Мутанты аспергиллов с повышенной амилолитической активностью Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Антипов С. Т. Послеспиртовая зерновая барда: технология переработки / С. Т. Антипов, А. В. Журавлев // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2005. № 4. С. 9 — 11.

2. Белова Н. В. Коллекция культур бизидиомицетов на рубеже веков / Н. В. Белова, Н. В. Псур-

цева // Биотехнология. 1999. N° 3. С. 39 — 42.

3. Влияние полимерных субстратов на биосинтез ферментов лигнолитического комплекса грибом Patius tigrinus / Д. А. Кадималиев, В. В. Ревин, Н. А. Атыкян // Вестник ОГУ. 2003. Т. 22, № 4. С. 93 — 98.

5. Особенности ферментов лигнолитического комплекса гриба Panus tigrinus штамм ВКМ F — 3616 D / Д. А. Кадималиев, В. В. Ревин, Н. А. Атыкян // 1-й съезд микологов России: тез. докл. Москва,

11 — 14 апреля 2002 г. М.: Нац.акад микологии, 2002. С. 298.

4. Кухаренко А. А. Экологические и экономические аспекты использования отходов спиртового производства / А. А. Кухаренко, М. Н. Дадашев / / Производство спирта и ликероводочных изделий.

2004. №2. С. 23 — 25.

6. Повышение эффективности производства пищевого этанола за счет комплексного использования сырья и отходов / С. Н. Сорокодумов, А. А. Кухаренко, А. Ю. Винаров / / Пищевая промышленность.

2005. № 4. С. 60 — 61.

7. Технология спирта / В. Л. Яровенко, В. А. Маринченко, В. А. Смирнов / / М.: Колос, 1999. 464 с.

8. Bradford М. М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principal of protein-bye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72.

P. 248 — 254.

Поступила 18.10.06.

МУТАНТЫ АСПЕРГИЛЛОВ С ПОВЫШЕННОЙ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

В. В. Шутова, кандидат биологических наук (Саранск), Л. А. Кудашкина (Саранск),

В. В. Ревин, доктор биологических наук (Саранск),

По последним прогнозам, микробиологическая промышленность в ближайшие 10 лет будет развиваться темпами, превышающими развитие других областей биотехнологии. Современные и будущие успехи микробиологической технологии зависят от нашей способности создавать микроорганизмы с нужными свойствами [2].

Амилолитические ферменты синтезируются многими микроорганизмами: бактериями, дрожжами, грибами и актиномидетами. Наиболее часто в качестве продуцентов амилолити-ческих ферментов используются плесневые

грибы. Способность синтезировать амилазы широко распространена среди плесневых грибов рода Aspergillus, видов niger, oryzae, usamii, awamori, batatae. Аспергиллы синтезируют одновременно комплекс ферментов, но некоторые из них, особенно мутантные штаммы, продуцируют в значительных количествах лишь один фермент. Отбор микроорганизмов-продуцентов проводится, главным образом, по высокой активности Ü-амилазы, глюкоамилазы и олиго-1,6-глюкозидазы (декстриназы) [10]. В зависимости от вида и штамма гриба, а также от условий культивирования сочетание этих

© В. В. Шутова, JL А. Кудашкина, В. В. Ревин, 2007

ферментов может быть различным. Применяя разведениях 10"7, 10"8, 109 по 0,5 мл высевали разнообразные способы воздействия на мик- на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей 1 и 5 % крахмала, инкубировали при 35 °С до появления колоний, после чего подсчитывали процент выживаемости. Каждую выжившую колонию стерильной петлей переносили на обогащенную агаризованную среду Чапека с крахмалом и инкубировали при 35 °С до появления колоний.

Исходные и мутантные штаммы грибов Asp. awamori и Asp. tiiger культивировали глубинным способом на качалке при 200 об / мин, 25 — 26 °С в течение семи суток в конических колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл питательной среды Чапека того же состава. Засев осуществляли суспензией спор.

Амилолитическую активность определяли спектрофотометрически с использованием

роорганизмы, можно получить штаммы плесневых грибов, отвечающих определенным требованиям [7].

Во многих отраслях пищевой промышленности необходимо проводить гидролиз крахмала. На практике его осуществляют в две стадии: на первой проводят обработку Ü-ами-лазой (стадия разжижения крахмала), затем клейстеризованную и разжиженную суспензию при температуре не выше 60 °С и pH 5,0 — 5,5 обрабатывают глюкоамилазой (стадия осахаривания крахмала). В результате совместного действия ферментов степень гидролиза крахмала достигает 98 — 99 % [1]. Так как в настоящее время растет потребность многих отраслей промышленности в ферментных амилолитических препаратах, проводятся работы по изучению продуцентов амилолитических ферментов, по их культивированию в различных условиях и, конечно же, по получению высокоактивных штаммов. Производство ферментов из штаммов, полученных в ходе мутационных и селекционных программ, является экономически выгодным уже на протяжении многих лет.

Данная работа посвящена получению высокопродуктивных мутантов Asp. awamori и Asp. niger, синтезирующих Ü-амилазу и глю-коамилазу, и изучению физиологических и биохимических особенностей мутантных штаммов.

В качестве объекта исследования использовали культуру грибов Aspergillus niger, предоставленную сотрудниками кафедры микологии и альгологии МГУ им. М. В. Ломоносова, и Aspergillus awamori.

Споровый посевной материал грибов Asp, niger и Asp. awamori выращивали при температуре 25 °С в пробирках со скошенным агаром на среде Чапека с крахмалом следующего состава, г / л: крахмал — 20, NaNO —'30,

КН2Р04 — 1, MgS04 — 0,5, KCl — 0,5,

FeS04 — 0,01, агар-агар -—18.

Получение мутантов. Споры грибов Asp. niger и Asp. awamori суспендировали в чашках Петри в 10 мл дистиллированной воды; 5 мл полученной суспензии помещали в стерильные чашки Петри и подвергали УФ-облучению в течение 30 (97,6 Дж / м ), 25 (81,3 Дж / м ) и 20 (65,1 Дж / м ) мин.

Затем контрольные, и облученные споры в

иод-крахмального метода, основанного на гидролизе крахмала ферментами амилолитиче-ского комплекса до декстринов различной массы. За единицу амилолитической способности (АС) принимали количество фермента, которое способно катализировать гидролиз 1 г растворимого крахмала до продуктов, не дающих окраски с йодом за 1 ч при температуре 30 °С [5].

Метод определения глюкоамилазной активности основан на количественном определении глюкозы, образующейся при гидролизе крахмала. За единицу глюкоамилазной способности (ГлС) принимали количество фермента, которое гидролизует растворимый крахмал при 30 °С и рН 4,7 и в течение 1 мин освобождает 1 ммоль.глюкозы. Коли-

* С л

чество образующейся глюкозы измеряли глю-козооксидазно-пероксидазным методом [5]. Определение белка проводили по методу Бредфорд [6]. .

Получение мутантов Asp. awamori и Asp. niger. Природные штаммы Asp. niger и Asp. awamori были первоначально отобраны в результате скрининга в качестве продуцентов амилолитических ферментов. Для дальнейшего повышения продукции этих ферментов был использован УФ-мутагенез с последующей селекцией высокопродуктивных клонов. Ультрафиолет вызывает как «точковыё» мутации, так и хромосомные аберрации. В результате мутагенеза и селекции были отобраны следующие варианты: у Asp. awamori — 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7; у Asp, niger — 1, 2, 3, 4.

На первом этапе грибы облучали ультра- варианта Asp. awamori 1 (окрашивание мети-

фиолетом определенное время, потом вели поверхностное культивирование вариантов (и исходных, и облученных). В результате УФ-об-лучения в течение 30 мин у Asp. awamori выжило 8 — 28 % спор, получены мутантные варианты 1 — 3. При облучении УФ в течение 25 мин у этого же гриба выжило 72 — 95 % спор, в результате были получены мутантные варианты 4 — 7.

При облучении Asp. niger УФ в течение 20 мин выжило 80 — 95 % спор, получены мутантные варианты 1 — 4.

леновым синим). Форма конидий округлая с заметными небольшими зубчиками. У исходного штамма Asp. awamori конидии более светлые, меньшего размера (рис. 2).

У штаммов Asp. niger конидии также имели шаровидную форму; зубчики меньше, чем у гриба Asp. awamori.

Макроколонии гриба Asp. niger на плотных питательных средах (на агаризованной среде Чапека — Докса) по форме в основном круглые, крупные по размеру, мицелий более плотный и густой, чем у Asp. awamori. По направле-

Мутантные варианты Asp. awamori и Asp. нию к краю мицелий колонии паутинистый. У

niger от исходной культуры отличались образованием более обильной биомассы, морфологическими признаками (размером колоний), интенсивностью спороношения и образования пигмента, окраской колоний при выращивании на агаризованных средах.

Важно отметить, что при пересеве мутант-ных вариантов на селективные среды наблюдалось выщепление лишь около 10 % нетипичных колоний, что свидетельствует о морфологической стабильности.

Изучение культурально-морфологи-ческих свойств. У полученных мутантных колоний грибов Aspergillus были описаны культуральные свойства. Визуально наблюдали за морфологическими особенностями грибов рода Aspergillus при росте на твердой агаризованной среде (поверхностное культивирование) и на жидкой питательной среде (глубинное культивирование).

Грибы Asp. niger и Asp. awamori имели септированный, разветвленный, бесцветный многоядерный мицелий. Конидии у них одноклеточные, шаровидные [3]. На рис. 1 изображена микрофотография конидий мутантного

гЧч тшжщ р Ш'Щ

Рисунок 1 Конидии мутантного варианта 1

гриба Asp. awamori

исходных и мутантных вариантов в процессе длительного роста (около 10 дней) на среде того же состава наблюдалось пигментообразо-вание. Asp. niger выделял в среду пигмент зеленого цвета, по краям среда была окрашена в бордовый цвет. У мутантных вариантов проис-

ходило более раннее спороношение

через

двое суток, а у исходного штамма — лишь через трое суток. Спороношение у Asp. niger черное, образующееся в радиусе 3 — 5 см.

Колонии гриба Asp. awamori, и исходного, и мутантных штаммов различного размера, темно-коричневые, почти черные. Споры и конидии плесневых грибов содержат пигменты, что и придает зрелым культурам характерную окраску [4]. Край колонии лишен зрелого спороношения. Конидиальные головки довольно крупные в центре и более мелкие по направлению к краю. Конидии созревали у мутантных вариантов через двое суток и легко отделялись от мицелия. Гриб Asp. awamori образовывал пигмент бордового цвета у всех вариантов и при длительном росте вызывал растрескивание среды.

Глубинное культивирование грибов.

Рисунок 2 Конидии исходного штамма

Asp. awamori

Сравнение исходных и мутантных штаммов Asp. жении всего времени культивирования (рис. 4). awamori и Asp. niger проводили также при куль- У мутантных вариантов 1, 2 и 4 происходило тивировании в качалочных колбах на среде Чапека — Докса с крахмалом. При глубинном культивировании микроорганизмы развиваются во всем объеме жидкой питательной среды. В глубинной культуре протекают два неразрывно связанных процесса — синтез биомассы и синтез ферментов. Для исследования продуктивности мутантных вариантов по сравнению с исходными штаммами грибов была измерена их амилолитическая активность.

Содержание внеклеточного белка косвенно характеризует показатель биомассы микроорганизма. У исходного штамма гриба Asp. awamori содержание белка медленно повышалось до 6-х суток — до 0,59 мг / мл, затем практически не менялось (рис. 3). У всех мутантных вариантов при культивировании концентрация внеклеточного белка была ниже, чем у исходного штамма. Штаммы-продуценты

могут накапливать кроме «полезных» и «вредные» мутации. Вредные мутации часто проявляются в снижении скорости роста, возникновении дополнительных требований к скорости роста [2]. Самая высокая концентрация была на 5-е сутки у мутантного варианта 1, а низкая — у 4-го, причем в течение всего времени культивирования она находилась почти на одном уровне.

Содержание белка у исходного штамма Asp.

ф

niger было практически на одном уровне на протя-

плавное увеличение количества белка. У исходного штамма Asp. awamori образовалось столько же внеклеточного белка, что и у исходного штамма.

Определение АС основано на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной массы, т. е. АС — это способность ферментов амилолитического комплекса осуществлять гидролиз крахмала до декстринов. Максимальная АС наблюдалась у мутантного варианта 1, и на 5-е сутки она была равна 936,7 ед / л, затем происходило ее снижение (рис. 5). На 5-е сутки у мутантного варианта 1 АС была на 32,1 % больше по сравнению с контролем. Минимальные значения АС оказались у мутантного варианта 4 (происходило плавное увеличение АС в течение всего времени культивирования).

У исходного штамма Asp. niger на 5-е сутки проявился пик АС, который равен 635 ед / л (рис. 6). Самое высокое значение АС было у мутантного варианта 4, и оно составляло на 5-е сутки 914 ед / л, что больше, чем у контроля, на 40 %. Минимальными значениями АС среди мутантов обладал вариант 2, его АС тем не менее была больше, чем у контроля, на 16,4 %.

АС исходного штамма гриба Asp. awamori была больше, чем у исходного штамма гриба Asp. niger, на 15 %.

ч 0,6

s

s 0,5

rv

сз

2 0,4

(D Ю

0> 2 X

сЗ *

Си

=t о

U

0,3 0,2

0,1

0

Контроль X - Вариант 3

Время роста, сут

Вариант 1 - - Вариант 2

Вариант 5

- Вариант 6

Вариант 4 — - - Вариант 7

Рисунок 3

Содержание белка исходного и мутантных вариантов Asp. awamori

к

s

tm 2

со *

1> ID

<D S

aj *

a,

<u

n

о U

0,7 т~ 0,6 -

is 0,3

о

««I к» к н

0,5 -0,4 -

0,2 -0,1

*

ж -

Т

5

Время роста, сут

Контроль —■— Вариант 1 -•X - Вариант 3 —Ж - Вариант 4

- Вариант 2

Рисунок 4 Содержание белка исходного и мутантных вариантов Asp. niger

S

и <

3

Контроль X - Вариант 3

- Вариант 6

4

5

6

7

Время роста, сут

Вариант 1 - -А- - Вариант 2 Вариант 4 —#- Вариант 5 ---Вариант 7

Рисунок 5

АС исходного и мутантных вариантов Asp. awamori

1 ООО 900

800 -

et

о

и <

700

600 -500

400 300

200

3

5

Время роста, сут

6

7

Контроль —Вариант 1 - -Ь - Вариант 2 ■X - Вариант 3 —Ж - Вариант 4

Рисунок 6 АС исходного и мутантных вариантов Asp. niger

п 0)

*Ч

и £

1,8 '

с: S

<L>

•ч

о

ц U

0,6 -

0,4

4 1

J'

Контроль ■X - Вариант 3

- Вариант 6

Время роста, сут

Вариант 1 • -А- - Вариант 2 Вариант 4 —Вариант 5 — Вариант 7

Время роста, сут

Рисунок 7 ГлС исходного и мутантных вариантов Asp. awamori

Глюкоамилаза (U-l ,4-глюкан-глюканогидро лаза, К.Ф. 3.2.1.3) представляет собой экзодепо

Контроль —■— Вариант 1 - ч X - Вариант 3 —Ж - Вариант 4

- Вариант 2

Рисунок 8 ГлС исходного и мутантных вариантов Asp. niger

поэтому большое значение имеет их получение [8; 9]. Существенными недостатками из-

лимеразу, последовательно отщепляющую глю- вестных производственных способов получе-козные остатки от нередуцирующего конца по- ния глюкоамилазы является низкий уровень

продуктивности штамма по синтезу этого фермента, а также высокая стоимость культивирования из-за применения высококонцентрированных питательных сред и длительности процесса [7].

лисахаридных молекул крахмала или мальтоо-лигосахаридов, превращая их в глюкозу. Кроме С-1,4-глюкозидных связей глюкоамилаза гидро-лизует 0-1,6-глюкозидные связи. Глюкоамилазы относятся к промышленно важным ферментам,

У всех мутантных вариантов Asp. awamori ГлС возрастала до 5-х суток и затем снижалась (рис. 7). Максимальным значением ГлС обладал мутантный вариант 7: на 58 % больше контроля; самой низкой ГлС обладал мутантный вариант 4: ниже контрольного значения.

Наибольшей ГлС среди штаммов Asp. niger обладал мутантный вариант 2: выделялось самое большое количество глюкоамилазы, и ГлС на 5-е сутки была равна 18,9 ед / мл, что на 49 % больше, чем у контроля (рис. 8). У всех мутантных вариантов пик ГлС приходился на 5-е сутки культивирования. Исходный штамм по ГлС находился на самом низком уровне.

Итак, задача по получению мутантов с повышенным синтезом амилолитических ферментов была успешно выполнена.

Выводы. Были получены мутанты грибов Asp. awamori (7 мутантных вариантов) и Asp. niger (4 мутантных варианта) путем облучения

разования пигмента и окраской колонии при выращивании на агаризованных средах.

При культивировании мутантов Asp. awamori на среде Чапека — Докса с крахмалом наибольшее количество внеклеточного белка и амилоли-тическую активность показал мутантный вариант 1, амилолитическая способность была на 32 % выше, чем у исходного штамма. Глюкоамилазная способность была выше у мутантного варианта 7 (на 58 % больше, чем у исходного штамма).

При культивировании мутантов Asp. niger на среде Чапека — Докса с крахмалом наибольшее количество внеклеточного белка образовывал мутантный вариант 3, наивысшая амилолитическая способность была у мутантного варианта 4 (на 40 % больше, чем у исходного штамма). Глюкоамилазная способность у мутантного варианта 2 на 49 % выше по сравнению с исходным штаммом.

Использование новых штаммов позволит зна-

9 %

исходных штаммов ультрафиолетом. Они отли- чительно удешевить процесс производства фер-

чались от исходных штаммов образованием более обильной биомассы, размером колоний, интенсивностью спороношения, интенсивностью об-

ментных препаратов, получаемых на их основе, и увеличить эффективность использования в различных областях биотехнологии [1].

!

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Высокоактивный штамм гриба Asp. awamori — продуцент глюкоамилазы / А. П. Синицын, О. Н. Окунев, Н. В. Цурикова [и др.], [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://avl6833.corntr.ru/ default.html.

2. Дебабов В. Г. Селекция микроорганизмов на заре XXI века / В. Г. Дебабов / / Биотехнология. 2005. Вып. 5. С. 7 — 21.

3. Методы выделения, изучения и культивирования микроорганизмов / Т. И. Громовых, В. А. Тюль-панова, В. М. Гукасян [и др.]. Красноярск: СибГТУ, 2002. 152 с.

4. Морозова Е. В. Особенности экзогенного покоя конидий Asp. niger / Е. В. Морозова / / Микробиология. 2001. Вып. 5. С. 611 — 619.

5. Определение активности ферментов: справочник / Г. В. Полыгалина, В. С. Чередниченко, П. В. Рима-рева. М.: Дели Принт, 2003. 375 с.

6. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот, К. Джонс [пер. с англ.]. М.: Мир, 1991. 543 с.

7. Яровенко В. JI. Производство и применение глубинной культуры плесневых грибов в спиртовой промышленности / В. JI. Яровенко, Б. А. Устинников. М.: Пищевая промышленность, 1969. 262 с.

8. Bioenergetic conseguences of glucoamilase production in carbonlimited chemostat cultures of Asp. Niger / M. Metwuily, M. el Sayed, M. Osman [et al.] // Biotechnol. and Bioeng. 1991. Vol. 59, № 1. P. 35 — 43.

9. Molecular basis of glucoamylase overproduction by a mutagenised inductrial strain of Aspergillus niger / D. A. Mackenzie, B. J Jeenes, X. Gou [et ah] / / Enzyme Microb. Technoh 2000. Vol. 26, № 1. P. 193 — 200.

10. Production of alpha-amylase with Asp. oryzae on spent brewing grain by solid substrate fermentation / B. Bogar, G. Szakaes, P. Tengerdy [et ah] // Biotechnol. and Bioeng. 1999. Vol. 65, № 6. P. 638 — 648.

i

1

л f

Поступила 18.10.06.

ft !

i I

£