CC BY
158
УДК 577.21; 578.821
Роль гликозилирования белка Е2 вируса гепатита С в функционировании белков оболочки вируса в клетках насекомых и млекопитающих
О. В. Орлова1, В. Л. Друца2, П. В. Спирин1, А. В. Иванов1, В. С. Прасолов1, П. М. Рубцов1, С. Н. Кочетков1, С. Н. Белжеларская1*
1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова,32
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет,
119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3
*E-mail: belj@eimb.ru
Поступила в редакцию 15.09.2014
РЕФЕРАТ Белки оболочки вируса гепатита С (ВГС) E1 и E2, являясь компонентами вириона, участвуют в формировании инфекционных частиц вируса в зараженной клетке. Детальное строение частицы ВГС остается малоизученным, причем наименее изучен процесс сборки вирионов и их выход из клетки. Предполагается, что свойства вириона зависят от гликозилирования белковой оболочки вируса в клетке, а гликаны в некоторых сайтах гликозилирования этих белков важны для их функционирования и прохождения жизненного цикла ВГС. N-гликаны гликопротеинов могут влиять на формирование вирусных частиц, связывание вируса с клеткой и патогенез гепатита С. Мы изучили влияние гликанов на сворачивание гликопротеина Е2, образование функциональных гликопротеиновых комплексов и формирование вирусных частиц в клетках насекомых и млекопитающих. С этой целью в сайты N-гликозилирования Е2 вируса гепатита С (генотип 1б штамм 274933RU) вводили точечные мутации и анализировали мутантные белки в бакуловирусной системе экспрессии. Удаление единичных сайтов гликозилирования гликопротеина Е2, за исключением сайта N6, не сказывалось на эффективности его синтеза в клетках насекомых Sf9, а электрофоретическая подвижность мутантных белков возрастала пропорционально снижению числа сайтов гликозилирования. В отличие от клеток Sf9, уровень синтеза гликопротеина Е2 ВГС в клетках Hek293T человека зависел от присутствия гликанов в сайтах гликозилирования N1 и N8. В то же время удаление гликанов в сайтах N1, N2 и N10 приводило к накоплению непродуктивных димеров Е1Е2 в виде агрегатов и подавлению продуктивной сборки вирусоподобных частиц как в клетках насекомых, так и в клетках млекопитающих. Удаление единичных сайтов гликозилирования Е2 ВГС не влияло на синтез РНК структурных белков и образование вирусоподобных частиц в клетках насекомых и млекопитающих. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА бакуловирусная система экспрессии, белки оболочки E1 и E2, вирус гепатита С, вирусоподобные частицы, N-гликозилирование белков, клетки насекомых Sf9, клетки млекопитающих Hek293T и Huh7.0, олигонуклеотид-направленный мутагенез.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БОЕ - бляшкообразующие единицы; ВГС - вирус гепатита С; ВПЧ - вирусоподобные частицы; ЭР - эндоплазматический ретикулум.
ВВЕДЕНИЕ
Вирус гепатита С - один из существенных патогенов человека, который вызывает тяжелые заболевания печени, включая цирроз и гепатоцеллюлярную карциному. Выбор средств, применяемых при инфекции ВГС, очень ограничен, а профилактической вакцины не существует. Высокая репликативная активность вируса вместе с отсутствием у вирусной РНК-полимеразы корректорской функции создают
условия для большой генетической изменчивости вируса.
Все это приводит к тому, что в сыворотке инфицированного человека ВГС циркулирует не как один вид, а как совокупность квазивидов, геномы которых различаются на 1-5%. Разные штаммы вируса гепатита С одного подтипа могут отличаться по ну-клеотидной последовательности на 5-15%, подтипы на 10-30%, а отдельные генотипы на 30-50% [1].
Некоторые штаммы обладают повышенной вирулентностью, но конкретные молекулярные детерминанты, определяющие такой фенотип, еще не определены. Основной клеточной мишенью ВГС являются гепатоциты. Связывание вирусной частицы с клеткой все еще недостаточно изучено, известны не все рецепторы, в том числе специфичные для ВГС.
Связывание вирусной частицы с поверхностными рецепторами гепатоцитов и ее поглощение клетками определяются гликопротеинами оболочки вируса. Механизм сборки вирусных структурных белков и РНК в новые вирусные частицы, а также пути проникновения вируса в клетку по-прежнему недостаточно изучены [2]. ВГС - единственный представитель рода Hepacivirus - относится к семейству Flaviviridae. Его геном кодирует один полипротеин-предшественник. Под воздействием клеточных и вирусных протеаз образуются структурные и неструктурные белки вируса [3-5]. Капсидный белок C и белки оболочки E1 и E2 относятся к структурным белкам. Белки оболочки подвергаются посттрансляционной модификации - N-гликозилированию, при которой малоразветвленная олигосахаридная цепочка, состоящая из девяти остатков маннозы (Man) и трех остатков глюкозы (Glc), присоединяется к специфическим остаткам аспарагина в последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr (где X - любая аминокислота, кроме пролина) [6, 7]. Гликопротеины вирусной оболочки высоко гликозилированы. Степень консервативности сайтов гликозилирова-ния 9-11 в Е2 и 4-5 в Е1 очень высока, что указывает на их важную роль в функционировании этих белков в жизненном цикле ВГС [8]. Следует отметить, что до сих пор не известно истинное число сайтов гликозилирования белков, какие именно сайты участвуют в модификации белка и все ли потенциальные сайты подвергаются гликозилированию in vivo.
Характер гликозилирования гликопротеина играет важную роль в его функции. Так, гликопротеин E2 может быть рецепторсвязывающей субъединицей оболочки ВГС. Показано, что ряд гликанов Е2, в зависимости от штамма, может определять возможность проникновения вируса в клетку, создавая условия для взаимодействия гликопротеина E2 с клеточными рецепторами. Определенные гликаны Е2 вовлечены в модуляцию иммунного ответа. Предполагается, что гликаны, связанные с вирусной оболочкой, влияют на укладку белков с участием шаперонов эндо-плазматического ретикулума (ЭР) и продуктивную сборку вирусных частиц, способных проникать и инфицировать новую клетку. Присоединение олигоса-харида к белку сопряжено с его фолдингом, при этом гликопротеин входит в кальнексин-кальретикулино-вый цикл, специфически взаимодействуя с шаперо-
нами ЭР, которые обеспечивают его частичное сворачивание. Связывание гликопротеинов с шаперонами и освобождение от них сопровождаются отщеплением («подстриганием») избыточных остатков глюкозы и маннозы и регликозилированием N-связанных гликанов.
Белок оболочки Е2 накапливается в люмене ЭР как в виде правильно свернутого гликопротеина, так и в виде агрегатов неправильно свернутых белков. Некоторое количество Е2 остается негликози-лированным в цитозоле и после убиквитинирова-ния удаляется через протеасомный путь. Известно, что белок кальнексин взаимодействует с некова-лентно связанными комплексами E1E2, а кальрети-кулин - с агрегатами неправильно свернутых диме-ров Е1Е2 [9]. Комплексы первого типа обеспечивают связывание вируса с рецепторами клетки и проникновение вирусной частицы в клетку, влияют на формирование его антигенного состава и, возможно, играют определяющую роль в вирусном патогенезе [10]. Образование агрегатов неправильно свернутых гликопротеинов может приводить к появлению дефектных вирусных частиц, не способных, вероятно, к связыванию с новыми клетками [11-13]. Белки оболочки ВГС также могут влиять на сворачивание друг друга. Так, E2 действует как шаперон при фолдинге E1 и формировании функциональных гетеродимеров, но и белок E1 также помогает продуктивной укладке E2 [14, 15]. Процесс сборки вирионов ВГС недостаточно изучен из-за отсутствия приемлемых клеточных моделей, позволяющих получать инфекционные вирусные частицы. Роль гликанов в функционировании белков оболочки вируса различных генотипов в зараженной клетке также остается малоизученной.
В настоящей работе мы изучали влияние N-гликанов гликопротеина Е2 вируса гепатита С генотипа 1б (штамм 274933RU [16]) на синтез структурных белков, формирование вирусных частиц в клетках насекомых Sf9 и почки человека Hek293T, трансфици-рованных бакуловирусными векторами, направляющими экспрессию генов структурных белков ВГС [17].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные клетки, клеточные культуры и плазмиды. Использовали клетки Escherichia coli, клетки Spodoptera frugiperda Sf9 и клетки млекопитающих Hek293T и Huh7.0. Клетки штаммов DH5a и DH10Bac E. coli (Gibco-BRL, США) трансформировали плазмидными ДНК согласно рекомендациям фирмы (Amersham, США). Выделение и очистку плазмид, расщепление рестриктазами, лигирование, электрофорез ДНК в агарозном геле и другие генно-инженерные манипуляции проводили по стандартным протоколам [18].
Клетки насекомых Sf9 культивировали в среде Sf-900 II, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, при 27°С, используя основные технические приемы, разработанные ранее и описанные в инструкции [19]. Для определения титра вируса, амплификации рекомбинантного вируса, заражения клеток Sf9 рекомбинантным бакуловиру-сом и анализа экспрессии вирусных генов использовали ту же инструкцию.
Клетки эмбриональной почки человека (линия Нек293Т) культивировали в стандартной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 4 мМ Ь-глутамин, 1 мМ пируват натрия, стрептомицин/пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и 100 ед/мл соответственно, при температуре 37°С и атмосфере 5% С02.
Рекомбинантные конструкции, несущие кДНК, соответствующие генам структурных белков ВГС, рекомбинантные бакмиды, а также рекомбинант-ный бакуловирус bv-CE1E2 получали и анализировали по ранее отработанным методикам [20].
Сайт-направленный мутагенез. Фрагмент ДНК, соответствующий последовательности кДНК гена, кодирующего гликопротеин Е2 ВГС, клонировали в плазмиде pFastBacHTb по сайтам NcoI-EcoRI с использованием стандартного протокола [20]. Для получения серии рекомбинантных плазмид, несущих кДНК белка Е2 с точечными заменами в сайтах гликозилирования, сконструировали оли-гонуклеотидные праймеры (таблица). Каждый праймер состоял из 25-30 нуклеотидов и содержал последовательность, кодирующую сайт ^гликозилирования: Asn-X-Thr/Ser (Х^Рго), в котором триплет, кодирующий Asn, замещен триплетом, кодирующим Gln.
Для мутагенеза использовали метод, описанный Друцей и соавт. [21]. ПЦР проводили в программи-
руемом термостате ЦиклоТемп 107 (ЗАО «Ресурс Прибор», Россия). Наличие всех заданных замен нуклеотидов подтверждали секвенированием.
Анализ суммарной клеточной ДНК. Суммарную клеточную ДНК выделяли из клеток насекомых через 72 ч после заражения рекомбинантными ба-куловирусами bv-CE1E2, bv-E2mut, bv-E1E2mut, bv-CE1E2mut (с множественностью заражения 5 БОЕ/кл) [20]. Наличие кДНК генов структурных белков ВГС в суммарной клеточной ДНК оценивали с помощью ПЦР, используя праймеры к бакуловирусному вектору pFastBacHT (прямой 5'-GTGGTTGGCTACGTATACTCC-3', обратный 5'-CCTCTACAAATGTGGTATGGC-3').
Анализ РНК ВГС с помощью ОТ-ПЦР. Клетки Sf9 заражали рекомбинантными бакуловирусами bv-CE1E2mut (5 БОЕ/кл), инкубировали в течение 72 ч при 27°С. Через 72 ч отбирали среду и удаляли клеточный дебрис низкоскоростным центрифугированием, а супернатант центрифугировали через 30% сахарозную «подушку» при 230000 g в течение 16 ч при 4°С (центрифуга Becman Coulter Optima L-100XP, ротор 80Ti). РНК экстрагировали из осадка с помощью реагента TRIzol (Invitrogen) согласно рекомендациям производителя и обрабатывали ДНКазой I (Promega). Обратную транскрипцию проводили с использованием Phusion RT-PCR Kit (Thermo Scientific). Полученную кДНК амплифи-цировали методом ПЦР, используя праймеры к генам структурных и неструктурных белков ВГС. Суммарную клеточную РНК получали из зараженных рекомбинантными бакуловирусами bv-CE1E2mut (5 БОЕ/кл) клеток Sf9, инкубированных при 27°С в течение 72 ч и трижды промытых фос-фатно-солевым буфером PBS. Выделение РНК, обратную транскрипцию и амплификацию проводили по протоколам, указанным выше.
Использованные праймеры
Праймер Ориентация Нуклеотидная последовательность 5' ^ 3'
28-E2N1m - TG AAT ACC CAA GGC AGC TGG CAC AT
30-E2N2m - TGG CAC ATC CAA AGT ACT GCC CTA AAT TGC
30-E2N3m - GCC CTA AAT TGC CAA GAC TCC CTC CAA ACT
30-E2N4m - GCA CAC AAG TTC CAA TCG TCC GGG TGC CCG
25-E2N6m - TGG GGG GAG CAA GAG ACA GAC GTG A
30-E2N7m - GTG ATG CTC CTC CAA AAC ACG CGT CCG CCA
30-E2N8m - TGT ACA TGG ATG CAA AGT ACT GGG TTC ACT
27-E2N9m - GGG GTC GGT CAA CGC ACC TTG ATT TGC
30-E2N10m - TAC CCC TGC ACT CTC CAA TTT TTC CAT CAT
27-E2N11m - GCC GCA TGC CAA TGG ACT CGA GGA GAG CGC
E2 for + AGG TCT AGA ATG TTA TGA TTG TTT TGC TAC
E2 Back + CT ATA GTG TCA CCT AAA TCC GAA AGC TTC GGC CTC AGC TTG AG
Клетки Hek293T трансфицировали рекомби-натными плазмидами BacMamCE1E2mut-GFP (5 БОЕ/кл) и инкубировали при 37°С в течение 48 ч, затем отбирали среду, выделяли РНК, проводили обратную транскрипцию и амплификацию по протоколам, указанным выше.
Антитела к ВГС. Использовали моноклональные антитела мыши к белкам Е1 ВГС (Hep C E1 1879: sc-65459) и Е2 ВГС (Hep C E2 BDI167: sc-57769) (SantaCruz Biotechnology, США), а также моноклональные антитела к кальнексину (AF18) и каль-ретикулину (FMC75) (Abcam, Великобритания). Поликлональные антитела кролика к структурному белку C любезно предоставлены М.Г. Исагулянц (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва). В качестве вторичных антител использовали конъюгаты пероксидазы хрена с антителами против IgG мыши (AB6706-1EA) (Sigma, США).
Вестерн-блот и иммуноосаждение. Через 72 ч после заражения рекомбинантными бакуловирусами bv-E2mut, bv-E1E2mut, bv-CE1E2mut (множественность заражения 5 БОЕ/кл) клетки Sf9 собирали, трижды отмывали в PBS (1.47 мМ KH2PO4, 4.29 мМ Na2HPO4-7H2O, 137 мМ NaCl, 2.68 мМ KCl), ресуспен-дировали в лизирующем буфере TNC, содержащем 0.25% дигитонина, и разрушали ультразвуком. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием (15000 g, 15 мин, 4°С). Клеточный лизат наносили на 12% ПААГ, каждый образец содержал 10 мкг белка. После электрофореза белки переносили на ни-троцеллюлозную мембрану Hybond-ECL (Amersham Biosciences, США) методом полусухого электропереноса. Мембраны промывали в буфере PBS, содержащем 5% сухого обезжиренного молока, инкубировали с первичными антителами к структурным белкам Е1 или Е2 ВГС (в разведении 1 : 1500 для Е1 и 1 : 2000 для Е2), к кальнексину или к кальретикулину (в разведении 1 : 1000 и 1 : 2000 соответственно), а затем с вторичными антителами (в разведении 1 : 20000). Иммунные комплексы проявляли, используя хеми-люминесцентные реагенты ECL и ECL Plus (Western blotting detection reagents and analysis systems, Amersham Biosciences), согласно рекомендациям производителя.
Для иммуноосаждения клетки, инфицированные рекомбинантными бакуловирусами bv-E2mut, bv-E1E2mut и bv-CE1E2mut собирали через 72 ч после заражения, лизировали, удаляли клеточные обломки и ядра. Структурные белки и образуемые ими комплексы осаждали моноклональными антителами к Е1 ВГС и Е2 ВГС, кальнексину и кальретикулину в разведении 1 : 100 (согласно рекомендациям производителя). Осажденные белки разделяли при помощи электрофореза в 12% ПААГ, переносили на нитро-
целлюлозную мембрану и инкубировали с первичными антителами в разведениях, указанных выше, а затем обрабатывали вторичными антителами.
Анализ гликозилирования - обработка эндогли-козидазой Н (Endo H). Белки клеточного лизата инкубировали с соответствующими моноклональными антителами при 4°С. Полученный комплекс осаждали с помощью белок^-сефарозы (BioVision, США). К осажденному белку (20 мкг) добавляли 1 мкл десятикратного денатурирующего буфера (5% SDS, 0.4 M DTT), объем смеси доводили водой до 10 мкл и кипятили в течение 10 мин. Затем объем доводили до 20 мкл, добавляя 2 мкл десятикратного реакционного буфера G5 (50 мМ цитрат Na), 3 мкл воды и 5 мкл раствора Endo H (5 ед. акт.) (P0702S BioLabs Inc., Великобритания). Инкубировали в течение 15 ч при 370С и анализировали при помощи электрофореза в 12% ПААГ.
Получение и очистка вирусоподобных частиц (ВПЧ). Клетки, растущие в монослое при 27°С, заражали рекомбинантным бакуловирусом bv-CE1E2 (10 БОЕ/кл). Через 72 ч клетки (2 х 108) собирали, отмывали 3 раза PBS, ресуспендировали в лизиру-ющем буфере TNC: 10 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2, 1 мМ PMSF, коктейль ингибиторов протеаз II (Protease Inhibitor Cocktail II, Calbiochem, США) (1 : 200), содержащем 0.25% дигитонина, и разрушали ультразвуком. ВПЧ из гомогенизированных лизатов очищали от клеточных остатков низкоскоростным центрифугированием (1200 g, 15 мин, 4°С). Затем ВПЧ концентрировали центрифугированием через 30% сахарозную «подушку» при 230000 g в течение 16 ч при 4°С. Осадок ВПЧ ресуспендировали в буфере TNC, содержащем 1 мМ PMSF, ингибиторы протеаз (1 : 200), и анализировали с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы.
Центрифугирование в сахарозном градиенте. Осадок ВПЧ, ресуспендированный в 100 мкл буфера TNC, содержащего 1 мМ PMSF и ингибиторы протеаз (1 : 200), наслаивали на градиент концентраций сахарозы (от 10 до 60% в 50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 7.4) и центрифугировали при 200000 g в течение 2.5 ч при 4°С (центрифуга Beckman Coulter Optima L-100XP, ротор 80Ti). Собирали 10 фракций по 1 мл, затем каждую фракцию концентрировали высокоскоростным ультрацентрифугированием при 230000 g в течение 16 ч при 4°С, осадок растворяли в 100 мкл буфера TNC, содержащего 1 мМ PMSF и ингибиторы протеаз (1 : 200), и анализировали с помощью ве-стерн-блотинга [18, 22].
Анализ связывания ВПЧ с рецептором CD81. Клетки Huh7.0 инкубировали в присутствии ВПЧ, полученных в клетках Sf9, в течение 1 ч при 4оС. В качестве контроля использовали клетки Huh7.0,
предварительно инкубированные с антителами к CD81 (20 мкг/мл, 1 ч при 4оС) для блокировки рецептора CD81. Клетки собирали, дважды промывали PBS для удаления не связавшихся ВПЧ и анализировали с помощью вестерн-блотинга с антителами к Е2.
Флуоресцентная микроскопия и проточная цитофлуориметрия. Через 48 ч после трансфекции рекомбинантными плазмидами BacMamCE1E2mutGFP клетки Hek293T снимали с подложки раствором трипсина, собирали центрифугированием, дважды промывали фосфатно-со-левым буфером и анализировали в проточном ци-тофлуориметре (Beckman Coulter EPICS, США) и с помощью вестерн-блотинга.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Создание генно-инженерных конструкций и сайт-направленный мутагенез
Ранее мы изучили влияние N-гликанов белка Е1 ВГС на его фолдинг и сборку продуктивных гете-родимеров E1E2 в клетках насекомых и млекопитающих. Мы показали, что гликаны, связанные с сайтами N1 и N5 белка Е1, играют наиболее существенную роль в образовании правильной конфор-мации этих белков [23]. В настоящей работе мы исследовали участие гликанов гликопротеина Е2 ВГС
(генотип 1б штамм 274933RU [16]) в сворачивании гликопротеинов, образовании функциональных гликопротеиновых комплексов и формировании вирусных частиц в клетках насекомых и млекопитающих. Для этого ввели точечные мутации в сайты ^гликозилирования Е2 и экспрессировали гены мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих с использованием бакуловирусной системы экспрессии [17, 20].
Фрагмент ДНК, соответствующий последовательности кДНК гена, кодирующего гликопротеин Е2 ВГС, клонировали в плазмиде pFastBacHTb по сайтам NcoI-EcoRI с использованием стандартного протокола [20]. Для получения серии рекомбинантных плазмид, несущих кДНК белка Е2 с точечными заменами в сайтах гликозилирования, сконструировали олигонуклеотидные праймеры согласно Друца и соавт. [20, 21] (см. «Экспериментальную часть»). Присутствие всех заданных замен нуклеотидов подтверждали секвенированием. В результате получили векторные ДНК pFastBacHTbE2mut, содержащие гены Е2 с введенными мутациями, которые использовали затем при конструировании векторов pFastBacHTbE1E2mut, pFastBacHTbCE1E2mut и BacMamCE1E2mutGFP. На рис. 1 показана схема расположения потенциальных сайтов ^гликозилирования в белке Е2 ВГС и в сконструированных мутантных вариантах Е2.
А
Е2[
N1N2N3 N4 * у i*
N6 N7 N8 N9
W У_!£_
N10 N11
_!L_
417423430 448 476
543540 556 576
623 645
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
1- -GGS- -NRT- -NDS- -NAS- -EPD -NET-NNT-NST-NTT -NFT -NWT- 8-NGS-NRT-NDS-NAS-EPD-NET-NNT-GST-NTT-NFT-NWT-
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
2- -NGS- -GRT- -NDS- -NAS- -EPD -NET-NNT-NST-NTT -NFT -NWT- 9-NGS-NRT-NDS-NAS-EPD-NET-NNT-NST-GTT-NFT-NWT-
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
3- -NGS- -NRT- -GDS- -NAS- -EPD -NET-NNT-NST-NTT -NFT -NWT- 10-NGS-NRT-NDS-NAS-EPD-NET-NNT-NST-NTT-GFT-NWT-
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
4- -NGS- -NRT- -NDS- -GAS- EPD -NET-NNT-NST-NTT -NFT -NWT- 11-NGS-NRT-NDS-NAS-EPD-NET-NNT-NST-NTT-NFT-GWT-
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
5- -NGS- -NRT- -NDS- -NAS- EPD -NET-NNT-NST-NTT- NFT- NWT- 12-GGS-GRT-GDS-GAS-EPD-GET-GNT-NST-NTT-NFT-NWT-
Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y
6- -NGS- -NRT- -NDS- -NAS- EPD -GET-NNT-NST-NTT -NFT -NWT- 13-NGS-NRT-NDS-NAS-EPD-NET-NNT-GST-GTT-GFT-GWT-
Y Y Y Y Y Y Y Y Y
7- -NGS- -NRT- -NDS- -NAS- EPD -NET-GNT-NST-NTT -NFT -NWT- 14-GGS-GRT-GDS-GAS-EPD-GET-GNT-GST-GTT-GFT-GWT-
384
746
Б
Рис. 1. Сайты N-гликозилирования в структурном белке Е2 ВГС и в его мутантных вариантах. А - схема расположения сайтов гликозилирования N1-N11 в полипептидной цепи Е2 ВГС. Б - схематическое изображение мутантных вариантов гликопротеина Е2 с модифицированными (нарушенными) сайтами гликозилирования: 1 - N1; 2 - N2; 3 - N3; 4 - N4; 5 - исходный вариант Е2 дикого типа; 6 - N6; 7 - N7; 8 - N8; 9 - N9; 10 - N10; 11 - N11; 12 - N1-N7(mL); 13 - N8-N11(mR); 14 - N1-N11(XN). Сайты гликозилирования отмечены знаком «Y»
кДа WT N1 N2 N6 N9 N10 т^ т^ ^ К 90
50
— Е2 Е2*
Е2 WB: МаЬ Е2
Рис. 2. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в клетках Sf9. Вестерн-блотинг (WB) в денатурирующем 12% ПААГ с антителами к Е2 ВГС. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами: WT - Е2 дикого типа; N1, N2, N6, N9, N10, Ж-М7(т1_), N8-N11(mR) - Е2 с мутациями в соотвтетствующих сайтах гликозилирования; - во всех сайтах
гликозилирования Е2; К - отрицательный контроль (^р90). Здесь и на рис. 3-9 цифры слева - маркеры молекулярной массы белков, кДа. *- мутантные белки обозначены Е2*
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ БЕЛКА Е2 ВГС В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ БЕЛКОВ ОБОЛОЧКИ ВИРУСА В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Влияние ^гликанов гликопротеина Е2 ВГС на экспрессию генов мутантных белков Е2 в клетках насекомых и млекопитающих
Ранее мы показали, что в клетках насекомых происходит эффективное посттрансляционное глико-зилирование белков оболочки ВГС [22]. Мы показали также, что нарушение сайтов гликозилирования гликопротеина Е1 ВГС в различных комбинациях не влияет на его синтез в клетках Sf9, но отсутствие углеводных цепей в сайтах N1 и N5 Е1 существенно уменьшает уровень его экспрессии в клетках млекопитающих Нек293Т [23]. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в клетках насекомых Sf9, проведенный нами, показал, что нарушение сайтов гликозилирования в разных комбинациях (за исключением сайта N6), не влияет на синтез Е2, при этом электрофоретическая подвижность мутантных белков возрастает пропорционально уменьшению числа сайтов гликозилирования (рис. 2).
Оказалось, что интенсивность синтеза Е2 ВГС в клетках млекопитающих зависит от присутствия гликанов в определенных сайтах гликозилирования. Для анализа влияния ^гликанов гликопротеина Е2 ВГС на эффективность экспрессии белков оболочки вируса в клетках млекопитающих были сконструированы плазмиды pFastBacMam1GFP на основе бакуловирусного вектора с кассетами экспрессии под контролем цитомегаловирусного промотора (CMV), несущие кДНК мутантных Е2. Полученными векторными ДНК pFastBacMamCЕ1Е2mutGFP, кодирующими Е2 с точечными заменами в сайтах гли-
козилирования N1, N2, N4, N8, N10, mL(N1-N7), mR(N8-N11) и £N(№-N11), трансфицировали клетки НЕК293Т человека. Экспрессию генов мутантных белков Е2 ВГС и эффективность их гликозилирова-ния в клетках оценивали по уровню синтеза полипептидов CE1E2mutGFP, используя методы проточной цитофлуориметрии и электрофорез в ПААГ с последующим иммуноблотингом (рис. 3А,Б).
Согласно результатам проточной цитофлуориме-трии, отсутствие сайтов гликозилирования N1 и N8 Е2 ВГС приводит к значительному снижению флуоресценции GFP, что свидетельствует о снижении синтеза Е2 в составе полипептидов CE1E2mutGFP
А
а о
1.2
1
0.8 0.6 0.4 0.2 0
кДа 118 90 50 34
WT N1 N2 N4 N8 N10 т^ т^ ^ К
N1 N2 N4 N8 N10 т1_ т^ ^ WT К
Е2 Е2*
СЕ1Е2 WB: МаЬ Е2
Рис. 3. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в составе полипептида СЕ1Е2 ВГС в клетках млекопитающих. А - анализ флуоресценции зеленого белка GFP в клетках НЕК293Т, трансфицированных рекомбинантными плазмидами pFastBacMamCE1E2mutGFP, методом проточной цитофлуориметрии. По оси ординат отложены относительные значения интенсивности флуоресценции, по оси абсцисс указаны варианты Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1, N2, N4, N8, N10, тЦЖ-^), т^8-Ж1) и ЭМ(Ж-Ж1); Б — вестерн-блотинг в денатурирующем 8% ПААГ с антителами к Е2 ВГС лизатов клеток Нек293Т, трансфицированных pFastBacMamCE1E2GFP, синтезирующих различные варианты Е2: WT - Е2 дикого типа; Е2 с мутациями в сайтах гликозилирования N1, N2, N4, N8, N10, Ж^7(т1_); N8-^1^); Ж-Ж1(2>|) - во всех сайтах гликозилирования Е2; К - отрицательный контроль (^р90). Мутантные белки обозначены Е2*
Б
кда WT N1 N2 N3 N4 N6 N7 N8 N9 N10 N11 mL mR £N K 118
90 50
E1E2 WB: Mab E2
Рис. 4. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в составе Е1Е2 ВГС в клетках Sf9. Вестерн-блотинг в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к Е2 ВГС. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами, синтезирующих Е2 в составе Е1Е2: WT - Е2 дикого типа; N1, N2, N3, N4, N6, N7, N8, N9, N10, N11, N1^7^), N8-N11(mR) - Е2 с мутациями в сайте гликозилирования; - мутации во всех сайтах гликозилирования
Е2; К - отрицательный контроль (^р90). Мутантные белки обозначены Е2*
в клетках Hek293T по сравнению с исходным. К незначительному снижению синтеза гликопротеина Е2 ведет мутация в сайте N10. Электрофорез в ПААГ с последующим иммуноблотингом показал, что му-тантные варианты Е2 синтезируются в клетках млекопитающих, и интенсивность их синтеза зависит от присутствия гликанов в определенных сайтах гликозилирования белка. При этом электрофорети-ческая подвижность белков возрастает пропорционально уменьшению числа сайтов гликозилирования.
Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в составе Е1Е2 показал, что отсутствие гликанов в любом сайте, кроме N6, не влияет на синтез в клетках Sf9 (рис. 4).
Обработка мутантных гликопротеинов Е2 ВГС эн-догликозидазой Endo H с последующим вестерн-бло-тингом показала, что мутантные варианты гликопро-теина чувствительны к действию эндогликозидазы (не представлено), что в клетках насекомых происходит гликозилирование синтезированных мутантных гликопротеинов.
Влияние N-гликанов гликопротеина Е2 ВГС на образование продуктивного комплекса Е1Е2 в клетках насекомых
Мы показали ранее, что сборка гликопротеиновых комплексов Е1Е2 ВГС в клетках насекомых зависит от нарушения сайтов гликозилирования N1 и N5 гли-копротеина Е1, в то время как мутации остальных сайтов на сборку не влияют [23]. В настоящей работе о влиянии нарушения сайтов гликозилирования Е2 на его свертывание и образование гетеродимеров E1E2 в клетках насекомых, как и в случае с мутант-ным гликопротеином Е1, судили по взаимодействию с ними клеточных кальнексина и кальретикулина (рис. 5А-В).
Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в составе гликопротеиновых комплексов Е1Е2 в клетках насекомых Sf9 показал, что при нарушении одного из сайтов гликозилирования - N3, N4, N7 или N8 - формируется нековалентно связанный комплекс Е1Е2 так же, как и в случае экспрессии Е2 дикого типа. Мутантные Е2, лишенные сайтов N9 и N11, оказывают промежуточный эффект на сборку гликопротеинов оболочки ВГС. По мере увеличения числа поврежденных сайтов (N1-N7(mL) и N8-N11(mR)) взаимодействие гетеродимеров с кальнексином уменьшается, и сборка продуктивного комплекса Е1Е2 нарушается. Агрегаты неправильно свернутых димеров Е1Е2, образованные белком Е2 с мутациями во всех сайтах гликозилирования, с кальнексином не взаимодействуют. Интересно, что сборка некова-лентно связанного комплекса Е1Е2 нарушается также в результате повреждения одного из сайтов (N1, N2 или N10). Мутации именно этих сайтов гликози-лирования Е2, по-видимому, препятствуют образованию правильной конформации белков, образующих функциональный комплекс Е1Е2.
Влияние N-гликанов гликопротеина Е2 ВГС на образование вирусоподобных частиц в клетках Sf9 и Hek293T
Показано, что синтез структурных белков С (core), Е1 и Е2 ВГС в клетках насекомых сопровождается образованием вирусоподобных частиц. Ранее мы показали, что синтезируемые в клетках насекомых ре-комбинантные структурные белки ВГС, в том числе мутантный Е1, встраиваются в мембраны ЭР, где происходит их сворачивание, образование комплекса Е1Е2 и формирование ВПЧ. Образование ВПЧ фиксировали во фракциях микросом, очищенных из клеток насекомых Sf9, инфицированных реком-
л
кдА WT N1 N2 N3 N4 N6 N7 N8 N9 N10 N11 т! тЛ? ^ К 90
50 34
_Е2
«—Е2*
Е2 1Р:МаЬ Е2, WB: МаЬ CNX
Б WT N1 N2 N3 N4 N6 N7 N8 N9 N10 N11 т! т* ^ К
кДА
118 90
50
Е1Е2 Е1Е2*
Е1Е2 WB: МаЬ CNX
В WT N1 N2 N3 N4 N6 N7
кДА 118 90
50
N8 N9 N10 N11 тП* ^ К
Е1Е2 WB: МаЬ С*Т
Рис. 5. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в клетках Sf9. Л - вестерн-блотинг в денатурирующем 12% ПААГ с антителами к кальнексину после предварительного иммуноосаждения антителами к гликопротеину Е2 ВГС. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными бакуловирусами. WT - Е2 дикого типа; N1, N2, N3, N4, N6, N7, N8, N9, N10, N11, N1-N7(mL), N8-^1^*) - Е2 с мутациями в соответствующих сайтах гликозилирова-ния; Ж-Ж^Х^ - мутации во всех сайтах гликозилирования Е2; Б - вестерн-блотинг в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к кальнексину и В - к кальретикулину. Лизаты клеток, зараженных рекомбинантными баку-ловирусами, синтезирующих Е2 с мутациями в составе Е1Е2; К - отрицательный контроль (^р90); мутантные белки обозначены Е2*
бинантными бакуловирусами, с помощью электронной микроскопии [20]. Мы обнаружили, что отсутствие гликанов в сайтах гликозилирования белка Е1 не влияет на образование ВПЧ в клетках насекомых [23]. В данной работе анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в составе СЕ1Е2 в клетках насекомых Sf9 показал, что нарушение сайтов гликозилирования в разных комбинациях (за исключением сайта N6) не влияет на их синтез, при этом электро-форетическая подвижность мутантных белков возрастает пропорционально уменьшению числа сайтов гликозилирования (рис. 6А).
Мутации, введенные в сайты гликозилирования N3, N4, N7, N8, N9, N11 Е2, не препятствуют укладке гликопротеинов в составе СЕ1Е2 ВГС в клетках Sf9. В то же время повреждение сайтов N1, N2 и N10 на-
рушает сборку, приводя к образованию непродуктивных гетеродимеров Е1Е2 и соответственно к их неправильной упаковке в составе ВПЧ (рис. 6Б,В). Образование агрегатов неправильно свернутых гли-копротеинов не препятствует образованию ВПЧ ВГС в клетках насекомых, но, по всей видимости, приводит к образованию дефектных вирусных частиц, отличающихся от природных. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 ВГС в составе СЕ1Е2 в клетках НЕК293Т показал, что при образовании белков Е2, лишенных одного из сайтов гликозилирования N4 или N8, не нарушается правильная упаковка гликопротеинов в составе СЕ1Е2 ВГС, также как и в клетках Sf9. При этом по мере увеличения числа поврежденных сайтов гликозилирования N1-N7(mL) или N8-N11(mR) Е2 взаимодействие образо-
А ПА WT N1 N2 N3 N4 N6 N7 N8 N9 N10 N11 т^ т^ ^ к кДА
90
50
кДА
90
50
СЕ1Е2 : СЕ1Е2* : Е1Е2 Е1Е2*
Е2 ■ Е2*
СЕ1Е2 WB: МаЬ Е2
WT N1 N2 N3 N4 N6 N7 N8 N9 N10 N11 т! т^ ^ К
СЕ1Е2 1Р: МаЬ CNX, WB: МаЬ Е2
В WT N1 N2 N3 N4 N6 N7 N8 N9 N10 N11 т^ т^ ^ к
кДА
118 90 50
СЕ1Е2 1Р: МаЬ CRT, WB: МаЬ Е2
Рис. 6. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в составе СЕ1Е2 ВГС в клетках Sf9. Вестерн-блотинг в денатурирующем 8% ПААГ с антителами к Е2 ВГС (А), с антителами к Е2 ВГС после предварительного имму-ноосаждения антителами к кальнексину (Б) и кальретикулину (В). Лизаты клеток, зараженных рекомби-нантными бакуловиру-сами, синтезирующих Е2 в составе СЕ1Е2: WT - Е2 дикого типа; Е2 с мутациями в сайте гликозилирования - N1, N2, N3, N4, N6, N7, N8, N9, N10, N11, N1-N7^), N8-^1^);
- мутации во всех сайтах гликози-лирования Е2; К - отрицательный контроль (^р90). Мутантные белки обозначены Е2*
Б
кДА N1 N2 N4 118 90
50
118 90
50
N8 N10 т^ т^ ^ WT
_СЕ1Е2
I—СЕ1Е2*
СЕ1Е2 WB: МаЬ CNX
кдА N1 N2 N4 N8 N10 т! mR ^ WT
СЕ1Е2 WB: МаЬ CRT
Рис. 7. Анализ экспрессии генов мутантных белков Е2 в составе СЕ1Е2 ВГС в клетках млекопитающих Нек293^ Вестерн-блот в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к кальнексину (А) и кальретикулину (Б). Лизаты клеток, трансфицирован-ные рекомбинантными плазмидными ДНК pFastBacMamCE1E2GFP, синтезирующими Е2 с мутациями в сайте гликозилирования N1, N2, N4, N8, N10, Ж-М7(тП_), N8-^1^); N1-
- мутации во всех сайтах гликозилирования; WT - Е2 дикого типа; К - отрицательный контроль (^р90). Мутантные белки обозначены Е2*
А
к
Б
К
ванных гетеродимеров с кальнексином уменьшается, а с кальретикулином увеличивается. С кальретику-лином взаимодействуют димеры, образованные Е2 с мутациями во всех сайтах гликозилирования (£№). Интересно, что сборка продуктивного комплекса Е1Е2 и его упаковка в составе ВПЧ в клетках млекопитающих, как и в клетках насекомых, нарушается в результате повреждения сайтов гликозилирования N1, N2 и частично N10 Е2 (рис. 7А,Б).
Отсутствие углеводных цепей в сайтах N1, N2 и в меньшей степени N10 гликопротеина Е2, по-видимому, играет существенную роль в нарушении конформации белков функционального комплекса ВПЧ ВГС, препятствуя образованию в клетках полноценных вирусных частиц [24].
Ранее мы показали образование ВПЧ ВГС в клетках насекомых с помощью вестерн-блотинга с антителами к ВГС и электронной микроскопии. Для опре-
кДа
А Б В
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
90
50 34 26
19
l' - * • 1, {
Е2
core
0% Сахароза 60% 0% Сахароза 60% 0% Сахароза 60%
Рис. 8. Анализ вирусоподобных частиц ВГС, полученных в клетках Нек293Т, с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы. Вестерн-блотинг ВПЧ 10 фракций, начиная с верхней, в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к белкам С и Е2 ВГС. Клетки Нек293Т трансфицированы рекомбинантными ДНК pFastBacMamCE1E2GFP. А - исходная ДНК; Б - ДНК с мутацией в сайте гликозилирования N1 Е2; В - с мутациями во всех сайтах гликозилирования Е2
деления биофизических характеристик ВПЧ ВГС, полученных в клетках млекопитающих, ВПЧ очищали и концентрировали центрифугированием через 30% сахарозную «подушку» при 230000 g, а осадок ВПЧ анализировали с помощью центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы как описано в «Экспериментальной части». Собранные фракции анализировали с помощью вестерн-блотинга с антителами к структурным белкам (рис. 8А-В).
Иммуноблотинг с антителами к белкам С и Е2 показал, что ВПЧ содержатся во фракциях с плотностью 1.14—1.16 г/см3, что может свидетельствовать о присутствии в них фрагментов РНК [25].
ОТ-ПЦР на суммарной РНК клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом bv-CE1E2mut с праймерами к генам белков С и Е2 ВГС, выявляет фрагменты РНК структурных белков (результаты не представлены). Аналогичные результаты получены и для клеток Нек293Т. Таким образом, можно заключить, что ^гликаны гликопроте-ина Е2 ВГС не влияют на синтез РНК структурных белков в клетках насекомых и млекопитающих и, возможно, на включение этих РНК в вирусоподобные частицы.
i—E2 E2*
кДа WT N1 WT N1 N2 N10 УН K
+Ab CD81 +Ab CD81
120 90
50 36
Рис. 9. Анализ связывания мутантных белков Е2 в составе рекомбинантных ВПЧ ВГС с клетками Huh7.0. Вестерн-блотинг мутантных белков Е2 в денатурирующем 10% ПААГ с антителами к Е2 ВГС. Лизаты клеток Huh7.0, обработанных и не обработанных антителами к CD81, после инкубации с рекомбинантными ВПЧ, синтезированными в клетках насекомых Sf9, зараженных рекомбинантными бакуловирусами, синтезирующими мутантные Е2 в составе СЕ1Е2ти+: WT - Е2 дикого типа; Е2 с мутациями в сайте гликозилирования N1, N2, N10; Ж-Ж1(^) - мутации во всех сайтах гликозилирования Е2; WT + АЬ CD81, N1 + АЬ CD81 -клетки, обработанные АЬ CD81; WT, N1, N2, N10, ^ - клетки, не обработанные АЬ CD81; К - отрицательный контроль (Huh7.0). Мутантные белки обозначены Е2*
Влияние рецептора CD81 на связывание рекомбинантных ВПЧ ВГС с клетками гепатомы Huh7.0
В настоящей работе мы изучали связывание ВПЧ ВГС, несущих мутантные белки Е2, с клетками Huh7.0. Клетки Huh7.0, обработанные и не обработанные специфическими антителами к CD81, инкубировали с ВПЧ, полученными в клетках насекомых, и анализировали связывание мутантных белков Е2 с клетками методом вестерн-блотинга (рис. 9). Предварительно была определена рабочая концентрация АЬ CD81 (20 мкг/мл) [26].
Показано, что образующиеся в клетках насекомых ВПЧ ВГС, содержащие мутантные варианты Е2, связываются с клетками Huh7.0 независимо от присутствия на их поверхности рецептора CD81. Helle F. и соавт. [26] показали, что вирусные частицы с му-тантными белками Е2 в своем составе, связываются с клетками HepG2, Huh7.0 CD81-зависимым способом. Известно, что влияние рецептора CD81 на связывание вирусных частиц ВГС с различными клетками (HepG2, Huh7.0, NKNT-3, Molt-4) проявляется по-разному [27].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Известно, что важным этапом морфогенеза вируса гепатита С, определяющим правильную сборку ви-риона, является гликозилирование белков оболочки вируса в инфицированной клетке. Нами показано, что синтезируемые в клетках насекомых и млекопитающих белки оболочки ВГС, в том числе белок Е2, содержащий мутации в сайтах гликозилирования, встраиваются в мембраны ЭР, где происходит их сворачивание, образование комплекса Е1Е2 и формирование вирусоподобной частицы. Исследование роли гликозилирования белков оболочки в морфогенезе вируса гепатита С генотип 1б (штамм 274933RU) показало, что нарушение единичных сайтов гликози-лирования N1 и N8 белка Е2 ВГС (так же как N1 и N5 белка Е1 ВГС) ведет к снижению экспрессии этих белков в клетках млекопитающих, в отличие от экспрессии в клетках насекомых. Впервые обнаружено, что нарушение сайтов гликозилирования N1, N2 и N10 белка Е2 (как N1 и N5 белка Е1 ВГС) влияет на образование функциональных гетеродимеров Е1Е2. В отсутствие гликанов в этих положениях происходит в основном образование непродуктивных ди-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hnatyszyn H.J. // Antivir. Ther. 2005. V. 10. P. 1-11.
2. Baumert T.F., Ito S., Wong D.T., Liang T.J. // J. Virol. 1998. V. 72. P. 3827-3836.
3. Reed K.E., Rice C.M. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2000. V. 242. P. 55-84.
4. Иванов А.В., Кузякин А.О., Кочетков С.Н. // Успехи биохимии. 2005. T. 45. C. 37-86.
5. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A.J., Overby L.R., Bradley D.W., Houghton M. // Science. 1989. V. 244. P. 359-362.
6. Burda P., Aebi M. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1426. P. 239-257.
7. Choukhi A., Ung S., Wychowski C., Dubuisson J. // J. Virol. 1998. V. 72. P. 3851-3858.
8. Goffard A., Dubuisson J. // Biochimie. 2003. V. 85. P. 295-301.
9. Op de Beeck A., Cocquerel L., Dubuisson J. // J. Gen. Virol. 2001. V. 82. P. 2589-2595.
10. Montreuil J., Vliegenthart J.F., Schachter H. // Glycoproteins. Elsevier. 1995. P. 1-12.
11. Chapel C., Garcia C., Roingeard Ph. // J. Gen. Virol. 2006. V. 87. P. 861-871.
12. Helle F., Goffard A., Morel V., Duverlie G., McKeating J., Keck Z.Y., Foung S., Penin F., Dubuisson J., Voisset C. // J. Virol. 2007. V. 81. P. 8101-8111.
13. Xiang J., Wunschmann S., George S.L., Klinzman D., Schmidt W.N., LaBrecque D.R., Stapleton J.T. // J. Med. Virol. 2002. V. 68. P. 537-543.
14. Brazzoli M., Helenius A., Foung S.K., Houghton M., Abrignani S., Merola M. // Virol. 2005. V. 332. P. 438-453.
15. Cocquerel L., Meunier J.C., Op de Beeck A., Bonte D., Wychowski C., Dubuisson J. // J. Gen. Virol. 2001. V. 82. P. 1629-1635.
меров, но это не препятствует формированию вирусоподобных частиц ВГС как в клетках насекомых Sf9, так и в клетках человека Нек293Т. Высказано предположение, что образующиеся вирусоподобные частицы с неправильно свернутыми гликопротеинами являются дефектными, неспособными инфицировать клетки-мишени. Полученные данные свидетельствуют об образовании в клетках Sf9 и Нек293Т вирусоподобных частиц плотностью 1.14-1.16 г/см3, содержащих фрагменты РНК. Показано, что ^гликаны гликопротеинов ВГС не влияют на синтез РНК структурных белков в клетках насекомых и млекопитающих и, возможно, на их включение в вирусоподобные частицы. В настоящей работе мы показали, что вирусоподобные частицы ВГС, синтезирующиеся в клетках насекомых, связываются с клетками гепатомы Huh7.0 независимым от рецептора CD81 образом. •
Работа получила финансовую поддержку РФФИ (гранты № 07-04-12136, 08-04-00281, 011-04-00231) и Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 16.512.11.2266).
16. Мохонов В.В., Новиков Е.И., Самохвалов Е.И. // Вопросы вирусологии. 2002. T. 47. C. 9-12.
17. Jones D.M., McLauchlan J. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. P. 22733-22739.
18. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1982.
19. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System. Instruction Manual. St. Louis, MO: Life Technologies, Inc., Monsanto Corp. Res. 1993.
20. Белжеларская С.Н., Королева Н.Н., Попенко В.В., Друца В.Л., Орлова О.В., Рубцов П.М., Кочетков С.Н. // Молекуляр. биология. 2010. T. 44. C. 107-119.
21. Друца И.Л., Кабердин В.Р., Королева О.Н., Шилов И.О. // Биоорган. химия. 1991. T. 17. C. 1487-1493.
22. Тимохова А.В., Бакиновский Л.В., Зинин А.И., Попенко
B.И., Иванов А.В., Рубцов П.М., Кочетков С.Н., Белжеларская С.Н. // Молекуляр. биология. 2012. Т. 46. № 4.
C. 644-653.
23. Орлова О.В., Друца В.Л., Спирин П.В., Попенко В.И., Прасолов В.С., Рубцов П.М., Кочетков С.Н., Белжеларская С.Н. // Молекуляр. биология. 2013. Т. 47. № 1. С. 147-156.
24. Clayton R.F., Owsianka A., Aitken J., Graham S., Bhella D., Patel A.H. // J. Virol. 2002. V. 76. P. 7672-7682.
25. McEwen C.R. // Anal. Biochem. 1967. V. 20. P. 114-149.
26. Helle F., Vieyres G., Elkrief L., Popescu C.I., Wychowski C., Descamps V., Castelain S., Roingeard P., Duverlie G., Dubuisson J. // J. Virol. 2010. V. 84. P. 11905-11915.
27. Tryatni M., Saunier B., Maruvada P., Davis A.R., Ulianich L., Heller T., Patel A., Kohn L.D., Liang T.J. // J. Virol. 2002. V. 76. P. 9335-9344.
