CC BY
62
Оригинальные статьи
69
цитотоксические и токсикологические характеристики окислительно-восстановительных дендримеров
Е.Ю. Григорьева1, Ю.в. Стукалов1, Е.Ю. колдаева1, м.и. лукашина2, т.А. Сидорова1,
А.С. масько1, н.в. Позднякова1
1ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; 2ФГБУН «Институт биологии гена Российской академии наук»; Россия, 119334 Москва, ул. Вавилова, 34/5
Контакты: Елена Юрьевна Григорьева [email protected]
Введение. Окислительно-восстановительные дендримеры могут образовывать анион-радикалы, т. е. способны генерировать синглетный кислород и перекись водорода. В данной исследовательской работе проведена предварительная оценка эффективности синтезированного нами REDOX-дендримера (RD) по его цитотоксической активности на клетках млекопитающих in vitro и определены возможные токсические дозы соединения при введении его лабораторным животным. Цель работы — оценка цитотоксической активности RD на клетках млекопитающих in vitro и определение доз, характеризующих токсичность при введении лабораторным животным.
Материалы и методы. Исследования цитотоксической активности RD выполнены методом МТТ и подсчетом живых клеток на эмбриональных фибробластах сирийского хомячка, трансформированных геном Src (ХЭТР-SR); эмбриональных фи-бробластах сирийского хомячка, трансформированных геном NRAS (ХЭТР-NRAS); линии клеток СНО-К1 (спонтанно трансформированные эпителиальные клетки яичников китайского хомячка); культуре линии клеток эритроидного лейкоза человека К562 и ее субклоне K562/iS9. Возможные токсические эффекты RD исследовали на здоровых мышах BDFпри однократном внутрибрюшинном введении.
Результаты. Определение чувствительности клеток исследуемых линий к цитотоксическому действию RD показало, что он эффективно воздействует на клетки с разной активностью каталазы. Ингибирование роста 50 % клеток (IC0) происходит при концентрациях RD: 6,871E-09- 7,031E-09 М- для линии ХЭТР-NRAS; 1,64E-08-1,78E-08 М-для линии ХЭТР-SR; 2,92E-08-3,06E-08 М — для линии СНО-К1. Для линии K562/iS9 показатель IC00 находится в диапазоне концентраций от 1,698Е-005 до 2,606Е-005 М, для линии К562 — от 1,288Е-005 до 1,722Е-005 М. По итогам проведенных исследований острой токсичности RD в диапазоне доз 250—1500 мг/кг получены следующие характеристики: ЛД1д = 948 ± 4 мг/кг, ЛД5д = 1000 ± 21 (958 - 1043) мг/кг.
Заключение. В данной исследовательской работе на моделях in vitro и in vivo был изучен синтезированный RD. Определены параметры его токсического действия на клетки, различающиеся по активности каталазы. Полученные значения IC0 Ü10-4 М свидетельствуют, что соединение нового класса является цитотоксически активным. Исследование острой токсичности на мышах показало, что эффекты синтезированного RD носят дозозависимый характер.
Ключевые слова: REDOX-дендример, цитотоксичность, токсикология DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-3-69-74
cytotoxic and toxicological characteristics of oxidation-reduction dendrimers
E. Yu. Grigor'eva', Yu. V. Stukalov1, E. Yu. Koldaeva1, M.I. Lukashina2, T.A. Sidorova1, A.S. Mas'ko1, N. V. Pozdnyakova1
1N.N.. Blokhin National Medical Research Oncology Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia; 2Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; 34/5 Vavilova St., Moscow 119334, Russia
Introduction. Oxidation-reduction dendrimers can produce anion-radicals, that is singlet oxygen and hydrogen peroxide. In this study toxicity of newly synthesized REDOX-dendrimer (RD) in mammalian cells in vitro and in vivo were preliminary evaluated. Objective: toxicity assessment of new RD for mammalian cells in vitro and in vivo.
Materials and methods. Cytotoxicity studies of RD was made with MTT and direct living cells counting methods in Syrian hamster embryonic fibroblasts, modified with Src gene (HETR-SR); Syrian hamster embryonic fibroblasts, modified with NRAS gene (HETR-NRAS); Chinese hamster ovary cancer cell line CHO-K1; erythroid human leukosis K562 and it's subclone K562/iS9. In vivo toxicity was evaluated in healthy BDF mice using single intraperitoneal injection.
Results. RD studies showed that it effectively influences cell lines with different catalase activity. 50 % growth inhibition (IC0) was observed at concentration of RD: 6,871E-09- 7,031E-09 M - for HETR-NRAS; 1,64E-08-1,78E-08 M - for HETR-SR; 2,92E-08-
70 Оригинальные статьи
3,06E-08 M - for СНО-К1 strain. For K562/iS9 and К562IC50 value was within the range from 1,698Е-005 to 2,606Е-005 М and from 1,288Е-005 to 1,722Е-005М, respectively. Acute toxicity studies in mice showed that LDW = 948 ± 4 mg/kg and LD00 = 1000 ± 21 (958 - 1043) mg/kg. Conclusion. New RD was studied in this research both in vitro and in vivo. It's toxic parameters were determined in mammalian cells with different catalase strength. Obtained values ofIC00 йЮ-4 М show that studied RD is cytotoxic. Acute toxicity studies in mice showed that RD influence on animals is dose dependant. Key words: REDOX-dendrimer, cytotoxity, toxicology Введение по 100 тыс. клеток. RD добавляли через 3 ч после В последнее время особое внимание уделяют распределения клеток. Итоговые концентрации RD проблеме разработки противоопухолевых препаратов составляли для линий ХЭТР-SR, ХЭТР-NRAS, для терапии онкологических заболеваний в виде нано- СНО-К1 от 1 до 1000 мкг/мл (7,61E-10—7,61E-7 М). конструкций на основе дендримеров. Нами синтези- Затем планшеты инкубировали в течение 2—7 дней рованы REDOX-дендримеры (RD), содержащие в своей в условиях СО2-инкубатора при постоянной темпе-структуре производные метилантрахинона [1]. Такие ратуре +37 °С. Мониторинг популяции проводили соединения могут образовывать анион-радикалы, ежедневно под инвертированным микроскопом. т. е. способны генерировать синглетный кислород При необходимости оценивали качественное и кои перекись водорода, что может приводить к окисли- личественное изменение обработанных клеток тельному стрессу в клетках [2, 3], остановке деления в сравнении с интактными (не обработанными RD) и их гибели путем апоптоза [4] или некроза [5]. Эти методом подсчета клеток в камере Горяева. свойства могут быть использованы для создания МТТ-тест. Для изучения цитотоксической ак-противоопухолевых препаратов. тивности препаратов был использован МТТ-метод Цель работы — предварительная оценка цитоток- [11]. Клетки рассевали на 96-луночные плоскодон-сической активности RD на клетках млекопитающих ные планшеты фирмы Corning (США) (объем среды in vitro и определение возможных токсических доз сое- 200 мкл), затем инкубировали и вносили необходи-динения при введении его лабораторным животным. мые для исследования концентрации RD, которые составляли для линий ХЭТР-SR, ХЭТР-NRAS от 5 Материалы и методы до 25 мкг/мл (3,807E-09-1,903E-08 М), для СНО-К1 Клеточные линии. Исходя из особенностей соз- от 3 до 20 мкг/мл (2,2842E-09—1,523E-08 М) и для данных дендримеров и учитывая, что в антиокси- клеток К562, K562/iS9 от 5,75 до 365,12 мг/мл дантной системе клетки каталаза является основным (4,375E-06—2,78E-04 М). Концентрации вносимого ферментом, нейтрализующим перекись водорода до RD были определены на основании предварительных воды, для исследования цитотоксической активно- исследований. Через 24, 48 и 72 ч инкубации клеток сти были выбраны клеточные линии, различающие- с препаратами добавляли МТТ (5 мг/мл). Количество ся уровнем активности каталазы: эмбриональные растворенного формазана определяли на фотометри-фибробласты сирийского хомячка, трансформиро- ческом анализаторе иммуноферментных реакций ванные геном Src (ХЭТР-SR — 17,7 МЕ/1,0 мг белка), «Пикон» (Россия) при длине волны 535 нм. Количе-и эмбриональные фибробласты сирийского хомячка, ственным критерием цитотоксичности препаратов трансформированные геном NRAS (ХЭТР-NRAS — служил индекс IC50, отражающий концентрацию 1,5 МЕ/1,0 мг белка) (НМИЦ онкологии им. Н.Н. Бло- соединений, вызывающую гибель 50 % клеток. хина) [6, 7], а также высокочувствительная тест-линия За 100 % принимали выживаемость клеток, инкуби-СНО-К1 (спонтанно трансформированные эпители- рованных без препаратов (контроль). Величина IC50 альные клетки яичников китайского хомячка) (ин- была определена с помощью метода численных ре-ститут GSI — Gesellschaft fur Schwerionenforschung, шений по 3 экспериментальным точкам с макси-Дармштадт, Германия) [8]. Исследования также были мальными значениями модуля первой производной проведены на линии эритроидного лейкоза человека экспериментальной кривой выживаемости клеток. К562 и К562^9 (НМИЦ онкологии им. Н.Н. Бло- Степень подавления роста клеток под влиянием хина) [9, 10]. RD (%) вычисляли по формуле [12]: Оценка цитотоксичности. Цитотоксическую активность RD определяли методом подсчета клеток Ц = [(1 — Опыт) / Контроль] х 100 %. и МТТ-тестом. Метод подсчета. Клетки рассевали в лунки пло- Статистическая обработка экспериментальных скодонных 12-луночных планшетов фирмы SPL Life данных была выполнена с помощью компьютер-Sciences (Корея) (объем среды 1,5 мл), куда вносили ной программы GraphPad Prizm. Статистическую
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 3'2017 том 16 |vol. 16
Оригинальные статьи 71
значимость различии определяли с использованием непараметрического t-критерия, различия считали статистически значимыми приp <0,05.
токсикологические исследования. Исследования выполнены в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми ЕвропеИскоИ конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей [13, 14]. Предварительную оценку токсического воздействия RD на организм животных осуществляли в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» под ред. А.Н. Миронова [15].
В эксперименте использовали здоровых мышей-самцов BDF массой тела 19—21 г, полученных из питомника ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России (филиал «Столбовая»). Для проведения исследований формировали группы одновозрастных животных по 6 особей на каждую дозу и для создания одновесовой контрольной группы [16]. RD, растворенный в физиологическом растворе с 10 % содержанием диметилсульфоксида, вводили животным однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл раствора с различными концентрациями RD. RD вводили мышам в дозах 250, 400, 700, 850, 1000 и 1500 мг/кг.
Наблюдение за животными осуществляли в течение 30 дней, ежедневно отмечая изменения в их состоянии и поведении и 2 раза в неделю проводя взвешивание. Критериями оценки острой токсичности соединения служили число павших животных и сроки их гибели, клиническая картина интоксикации, изменение поведенческих реакций и патологические изменения в тканях и внутренних органах, выявляемые при аутопсии павших животных и животных, умерщвленных в конце опыта (макроскопическая оценка) [17—19]. На основании проведенного исследования были рассчитаны параметры токсических доз с использованием программы BioStat Professional 2009. Летальные дозы (ЛД) представлены как среднее ± стандартная ошибка. Для ЛД50 в скобках дан 95 % доверительный интервал.
Результаты
оценка цитотоксической активности RD. Определение чувствительности клеток ХЭТР-SR, ХЭТР-NRAS и СНО-К1 к цитотоксическому действию RD в широком диапазоне концентраций показало, что RD эффективно воздействует на клетки с разной ка-талазной активностью (рис. 1). Учитывая, что исследуемый дендример вызывает индукцию синглетного кислорода, клеточные линии, различающиеся по ба-зальному уровню экспрессии каталазы, показали ожидаемые закономерности: IC90 (ХЭТР-NRAS) < IC90 (ХЭТР-SR). Это соответствует известной роли дан-
100
80
60
40 ■
20
-10
-9 -8 -7
Концентрация, Ig(M)
—1
-5
рис. 1. Цитотоксический эффект действия RD на клеточные линии СНО-К1, ХЭТР-SR, ХЭТР-NRAS
ного фермента в антиоксидантной системе. Для клеточной линии ХЭТР-NRAS 1С90 находится в диапазоне 5,848Е-08—6,427Е-08 М, для линии с высоким уровнем каталазы ХЭТР^Я 1С90 составляет от 7,38Е-08 до 8,04Е-08 М. Диапазон 1С90для линии СНО-К1 -от 5,19Е-07 до 5,36Е-07 М.
На рис. 2 представлена картина видимого токсического действия КО на трансформированные клетки СНО-К1. Выживаемость клеток в присутствии дендримера не изменяется вплоть до концентрации 10 мкг/мл (7,61Е-09 М), при 100 мкг/мл (7,61Е-08 М) установлена гибель 80 % клеток.
После получения данных о цитотоксичности, показавших в целом чувствительность клеток к окислительному стрессу, провели МТТ-тест на тех же линиях для количественного определения ингиби-рования роста клеток. Действие ЯО исследовали в более узком интервале вводимых концентраций -3-25 мкг/мл (2,2842Е-09-1,903Е-08 М). По результатам теста были определены следующие значения индекса 1С50: для ХЭТР-NRAS - 6,871Е-09-7,031Е-09 М; для ХЭТР^Я - 1,64Е-08-1,78Е-08 М; для СНО-К1 -2,92Е-08-3,06Е-08 М.
Исследование цитотоксического действия дендримера на клетки человека (К562 и К562^9), проведенное методом МТТ, показало, что 1С50 для линии К562 составила от 1,288Е-005 до 1,722Е-005 М, а для К562^9 диапазон 1С50 находится в интервале от 1,698Е-005 до 2,606Е-005 М (рис. 3).
Принимая во внимание, что соединение нового класса считается цитотоксически активным при 1С50 ¿10-4 М [12], ЯО может быть рассмотрен в качестве потенциального противоопухолевого соединения.
токсикологическое исследование КО. Критериями оценки острой токсичности соединения служили
0
рис. 2. Микрофотография типичной картины наблюдаемого токсического действия RD на трансформированные клетки СНО-К1: а — контроль (необработанные клетки); б — клетки с дозой дендримера 10мкг/мл (7,61Е-09 М); в — клетки с дозой дендримера 100мкг/мл (7,61Е-08М). Окраска трипановым синим, х 40
Концентрация,
рис. 3. Цитотоксический эффект действия RD на клеточные линии эритроидного лейкоза человека
число павших животных и сроки их гибели. Результаты проведенных исследований приведены в табл. 1. На основании этих данных были рассчитаны токсические дозы RD для мышей (табл. 2).
При введении летальных доз RD наблюдали транзиторное возбуждение, переходящее в сопорозное состояние. Смерть животных наступала в зависимости от дозы RD в интервале от 2,5 до 48 ч. У выживших животных в течение первых 3 дней после введения отмечали транзиторную потерю 5—10 % массы тела и проявление повышенной активности.
При аутопсии павших животных было отмечено, что петли тонкой кишки имели признаки кровоизлияния — наличие темного содержимого в просвете тонкой кишки; при осмотре внутренней поверхности кишки обнаружены петехии, отечность тканей (рис. 4).
таблица 1. Токсичность RD при однократном внутрибрюшинном введении мышам-самцам BDF
доза КО, мг/кг Число умерших мышей/ всего мышей
250 0/6
400 0/6
700 0/6
850 0/6
1000 3/6
1500 6/6
I
таблица 2. Расчетные токсические дозы RD при однократном внутрибрюшинном введении мышам-самцам ВDF
Доза КО, мг/кг
ЛД10 ЛД16 ЛД50 ЛД84
948 ± 4 959 ± 1 1000 ± 21 (958 - 1043) 10042 ± 1
I
Сердце, почки, печень — без визуально выраженной патологии; брюшина не воспалена.
При введении в сублетальных дозах соединение не вызывало видимых нарушений в состоянии и поведении животных, однако отмечали снижение скорости реакции на внешние раздражители звукового и тактильного происхождения без признаков атаксии или местных парезов. Мыши прибавляли массу тела в соответствии с динамикой в контрольной группе, состояние кожи и волосяного покрова не изменялось, что свидетельствует об отсутствии у RD ярко выраженного острого токсического действия. При аутопсии выведенных из эксперимента животных — внутренние органы без особенностей.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN J0URNAL 0Р ВЮТШАРУ
3'2017 том 16 | voL 16
Оригинальные статьи
73
Рис. 4. Образцы тонкой кишки мышей: а — контроль; б — после введения RD в дозе 1000 мг/кг
Заключение
Был синтезирован RD, который за счет реакционно-способных групп во внешней сфере позволяет присоединять опухолеспецифичные агенты, что обеспечивает направленность доставки соединений этого класса.
В данной исследовательской работе на моделях in vitro и in vivo был изучен синтезированный RD.
Определены параметры его токсического действия на клетки, различающиеся по активности каталазы. Полученные значения 1С50 <10-4 М свидетельствуют, что соединение этого класса является цитотоксиче-ски активным. Исследование острой токсичности на мышах показало, что действие синтезированного ЯО носит дозозависимый характер.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Стукалов Ю.В., Григорьева Е.Ю., Калыгина Н.С. и др. Окислительно-восстановительные дендримеры. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(4):40-3.
DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-440-43.
2. Valko M., Leibfritz D., Moncol J. et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 2007;39(1):44-84.
DOI: 10.1016/j.biocel.006.07.001. PMID: 16978905.
3. Cadenas E., Davies K.J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic Biol Med 2000; 29(3-4):222-30.
DOI: 10.1016/S0891-5849(00)00317-8. PMID: 11035250.
4. Zhuang S., Yan Y., Daubert R.A. et al. ERK promotes hydrogen peroxide-induced apoptosis through caspase-3 activation and inhibition of Akt in renal epithelial cells. Am J Physiol Renal Physiol 2007;292(1):F440-7.
DOI: 10.1152/ajprenal.00170.2006. PMID: 16885155.
5. Choi K., Kim J., Kim G.W., Choi C. Oxidative stress-induced necrotic cell death via mitochondria-dependent burst of reactive oxygen species. Curr Neuro-vasc Res 2009;6(4):213-22.
DOI: 10.2174/156720209789630375. PMID: 19807658.
6. Mikalsen S.O., Holen I., Sanner T. Morphological transformation and cata-lase activity of Syrian hamster embryo cells treated with hepatic peroxisome proliferators, TPA and nickel sulphate. Cell Biol Toxicol 1990;6(1):1 —13. DOI: 10.1007/BF00135022.
PMID: 2334865.
7. Дейчман Г.И., Кашкина Л.М., Матвеева В.А. и др. Фенотипические различия между трансформированными in vitro и опухолевыми клетками: ранние стадии естественного отбора in vivo. Вестник НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина РАМН 2001;12(3):16—24.
8. Hawes B.E., Luttrell L.M.,
Van Biesen T., Lefkowitzi R.J. Phospha-tidylinositol 3-kinase is an early intermediate in the G beta gamma-mediated mitogen-activated protein kinase signa-
ling pathway. J Biol Chem 1996;271(21):12133-6. DOI: 10.1074/jbc.271.21.12133. PMID: 8647803. 9. Luczak M., Kazmierczak M.,
Handschuh L. et al. Comparative pro-teome analysis of acute myeloid leukemia with and without maturation. J Proteomics 2012;75(18):5734-48. DOI: 10.1016/j.jprot 2012.07.030. PMID: 22850270.
10. Сидорова Т.А., Вагида М.С., Калия О.Л., Герасимова Г.К. Роль ка-талазы в защите опухолевых клеток от окислительного стресса, индуцированного бинарной каталитической системой «терафтал + аскорбиновая кислота». Клиническая онкогемато-логия 2014;7(3):282-9.
11. Sylvester P.W. Optimization of the tetra-zolium dye (MTT) colorimetric assay for cellular growth and viability. Methods Mol Biol 2011;716:157-68.
DOI: 10.1007/978-1-61779-012-6_9. PMID: 21318905.
12. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические указания по изучению противоопухо-
левой активности фармакологических веществ. В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Р.У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. С. 637-51.
13. Большаков О.П., Незнанов Н.Г., Бабаханян Р.В. Дидактические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных. Качественная клиническая практика 2002;1:58-61.
14. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experi-
mental and other scientific purposes (Council of Europe, ETS No. 123). 1986.
15. Арзамасцев Е.В., Березовская И.В., Верстакова О.Л. и др. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. А.Н. Миронова и др. М.: Гриф и К, 2012. С. 13-23.
16. Арзамасцев Е.В., Гуськова Т.А., Березовская И.В. и др. Методические указания по изучению общетоксиче-
ского действия фармакологических веществ. В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Р.У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. С. 41-53.
17. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., 1968. 151 с.
18. Гуськова Т.А. Токсикология лекарственных средств. М., 2003. С. 51-78.
19. Трахтенберг И.А., Сова А.Е., Шефтель В.О., Оникиенко Ф.А Проблема нормы в токсикологии. М.: Медицина, 1992. С. 48-142.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
3'2017 том 16 | vol. 16
