набора фирмы «Авиценна».
Но если при использовании сыворотки крови инфицированных людей содержание вирионов редко превышает 103-105 вирионов в миллилитре, то содержание рекомбинантной РНК обычно превышает 1010 копий в трех микролитрах.
На базе созданной рекомбинантной РНК разрабатывается количественная ПЦР.
Рекомбинантная РНК вируса гепатита С сохраняется при минус 20° С в течение более шести месяцев (срок наблюдения) без потери специфичности и без видимого снижения концентрации. Более того, при содержании в морозильнике бытового холодильника препарат контрольной РНК, используемый в качестве положительного контроля (К+) (10-6 разведение рекомбинантной РНК, полученной в результате транскрипции с рекомбинантной плазмиды), выдерживал более 200 циклов оттаивания-замораживания, тогда как РНК вируса гепатита С в сыворотке инфицированных не определялась после пяти-шести циклов замораживания-оттаивания.
