CC BY
15
ФестницФРУЯЖ №2, 2013_
УДК 636.086.82
Профессор B.C. Григоров, аспирантка Д.Е. Стрельникова
(Воронеж. гос. ун-т инж. технол.) кафедра микробиологии и биохимии, тел (473) 255-55-57
Уровень АТР и активность глюкоамилазы в клетках микромицетов, культивируемых при различных температурах
Изучено влияния температуры на изменение уровня АТР в клетках термотолерантного и мезофильного микромицетов в процессе биосинтеза глюкоамилазы.
The influence of temperature on the level of ATP in the cells of thermotolerance and meso-philic micromycetes in the biosynthesis of glucoamylase was studied.
Ключевые слова: глюкоамилаза, микромицеты, мицелий, изоцитратдегидрогеназа, а-кетоглутарат, глутаматдегидрогеназа.
Энергетический обмен клетки в процессе биосинтеза ферментов осуществляется за счет превращений, протекающих в системе ATP-ADP. Уровень АТР в клетках варьирует в зависимости от температуры культивирования микроорганизмов [1].
В работе рассмотрены некоторые метаболические процессы термотолерантного (R, pygmaues P1) и мезофильного (A. awamori) штаммов - продуцентов глюкоамилазы, куль -тивируемых при температурах 30, 40 и 450 С в колбах 750 см3 глубинным способом с частотой вращения 4 сек-1 в течение 72 ч. Для культивирования продуцентов использовались сбалансированные по химическому составу питатель -ные среды в соответствии с физиологическими потребностями микромицетов [2, 3]. Через каж-дые 24 ч. определялась глюкоамилазная активность (ГлА) глюкозооксидазным методом [4] и содержание АТР в мицелии микромицетов лю-цеферин-люцеферазным методом Стрелера и Хендли в модификации Позмоговой и Мальян-ца [1], основанным на регистрации хемилюми-несценции, возникшей в результате реакции люцеферин-люцеферазы с АТР разрушенных кипячением в течение 10 мин клеток.
При каждом определении количества АТР в опытной пробе использовались 3 контроля: в двух контролях использовался эталонный раствор АТР и в одном - эталонный раствор АТР добавлялся в колбу с уже замеренным количеством АТР. В связи с этим замерялось общее количество АТР. Эталонный раствор АТР, приготовленный перед употреблением, служил для учета потерь биолюминесценции из-за светорассеивающих
© Григоров B.C., Стрельникова Д.Е., 2013
элементов, находящихся в пробе. Записи сигналов при анализе опытного и эталонного растворов АТР приведены на рисунке 1.
Рисунок 1 - Запись сигналов: l0 - сигнал эталонного раствора АТР, мм (1 повторность); 10 - сигнал эталонного раствора АТР (2 повторность), мм; li - сигнал АТР опытного образца, мм; l1 - сигнал после получения l1 и добавления к опыту (с известным количеством АТР) x эталонного раствора АТР, мм.
Подсчет результатов анализов проводил -ся по формуле:
11f
Y =X<L . х. м 10 "8, (1)
11f
где: l0 - сигнал (мм) эталонного раствора АТР (1-я проба); l'0- сигнал эталонного раствора АТР (2-я повторность); l1 - сигнал АТР опытного образца; l'1- сигнал после получения l1 и добавления к опыту (с известным количеством АТР) x эталонного раствора АТР; х-М- 10-8-концентрация эталонного раствора АТР; У-количество АТР в сухой биомассе мицелия, н-М/мг.
Количество АТР пересчитывалось на 1 мг сухой биомассы. Средняя арифметическая погрешность определения составляла ±7,5 %. Динамика роста микромицетов, содержание АТР и активность глюкоамилазы в мицелии и
культуральнои жидкости продуцентов при различных температурах культивирования показаны в таблице 1.
Таблица 1
Содержание АТР в мицелии микромицетов, синтезирующих Гл.А при различных температурах
t, oC T, 4 ATP, Н*мо ль/мг сухой биомассы Биомасса г/100 см3 Активность глюкоамилазы
Мицелии, ед/г Культу-ральные жидкости, ед/100 см3
Rhizopus pygmaues P1
30 24 5,65 1,4 17,8 1857
48 5,03 1,7 18,5 1921
72 3,55 0,9 13,0 1990
40 24 5,97 1,2 16,7 2082
48 5,34 1,5 18,1 2283
72 4,0 0,7 10,2 2300
45 24 6,17 1,0 12,3 1562
48 5,41 1,2 16,8 1787
72 4,02 1,5 7 8 1559
As pergillus awamori
30 24 4,57 1,3 11,3 1277
48 4,12 1,5 8,0 1910
72 3,12 0,8 6,2 1970
40 24 4,88 0,7 4,3 421
48 4,33 0,6 2,1 410
72 3,67 0,4 2,0 130
45 24 - 0,2 0,08 0,0
48 - - - -
72 - - - -
Как показывают данные таблицы 1, увеличение температуры культивирования с 30 до 45 0С у термотолеранта и до 40 0С у мезофила к 24-48 ч. приводит к увеличению содержания АТР при одновременном снижении количества образующейся биомассы и активности глюко-амилазы в мицелии. Активность фермента в культуральной жидкости при 30 0С для термотолеранта к 48 ч. возрастает незначительно. При 40 0С значительное возрастание активности происходит в течение всего периода культивирования; при 45 0С глюкоамилазная активность снижается только после 48 ч.
Для мезофильного штаммф ферментативная активность возрастает только при 30 0С. Дальнейшее повышение температуры приводит к инактивации глюкоамилазы и при температуре 45 0С к 48 ч. роста мицелий превращается в шариковидные формы, рост практически прекращается, в культуральной жидкости активность фермента не обнаруживается.
Для определения оптимальных параметров процесса экспериментальные данные обрабатывались по программе множественной корреляции.
Полученные математические зависимости от температуры (xi) и времени (х2) адекватно описывают уровень содержания АТР, Н*моль/мг - (yi), количество биомассы, г/100 см3- (y2), активность глюкоамилазы в мицелии, ед/ч - (Y3) и в культуральной жидкости, ед/100 см3 - (Y4):
- для термотолерантного микромицета: У1=3,11+0,17x1-0,03x2-0,00006x1x2-0,002x12+0,00005x22, (2)
y2=0,16+0,043x2+0,00005x1x2-0,0007x12-0,0004x22, (3)
Y3=-32,38+2,31x1+0,41x2-0,002x1x2-0,03x12-0,003x22, (4)
Y4=-9227,76+584,2x1+14,21x2+0,1x1x2-7,6x12-0,13x22, (5)
- для мезофила: У1=5,98-0,039х1-
0,034x2+0,000x1x2+0,0005x12+0,00005x22, (6)
y2=0,77-0x1+0,004x2+0,0003x1x2+0x1-0,0002x22, (7)
Y3=10,4-0,00001x1-
0,2x2+0,0014x1x2+0x12+0,0007x22, (8)
Y4=-2695,93+224,03x1+4,65x2-1,9x1x2-1,79x12+0,44x22. (9)
Эти данные указывают на существенные отличия термотолерантного штамма от мезофильного.
Исследования показали, что различные температуры культивирования изменяют не только уровень АТР в клетках, но и оказывают влияние на интенсивность функционирования некоторых ферментов цикла Кребса.
Так изоцитратдегидрогеназная (ИЦДГ) активность, определенная при повышении температуры с 30 до 45 0С у Rh. Pygmaues P1 мало изменяется и составляет 0, 96-0,98 мкМ субстрата мин/мг белка. Это дает возможность изоцетратдегидрогеназе при участии NAD-P активно катализировать превращение изоцит-рата в а-кетоглутарат.
У A.awamori изоцитратдегидрогеназа не устойчива к повышению температуры. Ее активность снижается уже при 40 0С и составляет 0,75 мкМ субстрата/мг белка.
Однако у микромицетов при этом снижается глутаматдегидрогеназная активность. Это приводит к снижению образования глута-миновой кислоты из а-кетоглутората и к уменьшению образующейся биомассы и активности глюкоамилазы; к увеличению содержания АТР в мицелии, расход которой на процессы синтеза белка фермента и биомассы замедляется (таблица 1).
В подтверждение данных предположений были проведены исследования по определению количества а-кетоглутората в культу-ральной жидкости калориметрическим методом с 2,4 - динитрофенолгидрозином [6], активности NAD и NAD-P - зависимой глута-матдегидрогеназы (ГДГ) [7]. Данные исследований приведены в таблице 2.
Таблица 2
Из данных таблицы 2 следует, что при увеличении температуры культивирования в мицелии Я. pygmanes Р1 не снижается активность изоцитратдегидрогеназы, а образование а-кетоглутаровой кислоты в культураль-ной жидкости возрастает в три раза при температуре 45 °С.
В мицелии мезофильного штамма отмечается снижение изоцитратдегидрогеназной активности при температуре 40 0С, а образование а-кетоглутаровой кислоты возрастает в 1,5 раза.
Глутаматдегидрогеназная активность для обоих штаммов снижается. Особенно это выражено для мезофильного продуцента глюкоамилазы и, как следствие, снижается содержание глутаминовой кислоты в культуральной жидкости; хотя у Я. pygmanes Р1 этот процесс отмечается при более высоких температурах.
Таким образом, при повышении температуры культивирования у исследуемых микромицетов увеличивается содержание АТР. Количество АТР в клетках R. pygmanes Pi к 24 ч. при 45 0С достигает 6,17 Н*моль/мг биомассы вместо 4,88 Н*моль/мг у мезофильного штамма при 40 0С.
Глюкоамилазная активность в мицелии термотолеранта возрастает при температуре 30-45 0С к 48 ч.; в культуральной жидкости максимальная активность (2300 ед/100 см3) проявляется к 72 ч. культивирования при температуре 40 0С.
У мезофильного штамма повышение температуры культивирования до 40 0С приводит к резкому снижению активности фермента к 48 ч. и в мицелии, и в культуральной жидкости.
У термотолерантного штамма при температуре культивирования 30-45 0С практически не изменяется изоцитратдегидрогеназ-ная активность; у мезофильного штамма этот фермент не устойчив к повышенной температуре. Более устойчива к температуре глу-таматдегидрогеназа термотолеранта, отвечающая за образование глутамата из а-кетоглутаровой кислоты.
Глутаминовая кислота входит в состав молекулы глюкоамилазы [8]. У термотолерантного штамма количество глутаминовой кислоты составляет 12900 мМ/г белка вместо 4844 мМ/г у мезофильного штамма. Согласно литературным данным [10] повышенное содержание глутаминовой кислоты в молекуле фермента способствует повышению его термостойкости за счет ион-дипольных взаимодействий -СООН групп с фенольным гидроксилом тирозина; за счет образования двух водородных связей протонированных групп с еще одной -СООН группой; за счет возникновения связи с ионами Са2+, содержащимися в молекуле фермента.
ЛИТЕРАТУРА
1 Позмогова, И. Н. О физиологии термофильных и мезофильных бацилл при оптимальных и супраоптимальных температурах развития [Текст] / И. Н. Позмогова, А. И. Мальянц // Мик-робиология.-1976.- Т. XLV - С. 284-289.
2 Григоров, В. С. Получение термотолерантного мутанта R. pygmanes P1 с повышенной активностью глюкоамилазы [Текст] / В. С. Григоров, Н. А. Жеребцов // Микробиология. -1983. - Т. 52. - № 3. - С. 408-412.
Активность ферментов, мкм субстрата/мин/мг белка Количество кислот
ГДГ а-
t, кето- флу-
"С ицдг NAD-зависимая NAD-P-зависимая глу-таро- тами-новая,
вая, мкг/м лКЖ мг/мл КЖ
R. pygmanes Pj
30 0,98 0,57 0,83 68,6 27,8
40 0,99 0,49 0,67 127,8 15,3
45 0,96 0,42 0,53 215,3 10,7
A. awamori
30 0,90 0,53 0,80 62,4 25,7
40 0,75 0,19 0,25 93,8 6,6
45 - - - - -
3 Григоров, B.C. Кислотная инактивация глюкоамилазы микроскопических грибов [Текст] / B.C. Григоров, Н.А. Жеребцов // Ферментная и спиртовая промышленность. -1993. - №2. - С. 34-36.
4 Грачева, И. М. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов [Текст] / И. М. Грачева, Ю. П. Грачев, М. С. Мосичев и др. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. - 239 с.
5Kornberg, A. I. Methods in enzymology [Text] / A. I. Kornberg.- Academic press incorporated, 1998.- 707 p.
6Fridemann, F. E. [Text] / F. E. Fridmann, У. E. Haugen. - Biol. Chem, 1993. - 415 p.
7Doherty, D. Methods in enzymology [Text] / D. Doherty.-Acad. Press INC, 1970. - 850 p.
8 Григоров, В. С. Взаимосвязь термотолерантности микромицетов и термостабильности синтезируемых глюкоамилаз [Текст] / В. С. Григоров, О. С. Корнеева, Т. И. Фурсова // Хранение и переработка сельхозсырья. -2008. - № 3. - С. 46-49.
9 Коновалов, С. А. Продуценты амило-литических ферментов [Текст] / С. А. Коновалов. - М.: Пищевая промышленность, 1972.
10 Хашнев, Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях [Текст] / Д. Хашнев. -М.: Мир, 1981. - 270 с.
REFERENCES
1 Pozmogova, I. N. On the physiology of mesophilic and thermophilic bacilli under optimal and supraoptimal temperatures of development [Text] / I. N. Pozmogova, A. I. Malyants // Mikrobiologiya. - 1976. - V. XLV. - P. 284 - 289.
2 Grigorov, V. S. Production of thermo-tolerant mutant R. pygmanes P1 with increased activity of glucoamylase [Text] / V. S. Grigorov, N. A. Zherebtsov // Microbiologiya. - 1983. -V. 52. - № 3. - P. 408-412.
3 Grigorov, V. S. Acid inactivation of glucoamylase microscopic fungi [Text] / V. S. Grigorov, N. A. Zherebtsov // Enzyme and the alcohol industry. - 1993. - № 2. - P. 34-36.
4 Gracheva, I. M. Laboratory workshop on the technology of enzyme preparations [Text] / I. M. Grachev, Y. P. Grachev, M. S. Mosichev et al. - M.: egkaya pishevaya promyshlennost, 1982. - 239 p.
5 Kornberg, A. I. Methods in enzymology [Text] / A. I. Kornberg. - Academic press incorporated, 1998. - 707 p.
6 Fridemann, F. E. [Text] / F. E. Fridmann, Y. E. Haugen. - Biol. Chem, 1993. - 415 p.
7 Doherty, D. Methods in enzymology [Text] / D. Doherty.-Acad. Press INC, 1970. -850 p.
8 Grigorov, V. S. Relationship micromy-cetes thermotolerance and thermal stability of the synthesized glucoamylases [Text] / V. S. Grigo-rov, O. S. Korneev, T. I. Fursova / Storage and processing of agricultural raw materials. - 2008. -№ 3. - P. 46-49.
9 Konovalov, S. A. Producers of amylo-lytic enzymes [Text] / S. A. Konovalov. - M.: Pishevaya promyshlennost, 1972.
10 Hashnev, D. Life of microbes in extreme environments [Text] / A. Hashnev. - M.: Mir, 1981. - 270 p.
