CC BY
67
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 616-006: (616.155.3: 615.37)
УСИЛЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ТОРМОЖЕНИЕ РОСТА ОПУХОЛИ У МЫШЕЙ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ БАКТЕРИАЛЬНОГО ИММУНОМОДУЛЯТОРА
Н.К. Ахматова1, Е.А. Лебединская2, А.Т. Ахматов1, О.В. Лебединская2, Ф.В. Доненко3, М.В. Киселевский3
ГУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН», г. Москва1,
ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия Росздрава»2,
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва3
Проведено сравнительное изучение стимулирующего влияния «Иммуновак В11-4», бактериальных липополисахаридов (ЛПС) и фитогемагглютинина (ФГА) на цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК) человека по отношению к лейкозной НК-чувствительной линии клеток К562 и колоректального рака Со1о. Выявлен дозозависимый эффект воздействия поликомпонентной вакцины ВП-4, ЛПС и Ф1А. Показано, что вакцина ВП-4 оказывает более выраженный стимулирующий эффект на цитотоксичность МЛПК, чем референс-препараты митогенов. В связи с тем, что бактериальная поликомпонентная вакцина «Иммуновак ВП-4», содержащая в своем составе не только ЛПС, но и другие патоген-ассоциированные структуры условно-патогенных микроорганизмов, обладает способностью стимулировать киллерную активность МЛПК и ингибировать рост опухоли у мышей, она может рассматриваться как потенциально перспективный иммуномодулирующий препарат с противоопухолевой активностью.
Ключевые слова: бактериальная поликомпонентная вакцина «Иммуновак ВП-4», цитотоксическая активность, опухолевые клеточные линии К562 и Colo, меланома В16.
ENHANCEMENT OF CYTOTOXIC ACTIVITY OF HUMAN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS AND
INHIBITION OF TUMOR GROWTH IN MICE UNDER THE INFLUENCE OF BACTERIAL IMMUNOMODULATOR N.K. Akhmatova1, E.A. Lebedinskaya2, A.T. Akhmatov1, O.V Lebedinskaya2, F.V. Donenko3, M.V. Kiselevsky3 I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serums, RAMS, Moscow1 Perm State Medical Academy, Perm2 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS, Moscow3
The comparative study of the influence of vaccine Immunovac VP-4, bacterial lipopolysaccharides (LPS) and phytohemagglutinin (PHG) on cytotoxicity of human peripheral blood mononuclear leucocytes (PBML) with respect to NK-sensitive K562-cell line of leukemia and Colo-cell line of colorectal cancer has been undertaken. Dose-related effect of polycomponent vaccine (VP-4), LPS and PHG has been detected. Vaccine VP-4 has been shown to have more marked effect on PBML cytotoxicity than reference-agents of mitogens. Due to the fact that bacterial polycomponent vaccine Immunovac VP-4 containing not only LPS but also other pathogen-associated structures of conventionally pathogenic microorganisms is able to stimulate killer activity of PBML and to inhibit the tumor growth in mice, it can be considered as an effective immunomodulating agent with anti-tumor activity.
Key words: Bacterial polycomponent activity, K562- and Colo-cell lines, B16 melanoma.
Значительный прогресс в патогенетической номодулирующие препараты, регулирующие
терапии онкологических и инфекционных клеточные и молекулярные реакции организма
заболеваний обещают вновь созданные имму- [3, 4, 8]. Целесообразность применения бактери-
альных иммуномодуляторов в онкологической практике определяется наличием в их составе патоген-ассоциированных молекулярных структур (ПАМС), влияющих на различные звенья иммунной системы. Под действием бактериальных иммуномодуляторов происходит активация макрофагов, лимфоцитов, натуральных киллеров (НК) и других факторов естественной резистентности организма, супрессированных под влиянием опухолевого процесса, оперативного вмешательства, химио- и лучевой терапии [5, 7, 12]. Одним из таких препаратов является разработанная в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова бесклеточная поликомпо-нентная вакцина из антигенов условно-патогенных микроорганизмов Иммуновак-ВП-4.
Проведённые нами ранее исследования действия ВП-4 на эффекторную систему врождённого иммунитета показали, что она является индуктором созревания дендритных клеток, усиливая процессинг антигена, увеличивая экспрессию костимулирующих, адгезивных молекул и молекул антигенного представления, повышая продукцию противовоспалительных и регуляторных цитокинов, а также стимулирует активность НК-клеток [1]. Именно натуральным киллерам отводится ключевая роль в противоопухолевой защите, так как они способны уничтожать клетки-мишени с любыми нарушениями, в том числе и опухолевые клетки, без участия специфических рецепторов и главного комплекса гистосовместимости [9, 14].
Для оценки противоопухолевой активности иммуномодулирующих препаратов применяют методы, позволяющие определить in vitro уровень спонтанной и стимулированной ми-тогенами цитотоксичности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК). Использование митогенов дает возможность проводить сравнительное изучение стимулированной ими и исследуемыми иммуномодулирующими препаратами киллерной активности МЛПК по отношению к опухолевым клеткам-мишеням [6].
Цель работы - провести сравнительное исследование влияния бактериальной вакцины из антигенов условно-патогенных микроорганизмов и митогенов растительного и бактериального происхождения на цитотоксическую
активность мононуклеаров периферической крови здоровых доноров и оценить влияние вакцины ВП-4 на рост опухоли у мышей с меланомой В16.
Материал и методы
Мононуклеарные лейкоциты периферической крови (МЛПК) выделяли из стабилизированной гепарином (25 ед/мл) периферической крови 15 здоровых доноров. Кровь, разведенную в 2 раза средой 199, центрифугировали при 400 g в течение 30 мин в градиенте плотности фиколл-урографина (Pharmacia, плотностью 1,077 г/см3). Мононуклеарные лейкоциты, образовавшие интерфазное кольцо, собирали и трехкратно отмывали в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объёме среды клетки осаждали центрифугированием при 200 g.
Культивирование клеток К562 и Со1о. Клетки-мишени перевиваемой НК-чувствительной опухолевой линии К-562 (эритробластный лейкоз человека) и Со1о (колоректальный рак человека) культивировали в аналогичных условиях - среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 5 % фетальной сыворотки (ПанЭко, Россия) и 50 мкг/мл гентамицина при 370С в атмосфере 4 % СО2. Клетки НК-чувствительных опухолевых линий предоставлены лабораторией клеточного иммунитета Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина.
Препараты. В работе использовали Т-кле-точный митоген -фитогемагглютинин (ФГА) (ПанЭко, Россия), В-клеточные митогены - ЛПС Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli (Sigma, США), поликомпонентную вакцину Иммуно-вак- ВП-4 из антигенов условно-патогенных микроорганизмов (ГУ «НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН», патент № 2083223 от 27.05.94). Вакцина разрешена к применению в практике здравоохранения РФ парентеральным и интра-нозальным методами (Приказ МЗ РФ № 270 от 17.11.93), рекомендована для профилактики и терапии гнойно-воспалительных заболеваний.
Иммуновак-ВП-4 является оригинальным препаратом, в конструировании которого использованы антигенные компоненты, извлеченные из S. aureus, K.pneumoniae, Proteus vulgaris, E. coli. Для приготовления вакцины были селектированы штаммы, обладающие высокой
иммуногенной активностью, слабыми сенсибилизирующими свойствами и широкой перекрестной протективной активностью антигенов. Препарат не содержит консервантов и стабилизирующих добавок, включает пептидогликан и тейхоевые кислоты. ВП-4 является активным стимулятором иммунитета в отношении ряда этиологически значимых условно-патогенных микроорганизмов. Выявлено, что вакцина ВП-4 обладает как иммуномодулирующими свойствами, активируя естественные защитные механизмы, так и усиливает протективный иммунитет, предупреждает оппортунистические инфекции. Высокая степень защиты ВП-4 была установлена в многочисленных экспериментальных исследованиях на животных в отношении всех микроорганизмов, из антигенов которых готовился препарат. Терапевтический эффект ВП-4 установлен при некоторых хронических воспалительных и аллергических заболеваниях: абсцессе легкого, хроническом бронхите, бронхиальной астме у детей и взрослых, герпесе, пиодермиях. В работе использовали десятикратные разведения указанных препаратов в дозах от 10,0 до 0,01 мкг/мл, МЛПК инкубировали с различными концентрациями этих препаратов в течение 72 ч в 96-луночных микропланшетах (Costar, Франция) при 37 0С и 4 % СО2.
Цитотоксический тест. Для выявления цито-токсической активности клеток использовали тест восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест). Цитотоксическую активность МЛПК определяли на линии К-562 и Colo. Опухолевые клетки (3*104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с МЛПК в соотношениях 1:5; 1:2,5; 1:1 в плоскодонных 96-луночных микропланшетах (Costar, Франция) 18 ч при 37 0С и 4 % СО2. Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ (Sigma, США) и по оптической плотности, измеряемой на мультискане MS (Labsystem, Финляндия) при длине волны 540 нм, рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).
Противоопухолевое действие ВП-4 оценивали по торможению роста пигментной метастази-рующей опухоли В16 у мышей (по 20 животных в каждой группе). Штамм пигментной метаста-зирующей опухоли получен из лаборатории ком-
бинированных методов терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина (зав. лабораторией — д.м.н. Е.М. Трещалина). Опухолевые клетки меланомы В16 имплантировали мышам подкожно в область подмышечной впадины в количестве 5х105 клеток. Вакцину вводили в дозах 200 и 400 мкг внутрибрюшинно. Лечение начинали за 7 дней до имплантации опухоли, одновременно с ней и на 2-й день после имплантации. Визуально определяемые опухолевые узлы оценивали на 10, 15, 22-е сут после инокуляции.
Линейные размеры опухоли измеряли в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Объём считали по формуле V = A(B)2.
Торможение роста опухоли (ТРО, %) вычисляли по формуле
Vk-V
ТРО =------— ■ 100% ,
Vk
где V - средний объём опухоли в контрольной группе на определённый срок измерения (мм2);
Vo - средний объём опухоли в опытной группе на определенный срок измерения (мм2).
В качестве положительного эффекта учитывалось торможение роста опухоли более 50 %.
Статистическую обработку данных проводили с использованием i-критерия Стъюдента, применяя стандартный пакет статистических программ Windows 2000 (StatSoft 6.0), поскольку данный параметрический критерий обнаруживает наиболее выраженные эффекты. Данные представлены как M±m. Различия считались значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Стимулирующий эффект влияния исследуемой бактериальной вакцины на цитотоксиче-скую активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови сравнивали с действием неспецифических поликлональных активаторов: Т-клеточного митогена - ФГА и В-клеточных митогенов - ЛПС K. pneumoniae и E. coli.
Было установлено отсутствие прямого ци-тотоксического действия препаратов на опухолевые клетки Colo в концентрациях от 0,1 до 10,0 мкг/мл. Максимальная спонтанная киллерная активность МЛПК отмечалась при
Таблица 1
Влияние поликомпонентной вакцины ВП-4 и митогенов на цитотоксичность МЛПК здоровых доноров (п=15) по отношению к клеткам колоректального рака
Соотношение опухолевая клет-ка/МЛПК Спон- танная цитоток- сичность МЛПК Концентрация препарата, мкг/мл Цитотоксичность МЛПК (%) при внесении в среду культивирования опухолевых клеток Colo препаратов Достоверность различий между группами препаратов
ФГА ЛПС ВП-4
K. pneumoniae E. coli
1:5 38,0 ±1 ,0 10,0 85,4 ± 1,7** 73,0 ± 0,8** 75,1 ± 1,5** 87,5 ± 1,8** р4 и 2,3<0,001
1,0 73,8 ± 1,1** 50,9 ± 2,0** 53,1 ± 1,7** 74,9 ± 1,6** р4 и 2,3<0,001
0,1 45,2 ± 4,1* 42,5 ± 0,8* 44,0 ± 4,0* 46,6 ± 1,5* р4 и 1,2,3>0,05
1:2,5 32,6 ± 0,9 10,0 73,0 ± 1,6** 40,0 ± 1,6* 41,0 ± 1,3* 56,0 ± 1 9** р4 и 2 3<0,001 р, и 4<0,001
1,0 61,9 ± 2,1** 35,0 ± 1,0 33,8 ± 1,3 50,0 ± 1,6** р4 и 2,3<0,001 р. и 4<0,001
0,1 57,4 ± 0,5** 34,0 ± 1,3 33,0 ± 1,0 47,9 ± 2,5** р4 и 2,3<0,001 р1 и 4<0,01
1:1 20,9 ± 0,3 10,0 29,0 ± 0,7* 32,0 ± 0,72* 30,0 ± 1,5* 31,6 ± 0,7* р4 и 1,2,3>0,05
1,0 29,5 ± 0,5* 25,9 ± 5,6 26,9 ± 6,0 30,0 ± 0,35* р4 и 2 <0,001 р4 и 3<0,001
0,1 28,9 ± 1,7* 22,7 ± 0,72 22,6 ± 1,2 21,0 ± 1,8 р1 и 2,з,4<0,001
Примечание: * — р<0,01; ** — p<0,001, достоверность различий по сравнению с контролем.
отношении клетки мишени/ эффекторы - 1:5 (38,0 ± 1,0 %) (табл. 1). При данном соотношении клеток мишеней и эффекторов все исследуемые препараты во всех дозах оказывали наибольший стимулирующий эффект на цитотоксическую активность МЛПК. При меньших соотношениях (1:2,5; 1:1) достоверной стимулирующей активностью во всем диапазоне испытанных доз обладали бактериальная вакцина и ФГА, для ЛПС эффективной оказалась только наибольшая из концентраций (10 мкг/мл).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии прямого цитотокси-ческого действия препаратов на клетки-мишени и подтверждают их способность стимулировать цитотоксическое действие мононуклеарных лейкоцитов. Бактериальная поликомпонентная вакцина, содержащая в своем составе не только липополисахаридные комплексы, но и другие активные ПАМС, в большей степени, чем ЛПС, стимулирует цитотоксическую активность МЛПК.
На следующем этапе работы была изучена способность исследуемых препаратов индуцировать НК-активность МЛПК по отношению к клеткам линии К-562. На основании предыдущих исследований было выбрано наиболее оптимальное соотношение клеток-мишеней и клеток-эффекторов - 1:5 (табл. 2).
Введение в среду культивирования исследуемых препаратов в концентрациях 1,0 и 10,0 мкг/мл достоверно повышало уровень цитотоксичности МЛПК здоровых доноров по отношению к лейкозным клеткам-мишеням К562 (табл. 2). Максимальный цитотоксический эффект был получен при стимуляции МЛПК бактериальной вакциной ВП-4 (81,6 ± 5,4 %). Цитотоксическая активность в этом случае превышала таковую при введении в культуры и ФГА (р<0,01), и видовых ЛПС (р<0,05-0,001). При этом наблюдался дозозависимый эффект влияния ВП-4, ФГА и ЛПС на цитотоксичность МЛПК. В минимальной из испытанных концентраций (0,1 мкг/мл) усиление НК-активности
Таблица 2
Влияние поликомпонентной вакцины ВП-4 и митогенов на цитотоксическую активность МЛПК здоровых доноров (п=15) по отношению к клеткам К562
Концентрация препарата, мкг/мл Цитотоксичность МЛПК (%) по отношению к опухолевым клеткам К562 при внесении в среду культивирования препаратов Достоверность различий между іруппами препаратов
ФГА ЛПС ВП-4
K. pneumoniae E. coli
10 61,3 ±2,4** 58,1 ± 3,2** 58,0 ± 6,8** 81,6 ± 5,4** Р4И 2,3<0,05 р4и1 <0,01
1,0 61,6 ± 2,4** 56,7 ± 3,4** 52,7 ± 6,2* 80,3 ± 5,0** р4и 3<0,001 р4и1,2<0,01
0,1 53,6 ± 4,9* 37,0 ± 5,6 36,5 ± 4,7 60,4 ± 3,3** р4и 2,3<0,01
Примечание: спонтанная цитотоксичность МЛПК - 24,4 ± 4,0;
* - р<0,01; ** - р<0,001, достоверность различий по сравнению с контролем.
МЛПК по сравнению со спонтанной отмечено только при действии ФГА (р<0,01) и ВП-4 (р<0,-001). Следовательно, проведенное исследование показало преимущество ВП-4 по сравнению с ФГА, ЛПС K. pneumoniae и E. coli (в дозах от 0,1 до 10,0 мкг/мл) в отношении стимуляции цито-токсической активности МЛПК. Таким образом, бактериальная вакцина ВП-4 в большей степени, чем все испытанные митогенные референс-пре-параты, стимулировала киллерные свойства мононуклеарных лейкоцитов по отношению к НК-чувствительной линии клеток К562, причем достоверное повышение спонтанной НК-актив-ности выявлялось в дозах от 0,1 до 10 мкг/мл.
С учётом выраженного стимулирующего влияния вакцины ВП-4 на киллерную активность МЛПК были проведены исследования противоопухолевого действия данного препарата на мышах, привитых опухолевыми клетками меланомы В16. Как следует из данных, представленных в табл. 3, начиная с 10-х сут наблюдения отмечается торможение роста опухоли у животных, получивших вакцину ВП-4. При этом торможение роста опухоли при введении ВП-4 в дозе 200 мкг/мышь во все сроки наблюдения не достигало 50 % (30,1-41,1 %). В то же время у животных, получавших вакцину в дозе 400 мкг/мышь, процент торможения роста опухоли колебался от 61,5 до 69,3 %. Это позволяет говорить о наличии терапевтического эффекта вакцины в данной дозировке. Однако достоверного увеличения продолжительности жизни мышей, получавших вакцину в иссле-
дуемых дозах, по сравнению с контрольной группой животных не наблюдалось.
В проведенных ранее исследованиях было показано, что вакцина ВП-4, содержащая в своем составе ЛПС, ассоциированный с белком наружной мембраны грамотрицательных микроорганизмов, индуцирует созревание дендритных клеток, активирует различные субпопуляции лимфоцитов и обеспечивает длительный клинический эффект при заболеваниях, сопровождающихся снижением естественной резистентности организма [1, 2]. В настоящей работе дополнительно выявлены: дозозависимый эффект воздействия ВП-4 на киллерные свойства МЛПК доноров, а также ингибирующее действие на рост опухоли у мышей.
Известно, что естественные киллеры реагируют на митогены Т- и В-клеток [9-11]. Очевидно, механизм усиления цитотоксического эффекта под влиянием бактериальной вакцины несколько отличается от характера действия ЛПС. Можно предположить, что при этом происходит несколько процессов: во-первых, взаимодействие антигенов вакцины с ЛПС-ре-цепторами (CD14), содержащими в популяции МЛПК моноцитов/макрофагов, и последующая инициация секреции регуляторных цитокинов (IL-12, TNF и др.), а во-вторых, активация НК-клеток и Т-лимфоцитов под действием белковых компонентов вакцины [13].
Наличие противоопухолевой активности ВП-4 подтверждает её способность активировать НК-клетки, являющиеся основными эффекторами
Таблица 3
Влияние вакцины ВП-4 на рост меланомы В16 у мышей линии с57Bl/6 (n=10)
№ груп- пы Схема введения ВП-4 Доза ВП-4, мг/мышь Размер опухоли меланомы В16 в различные сроки после имплантации, сут
10 15 22
Объём опухоли, мм2 (M±m) ТРО, % Объём опухоли, мм2 (M±m) ТРО, % Объём опухоли, мм2 (M±m) ТРО, %
1 — — 1032,0 ± 71,2 - 3184,5 ± 104,3 - 5025,0 ± 173,8 -
2 3-кратно вну-трибрюшинно 200 мкг 721,3 ± 81,8 30,1 1904,3 ± 175,6* 40,2 2961,0 ± 175,4* 41,1
3 3-кратно вну-трибрюшинно 400 мкг 397,0 ± 53,7* 61,5 1093,6 ± 121,2* 65,6 1543,5 ± 120,2* 69,3
Примечание: * — р<0,01, достоверность различий по сравнению с контролем.
противоопухолевого иммунитета. В настоящее время для повышения эффективности противоопухолевой терапии испытываются различные иммунологические методы воздействия на организм больных. По мнению ряда авторов, рациональное сочетание химиотерапии и иммуномодуляторов микробного происхождения позволяет снижать дозу вводимого цитостатика и повышать эффективность терапии [3, 4].
Сложные механизмы клеточных и молекулярных взаимодействий при введении бактериальных поликомпонентных вакцин изучены в настоящее время недостаточно, что требует продолжения исследований в этом направлении для обоснования целесообразности их использования в практике клинической онкологии в качестве иммуномодулирующих препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В. и др. Особенности иммунофенотипа и функциональной активности дендритных клеток, генерированных из клеток эмбриональной печени мышей // Молекулярная медицина. 2005. № 2. С. 51-57.
2. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А. и др. Итоги экспериментального и клинического изучения поликомпонентной вакцины из антигенов условно-патогенных микроорганизмов // Журнал микробиологии. 1997. № 6. С. 96-101.
3. Катаев В.П. Изменения иммунной системы у больных колоректальным раком в условиях лимфотропной иммунокоррекции миелопидом // Медицинская иммунология.
2002. Т. 4, № 2. C. 298-298.
4. Короткова О.В., Заботина Т.Н., Артамонова Е.В. и др. Применение полиоксидония в лечении больных раком молочной железы // Медицинская иммунология. 2002. Т 4, № 2. C. 299.
5. Кузник Б.И., Витковский Ю.А., Гаймоленко И.Н. и др. Влияние иммуномодулирующей терапии на течение острых и хронических заболеваний легких у взрослых и детей // Медицинская иммунология. 2003. Т 5, № 3-4. С. 301.
6. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунная недостаточность (выявление и лечение). М.: Медицинская книга; Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2003. 443 с.
7. Медуницын М.В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 2004. 448 с.
8. ТутельянА.В. Иммуннорегуляторная оценка естественных и синтетических препаратов в системе прайминга лейкоцитов // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003. № 5 (12). С. 55-57.
9. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. С. 308-314.
10. Arase N., Arase H., Hirano S. et al. IgE-mediated activation of NK cells through Fc gamma RIII // J. Immunol. 2003. Vol. 15, № 6. P. 3054-3058.
11. Carlens S., Gilljam M., Chambers B. et at. A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells // Hum. Immunol. 2001. Vol. 62, №. 4. P. 1092-1098.
12. Dobrev P., Nikolova P., Stankova S. et al. Prophylaxix of broncho-pulmonary infections with the immunomodulator Respivax // Phnevmologia in ftiziatria. 1989. Vol. 26. P. 26-29.
13. Granucci F., Andrews DM., Degli-Espoti M.A. et al. IL-2 mediates adjuvant effect of dendritic cells // Tr. Immunol. 2002. Vol. 23. P. 169-171.
14. Maeda Y., Kimura Y. Antitumor effects of various low-mo-lecular-weight chitosans are due to increased natural killer activity of intestinal intraepithelial lymphocytes in sarcoma 180-bearing mice // J. Nature. 2004. Vol. 134, № 4. P. 945-950.
Поступила 17.11.06
