CC BY
306
УДК 576.3
Комплекс амилаз клеток aspergillus niger
В.А. Микула
Гоодненский государственный университет имени Янки Купалы, Гоодно, Беларусь
mikula-bgu@tut.by.
Человек давно использует активность ферментов в своей практической деятельности. Ферменты - самые активные среди всех известных катализаторов. Большинство реакций протекает в миллионы и миллиарды раз быстрее, чем если бы они протекали в отсутствие ферментов. Сегодня сфера применения биокатализаторов неуклонно расширяется, что связано с их высокой эффективностью, субстратной специфичностью, что позволяет воздействовать лишь на определенные соединения, а также способность проявлять активность в достаточно широком диапазоне температур и pH.
Объем производства ферментных препаратов постоянно растет и занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии. В Республике Беларусь производство ферментов развито недостаточно. Многие отрасли промышленности используют импортные ферментные препараты производства западноевропейских компаний. Основная доля в импорте приходится на ферментные препараты гидролаз. Гидролазы являются универсальными ферментами для всех отраслей промышленности. Наиболее востребованными являются продукты на основе амилаз. Для получения ферментов амилолитического ряда широко применяют микроскопические грибы рода Aspergillus, видов niger, oryzae, usamii, awamori, batatae.
Амилазы являются основными ферментами, применяемыми в различных секторах пищевой промышленности, что связано со способностью данных ферментов значительно ускорять технологические процессы, увеличивать выход готовой продукции, повышать ее качество, экономить ценное сырье и др.
Самым большим потребителем амилолитических ферментов в Республике Беларусь является спиртовая и пивоваренная промышленности [1].
Амилолитические препараты широко выпускаются за рубежом, в Беларуси масштабное производство не налажено. В то же время на предприятиях республики имеется опыт работы с микроорганизмами, имеются соответствующие родственные технологии. В этой связи исследования по разработке подходов к созданию отечественных ферментных препаратов амилаз являются высокоактуальной задачей.
В настоящей работе на предмет амилолитической активности был изучен штамм Aspergillus niger, который используется на ОАО «Скидельский сахарный комбинат». Для лабораторных испытаний культуру гриба Aspergillus niger выращивали на образце мелассы
производства Скидельского сахарного комбината, имеющей сахарозы 46 масс.%, с добавлением питательных солей. Культивирование клеток Aspergillus niger осуществляли глубинным способом. Для преодоления несмачиваемости спор гриба перед выращиванием посевного мицелия навеску сухих конидий массой 60мг помещали в колбу вместимостью
о о
250 см3, содержащую 20 см3 стерильной среды следующего состава,
о
г/дм3: меласса свекловичная - 108, дигидрофосфат калия - 0,16, нитрат аммония - 2,5, сульфат магния, гептагидрат - 0,25. Хорошо перемешивали, ставили на аппарат для встряхивания с числом оборотов 160±10 мин-1 и выдерживали при температуре 32±0,5°C в течение 5ч.
Питательную среду для выращивания посевного мицелия засевали
о о
суспензией конидий в количестве 10 см3 суспензии конидий на 60 см3
о
сахарно-минеральной среды, с концентрацией мелассы 125 г/дм3. Выращивание посевного мицелия проводили на качалке с числом оборотов 160±10 мин-1 и выдерживали при температуре 32±0,5°С в течение 48 ч. Выросший посевной мицелий использовали для засева
о
ферментационной среды, с содержанием мелассы 320 г/дм3. Объем
о о
посевного мицелия - 10 см3 на 50 см3 ферментационной среды. Колбы с засеянной ферментационной средой помещали на качалку с числом оборотов 160±10 мин-1 и выдерживали при температуре 32±0,5°С [2].
В периодически отбираемых пробах определяли амилолитическую и глюкоамилазную активности культуральной жидкости.
Амилолитическая активность фермента определялась спектрофотометрически по изменению интенсивности окраски йодно-крахмального раствора, а глюкоамилазная активность определялась по изменению светопоглощения медно-щелочного раствора [3,4]. Установлено, что исследуемый штамм продуцирует комплекс экзоамилаз, максимальная активность которых достигалась к 10 суткам и составляла порядка 60 Ед/мл культуральной жидкости для а-амилазы и 7 Ед/мл - для глюкоамилазы (рис. 1).
Помимо амилаз, клетки Aspergillus niger экскретируют и другие белки, например протеазы, целлюлазы. В связи с этим определили динамику накопления белка в культуральной жидкости, которая представлена на рис. 2.
Определены некоторые физико-химические характеристики комплекса экзоамилаз: температурный оптимум составляет 35-50оС, а рН-отимум равен 4-6.
В процессе культивирования глубинным способом клеток Aspergillus niger на предприятии ОАО «Скидельский сахарный комбинат» образуется большое количество мицелия продуцента, который является отходом производства и представляет собой серьезную экологическую проблему города. Одним из приоритетных направлений в области охраны окружающей среды г. Скиделя является поиск областей применения данного отхода производства.
Рисунок 1 — Активность амнлолнтнческнх ферментов культуральной Рисунок 2 — Содержание белка в культуральной жидкости жидкости Aspergillus niger в процессе культивирования Aspergillus niger в процессе культивирования
В связи с этим была проведена оценка внутриклеточной амилазной активности мицелия Aspergillus niger. Мицелий отделяли от культуральной жидкости на воронке Бюхнера, промывали. Далее клетки мицелия разрушали ультразвуком. Степень разрушения клетки контролировали по изменению содержания белка. Наличие амилолитической и глюкоамилазной активности определяли описанными выше методами. Установлено, что мицелий Aspergillus niger не содержит внутриклеточных ферментов амилолитического ряда.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что Aspergillus niger, часто используемый в качестве продуцента лимонной кислоты, является источником экзоамилаз - а-амилазы и глюкоамилазы, секретируемых во внеклеточное пространство, однако внутриклеточные ферменты амилолитического ряда не продуцирует. Более того, на ОАО «Скидельский сахарный комбинат» имеются основные технические возможности для разработки технологии производства ферментного препарата амилаз.
