CC BY
34
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА А-АМИЛАЗЫ BACILLUS SUBTILUSNK-16 И ГЛЮКОАМИЛАЗЫ ASPERGILLUS ORYZAE UZMUК-14 Нормуродова К.Т.1, Алимджанова Л.И.2, Бозоров Н.И.3 Email: [email protected]
1Нормуродова Кундуз Тогаевна - кандидат биологических наук, доцент, кафедра микробиологии, биологический факультет,
Национальный университет Узбекистана; 2Алимджанова Лола Искандаровна - преподаватель, кафедра биотехнологии, факультет промышленной фармации, Ташкентский фармацевтический институт;
3Бозоров Нурад Исматович - кандидат химических наук, доцент, заведующий кафедрой, кафедра методики предподавания химии, факультет естественных наук, Ташкентский государственный педагогический университет, г. Ташкент, Республика Узбекистан
Аннотация: в этой работе были использованы гидролитические ферменты а-амилазы культур B.subtilus NK-16 и глюкоамилазы A.oryzae UzMU К-14. Для создания ферментных комплексов в условиях производства спирта для активации термоустойчивых ферментов а-амилазы B.subtilus NK-16 и глюкоамилазы A.oryzae UzMU К-14, после остановки процесса ферментации были добавлены дополнительные вещества, такие как сорбитол, сорбат, Са-ацетат которые выполняют роль стимуляторов. Этот фильтрат культуральной жидкости (КЖ) с амилолитической активностью 450 ед./мл и 200-210 ед./мл, количество белка 48,9 ед./мг и 56,7 ед./мг, рН 5,8-6,2. Гидролиз крахмалсодержащих продуктов с помощью высоко активных и конкурентоспособных бактериальных а-амилаз и активированных ферментных комплексов грибковых глюкоамилаз проводился не только в лабораторных условиях, также параллельно и в условиях производства. Применение активизированных а-амилазных и глюкоамилазных ферментных комплексов при производстве этанола из крахмалсодержащего сырья приводит к следующему: 10%-я экономия энергии в процессе производства и увеличение выхода спирта до 4-5,34%. Изучены субстрат-специфичные свойства очищенных и активизированных ферментных комплексов а-амилазы B.subtilus NK-16 и глюкоамилазы A.oryzae UzMU К-14. Субстратная специфичность ферментов проверена вискозиметрически на вискозиметре Освальда диаметром 0.73 мм. Использовали 1% раствор различных полисахаридов, связанных ß-(1-4)-гликозидными (маннан, глюкоманнан) и ß-(2-1)-фруктофурунозидными связями (инулин). Активизированные ферментные комплексы гидролизовались лучше, чем очищенные ферменты: рисовый крахмал на 96 % и 84%, пшеничный и кукурузный на 83% и 78%, картофельный на 81% и 73%, маннан и глюкоманнан меньше на 25-30% и инулин почти не гидролизовался.
Влияние рН на активность ферментных комплексов изучалось в диапазоне 4,0-8,0. Результаты показали, что ферменты наиболее активны при рН 6,0 и сохраняют 90-95% активность. Изучено влияние температуры на активность ферментных комплексов в диапазоне 30-100°С. Ферментный комплекс а-амилазы был высокоактивным при 75-80оС, а глюкоамилазы при 60-65оС и сохранили 80-90% активность.
Ключевые слова: Bacillus subtilus, а-амилазы, ферментный комплекс, Aspergillus oryzae, глюкоамилазы, свойства, субстратная специфичность.
STUDY OF THE ACTIVE COMPLEX OF a-AMYLASE BACILLUS SUBTILUSNK-16 AND GLUCOAMYLASE ASPERGILLUS ORYZAE
UZMU K-14
1 2 3
Normurodova K.T. , Alimdjanova L.I. , Bozorov N.I.
1Normurodova Kunduz Togayevna - PhD in Biology, Associate Professor, DEPARTMENT OF MICROBIOLOGY, BIOLOGICAL FACULTY, NATIONAL UNIVERSITY OF UZBEKISTAN; 2Alimdjanova Lola Iskandarovna - Lecturer, DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY, FACULTY OF INDUSTRIAL PHARMACY, TASHKENT PHARMACEUTICAL INSTITUTE;
3Bozorov Nurad Ismatovich - PhD in Chemistry, Associate Professor, Head of the Chair, CHAIR METHODOLOGY OF CHEMISTRY ASSUMPTION, NATURAL SCIENCES FACULTY, TASHKENT STATE PEDAGOGICAL UNIVERSITY, TASHKENT, REPUBLIC OF UZBEKISTAN
Abstract: in this work, the hydrolytic enzymes of a-amylase of cultures of B. subtilis NK-16 and the glucoamylase A.oryzae UzMU K-14 were used. To create enzyme complexes under alcohol production conditions, additional substances such as sorbitol, sorbate, Ca-acetate were added to stop the fermentation process to activate the heat-resistant enzymes of a-amylase B. subtilus NK-16 and the glucoamylase A.oryzae UzMU K-14, which act as stimulants. This is a filtrate of iquid (CL) with amylolytic activity of 450 U/ml and 200-210 U/ml, the amount of protein is 48.9 U/mg and 56.7 U/mg, pH 5.8-6.2. Hydrolysis of starch-containing products with the help of highly active and competitive bacterial a-amylases and activated enzyme complexes of fungal glucoamylases was carried out not only under laboratory conditions, but also in parallel and under production conditions. The use of activated a-amylase and glucoamylase enzyme complexes in the production of ethanol from starch-containing raw materials leads to the following: 10% energy savings during production and an increase in alcohol yield to 4-5.34%.
The substrate-specific properties of the purified and activated enzyme complexes of a-amylase and B. subtilis NK-16 and the glucoamylase A.oryzae UzMU K-14 were studied. Substrate specificity of enzymes viscosimetrically on an Oswald viscometer with a diameter of 0.73 mm. 1% solution of various polysaccharides bound with в- (1-4) - glycoside (mannan, glucomannan) and в- (2-1)-fructofuronoside bonds (inulin) was used. The activated enzyme complexes were hydrolyzed better than the purified enzymes: 96% by starch and 84% by wheat, 83% by wheat and 78% by maize, by 81% by potato and 73% by potato, by 25-30% by mannan and glucomannan, and by almost not hydrolyzed inulin.
The effect of pH on the activity of enzyme complexes was studied in the range 4.0-8.0. The results showed that enzymes most active at pH 6.0 retain 90-95% activity. The effect of temperature on the activity of enzyme complexes in the range 30-100 °C was studied. The enzyme complex of a-amylase was highly active at 76-80 °C and glucoamylases 60-65 °C and retained 80-90% activity. Keywords: Bacillus subtilus, a-amylase, enzyme complex, Aspergillus oryzae, glucoamylase, properties, substrate specificity.
УДК 577.152.3
Самая важная задача в современной биотехнологии - создание комплекса высокоактивных и термофильных ферментов для переработки крахмалсодержащего сырья и расщепления его в различной степени в промышленных условиях [1]. На сегодняшний день, в различных отраслях производства Республики Узбекистан существует большой спрос на а-амилазные и глюкоамилазные ферментные препараты [2].
В республике при ферментативной обработке крахмалсодержащего сырья до сих пор используются импортные ферментные препараты. В связи с этим, получение активированных ферментных комплексов а-амилазы и глюкоамилазы из местных штаммов бактерий и грибов для пищевой промышленности и обеспечение их высокой устойчивости
очень важно. Ранее нами был создан Bacillus subtilis NK-16 и отобран Aspergillus oryzae UzMUК-14 - продуценты а-амилазы и глюкоамилазы [2-3].
Цель работы: разработка активизированного комплекса а-амилазаы и глюкоамилазы для обработки крахмалсодержащего сырья.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе были использованы гидролитические ферменты культур
а-амилазы B.subtilus NK-16 [2] и глюкоамилазы A.oryzae UzMU К-14 [3].
а-Амилазную и глюкоамилазную активность определяли по ГОСТу
20264.4-89 [4].
Субстратную специфичность ферментов определяли вискозиметрически на вискозиметре Освальда диаметром 0,73 мм, используя 1% растворы различных полисахаридов, отличающиеся по природе гликозидных связей и длине фрагментной цепи, связанных ß-(1-4)-гликозидными и ß-(2-1)-фруктофурунозидными связями. Сначала измеряли вязкость холостого субстрата, т.е. время истечения на вискозиметре (контроль). Затем добавляли 1 мл ферментного раствора с расчетом амилолитической активности 10 Ед/мл и инкубировали при 50оС в течение 10 мин. По истечении времени заново измеряли вязкость субстрата (опыт). Разница истечения инкубационной смеси во времени между контролем и опытом указывала на степень гидролиза и специфичность фермента к данному субстрату.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В создании ферментных комплекс для активации гидролитических ферментов важную роль играют допольнителные вещества, которые выполняют роль стимуляторов. В связи с этим, в условиях производства спирта для активации термоустойчивых ферментов а-амилазы B.subtilus NK-16 и глюкоамилазы A.oryzae UzMU К-14, КЖ с амилолитической активностью 450 ед./мл и 200-210 ед./мл, количество белка 48,9 ед./мг и 56,7 ед./мг, рН 5,86,2, после остановки процесса ферментации были добавлены дополнительные вещества, которые в комплексе повышают количество аминов свободного азота и увеличивают связь между ферментом и субстратом.
В процессах осахаривания и брожения крахмала большое значение имеют а-амилаза и глюкоамилаза. Гидролизирующая доза ферментов при деградации крахмала приведена в таблице 1.
Гидролиз крахмалсодержащих продуктов с помощью высоко активных и конкурентоспособных активированных ферментных комплексов а-амилаз и глюкоамилаз проводился не только в лабораторных условиях, а также параллельно и в условиях производства.
Таблица 1. Условия применения активизированных комплексов а-амилазы и глюкоамилазы
при деградации крахмала
Параметры Комплекс активизированной а-амилазы (1000 ед.) Комплекс активизированной глюкоамилазы (1000 ед.)
Дозы ферментов 0.80-1.0 кг/т засыпи 0.8-1.6 кг/т засыпи
рН 5.5-6.0 5.0-6.0
Время реакции 60-90 минут 120-150 минут
Температура 80-85 оС 60-65 оС
Таким образом, применение активизированных а-амилазных и глюкоамилазных ферментных комплексов при производстве этанола из крахмалсодержащего сырья приводит к следующему: 10%-я экономия энергии в процессе производства, увеличение выхода спирта до 4-5,34%, ускорение процессе перегона, удаление дополнительных продуктов.
В следующих опытах были изучены субстрат специфические свойства очищенных и активизированных ферментных комплексов а-амилазы В.зиЪШш ЫК-16 и глюкоамилазы А.о^ае ШМиК-14 (рис. 1).
Основным и важным критерием характеристики ферментных белков является их субстратная специфичность по отношению к различным низко- и высокомолекулярным, а также структурно различающимся субстратам. С целью сравнительного изучения свойств
активизированных ферментных комплексов с субстратом и очищенных а-амилазы и глюкоамилазы нами была исследована её субстратная специфичность. В качестве субстратов использовали различные растительные полисахариды: инулин, выделенный из топинамбура, крахмал картофельный, рисовый, пшеничный, кукурузный, а также олигосахариды - маннан и глюкоманнан в концентрации 1%. Субстраты различались между собой по строению химической связи.
120 -
рис. крахмал глнжоманнан маннан инулин пщен. кукур- карт, крахмал
Ряд крахмальных субстратов ^язвял «рашал
В Очищенная а-амнлаза □ Комплекс активизированной о-амялазы П очщденнаяглюкоамипазы_И Комплекс активизированной глюкоамилазы
Рис. 1. Субстратная специфичность очищенных и активизированных ферментных комплексов а-амилазы Bacillus subtilus NK-16 и глюкоамилазы Aspergillus oryzae UzMU К-14
Примечание: I-наличие достоверных различий от показателя контрольного варианта при Р<0,05.
Полученные экспериментальные данные (рисунок) показали, что активизированные ферментные комплексы гидролизовали лучше, чем очищенные ферментов: рисовый крахмал на 96% и 84%, пшеничный и кукурузный на 83% и 78%, картофельный на 81%и 73%, маннан и глюкоманнан меньше - на 25-30% и инулин почте не гидролизовал.
Для характеристики активизированных комплексов а-амилазы и глюкоамилазы были изучены физико-химические свойства, такие как температура и рН на активность ферментных комплексов. Влияние рН на активность ферментных комплексов изучалось в диапазоне 4,0-8,0. Результаты показали, что ферменты наиболее активны при рН 6,0 и сохраняют 90-95% активность. Изучено влияние температуры на активность ферментных комплексов в диапазоне 30-100 °C. Ферментный комплекс а-амилазы был высокоактивным при 76-80 °С, а глюкоамилазы при 60-65 °С и сохранили 80-90% активность.
Полученные данные показывают, что активированные ферментные комплексы а-амилазы B. subtilus NK-16 и глюкоамилазы A. oryzae UzMU К-14 активно гидролизуют полисахариды с а-(1,4)-гликозидными связями и расширяют область практического использования.
ВЫВОДЫ. Таким образом, в производстве спирта устойчивые B.subtilus NK-16 а-амилазные и A.oryzae UzMU К-14 глюкоамилазные ферменты с помощью дополнительных веществ ускоряют взаимосвязь между ферментом и субстратом.
Список литературы /References
1. Bezborodov А.А., Zagustina N.A., Popov V.O. Enzymatic processes in Biotechnology. М.:
Nauka, 2008. P. 5-11.
2. Нормуродова К.Т., Муратов Г.А. Получение мутантного штамма Bacillus subtilis NK-16 продуцента термостабильной а-амилазы // Узбекский биологический журнал, 2014. № 6. С. 76-79.
3. Normurodova К.Т. Study morphology and physiology by the fungus of Aspergillus sp. UzMU K-14 producer of enzyme Glukoamylase // Доклады академии наук Республики Узбекистан, 2016. № 3. C. 69-71.
4. Рухлядева А.П. и др. Методы определения активности гидролитических ферментов. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. С. 288.
