CC BY
90
УДК 615.277.3:616-006-018-092.4
. t, 1 1 12 2 Г. К. Герасимова , О. С. Жукова , Л.В. Фетисова , А.Ю. Барышников , Ю.Ю. Солодунов , Б.В. Страдомский
ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА «СТЕЛЛАНИН»
НА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
'ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва 2ООО «Фармпрепарат», Ростов-на -Дону
Контактная информация
Жукова Ольга Степановна, канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клеточного иммунитета НИИ ЭДиТО
адрес: 115478 Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499)612-89-54 e-mail: msvz@yandex. ru
Статья поступила 08.04.2013, принята к печати 01.11.2013
Резюме
Препарат «Стелланин®» (СТ) - оригинальная, зарегистрированная в РФ активная фармацевтическая субстанция, разработан фирмой ООО «Фармпрепарат». СТ обладает местной и системной антибактериальной активностью широкого спектра действия, а также противовоспалительным и регенерирующим действием. Активным веществом СТ является комплексное гетероциклическое йодсодержащее соединение 1,3-диэтилбензимидазолия трийодид (ДЭБИ-Т). В водных растворах из молекулы СТ происходит высвобождение активного (молекулярного) йода с образованием 1,3-дэтилбензимидазолия монойодида (ДЭБИ-М). Известно, что у некоторых противовоспалительных препаратов выявлено противоопухолевое действие. Задача настоящего исследования оценить прямое цитотоксическое действие СТ и его метаболита ДЭБИ-М на опухолевых клетках человека in vitro. Цитотоксическую активность тестируемых субстанций исследовали с помощью стандартного МТТ-теста. В результате исследования установлено, что СТ проявил прямое дозовозависимое цитотоксическое действие в отношении клеток РТК человека линии LS174T (IC50 = 10 мкМ при 2,5 ч инкубации). ДЭБИ-М проявил умеренную активность на клетках линии LS174T (IC50 = 330 мкМ). Результаты исследования цитотоксической активности СТ на культурах опухолевых клеток человека дают основание для изучения его противоопухолевой активности на перевиваемых опухолях животных.
Ключевые слова: препарат Стелланин, цитотоксическая активность, опухолевые клетки человека in vitro.
G.K. GerasimovaX O.S. Zhukova1, L.V. Fetisova1, A.Yu. Baryshnikov1, Yu.Yu. Solodunov2, B.V. Stradomsky2 CYTOTOXIC ACTIVITY OF STELLANIN ON HUMAN TUMOR CELL CULTURE
1FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
2«Pharmpreparat», Rostov-on-Don
Abstract
The drug Stellanin® (ST) is original substance designed by "Pharmpreparat" company. ST has local and system wide spectrum antibacterial activity, anti-inflammation and regenerating properties. Active component of ST is iodine-containing heterocyclic compound 1,3-diethylbenzimidazolium triiodide. In water solutions ST slowly releases active molecular of iodine with production of 1,3-diethylbenzimidazolium monoiodide (DEBI-M). It is known that some of antiinflammation drugs have anticancer effect. The purpose of this article is to estimate direct cytotoxic activity of ST and its metabolite DEBI-M on human tumor cells in vitro. MTT-test was used to estimate cytotoxic activity. It was shown that ST demonstrated cytotoxic activity on colon carcinoma LS174T cell line (IC50=10 mkM, 2,5 h of incubation) in dose-dependent manner. Cells LS174T demonstrated moderate sensitivity to DEBI-M (IC50=330 mkM). In accordance of the results of the present studying ST is recommended for the investigation of antitumor activity in vivo.
Keywords: drug Stellanin, cytotoxic activity, human Введение
Препарат «Стелланин ®» - оригинальная, зарегистрированная в РФ активная фармацевтическая субстанция, разработан фирмой ООО «Фармпрепарат», разрешен для практического применения. У препарата выявлена местная и системная антибактериальная активность широкого спектра действия, а также противовоспалительное и регенерирующее действие [4]. Активным веществом препарата СТ является комплексное гетероциклическое йодсо-держащее соединение 1,3-диэтилбензимидазолия трийодид (ДЭБИ-Т) в комплексе с медицинским поливинилпирролидоном низкомолекулярным (см. рис.). Компоненты препарата образуют прочный комплекс - молекулу СТ, из которой происходит
tumor cell in vitro.
высвобождение активного (молекулярного) йода. Механизм бактерицидного действия СТ основан на взаимодействии высвобождающегося йода с белками бактериальной стенки и ферментными белками микроорганизмов с образованием йодаминов, что приводит к денатурации белковых молекул. Однако существует предположение, что активность СТ может быть связана с действием 1,3-диэтилбензимидазолия монойодида (ДЭБИ-М), образующегося в результате метаболизма исходного 1,3-диэтилбензимидазолия трийо-дида (см. рис.). Противовоспалительное и регенерирующее действие СТ связывают с 1,3-диэтилбензимидазолием, т.к. этими свойствами обладает также соединение ДЭБИ-М, у которого отсутствует противомикробное действие [4]. Таким образом, наряду с антимикробным действием важ-
52 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯАКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА...
нейшим компонентом спектра фармакологической Метод основан на способности дегидрогеназ живых активности СТ является его выраженный противо- метаболически активных клеток восстанавливать воспалительный эффект. Экспериментально и кли- МТТ-реагент до голубых нерастворимых кристаллов нически показано, что последний развивается прак- формазана. Эксперименты выполнены с использова-тически сразу после его применения и обусловлен нием 96-луночных микропланшет. В начале экспери-влиянием на биосинтез модуляторов воспаления - мента клетки рассевали в лунки и выращивали в пол-простагландинов. Исследования показали, что при ной питательной среде в объеме 100 мкл при 37 °С и 5 действии СТ осуществляется ингибирование ак- % СО2 в атмосфере. Через 24 ч после посева в лунки тивности в ране фосфолипазы А2, под воздействи- добавляли одну из субстанций в определенной конем которой происходит разрушение мембранных центрации. В случае с СТ в связи с неустойчивостью фосфолипидов с высвобождением арахидоновой в водных растворах (см. выше) инкубация от 1 ч до кислоты [3]. Препарат ингибирует также актив- 2,5 ч достигалось путем замены инкубационной сре-ность следующего фермента в каскаде синетеза ды в лунках каждые 30 мин на свежеприготовленный простагландинов - циклооксигеназы-2, исполь- раствор в соответствующей концентрации ( 2-5 ма-зующей арахидоновую кислоту в качестве субстра- нипуляций соответственно). По окончании срока инта. Таким образом, СТ ингибирует ферменты био- кубации среду в лунках заменяли на полную пита-синтеза простагландинов, купируя индуцируемую тельную и инкубировали далее при тех же условиях. последними воспалительную реакцию пораженных Общее время инкубации во всех случаях составляло тканей. Доказано, что собственно антипростаглан- 72 ч. С контрольными пробами проделывали те же диновое, и, сле-довательно, противовоспалитель- манипуляции, что и с опытными, в отсутствие препа-ное действие СТ обусловлено активностью только рата. По окончании инкубации добавляли МТТ-катиона 1,3-диэтилбензимидазолия. Активный йод реагент в объеме 10 мкл в конечной концентрации в реализации данного эффекта не участвует [3]. 0,05 мкг/мл и инкубировали в течение 2 ч в условиях, В последние годы появилось много данных о указанных выше. наличии противоопухолевого действия у некото- Выпавшие кристаллы формазана растворяли рых противовоспалительных и противомикробных в 100 мкл ДМСО в течение 20 мин при 37 °С. Оп-препаратов. В доступных источниках литературы к тическое поглощение окрашенных растворов началу настоящих экспериментов не было найдено ДМСО, пропорциональное количеству живых кле-сведений о цитотоксической активности трийоди- ток в пробе, измеряли на счетчике оптического подов 1,2,3-триалкилбензимидазолия. Это явилось глощения Titertek Multiskan MCC/340 при X 540 нм. основанием для изучения цитотоксического дейст- Выживаемость клеток в % рассчитывали по отно-вия СТ в системе in vitro. шению величины оптического поглощения опыт-Задача исследования: оценка прямого цито- ных проб к контрольным пробам (без исследуемых токсического действия субстанции СТ и его мета- соединений) по формуле: болита ДЭБИ-М на опухолевых клетках человека in vitro. По B = (-) X 100%, где Материалы и методы Пк Субстанции препарата СТ - 1,3-диэтилбензимидазолия В - выживаемость; трийодид в комплексе с поливинилпирролидоном ПО - оптическое поглощение в опытных пробах; низкомолекулярным, его метаболита ПК - оптическое поглощение в контрольных пробах. 1,3-диэтилбензимидазолия монойодид и пиливи- нилпирролидон в виде порошков, хорошо раство- Цитотоксическую активность субстанций римых в водных средах, получены от фирмы ООО сравнивали по значению соответствующих IC50 ( «Фармпрепарат». концентрация, при которой оптическое поглощение Растворы всех тестируемых субстанций го- опытных растворов составляет 50 % от контроля), товили непосредственно перед экспериментом. вычисленной по кривой «доза - эффект». Парамет-В связи с тем, что в водном растворе концен- ры кривой получены на основании данных четырех трация СТ снижается через 30 мин на 50 % за счет параллельных измерений для каждой концентрации гидролиза, а также происходит ускорение инактива- в двух параллельных опытах. Ошибка измерений не ции в присутствии белков, его растворяли в среде превышает 5 %. RPMI-1640, не содержащей ЭСТ (безбелковая среда). Растворы ДЭБИ-М обладали устойчивостью Результаты в водных белоксодержащих растворах в течение нескольких часов в соответствии с паспортными Показано, что выживаемость клеток линии данными, представленными фирмой. Поэтому LS174T зависела от времени инкубации с СТ в кон-ДЭБИ-М растворяли в среде RPMI-1640, содержа- центрации 10 мкМ. В первые сутки эксперимента щей ЭСТ. экспозиция клеток с СТ снижала выживаемость В качестве объектов исследования использова- клеток до 63,5% через 2 ч инкубации, а через 2,5 ч ны линии опухолевых клеток человека: карцинома достигалось значение IC50. Добавление СТ на 2 су-толстой кишки LS174T, рак предстательной железы тки роста клеток еще на 2,5 ч снижало их выживае-DU145, немелкоклеточный рак легкого А549. Линии мость до 29,8 % (табл. 1), т.е. максимальный эф-клеток были получены из банка опухолевых культур фект наблюдался при 2-кратном добавлении СТ в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н Блохина» РАМН. Клетки вы- первый и второй дни роста клеток при суммарном ращивали на среде RPMI-1640, содержащей 10 % времени инкубации 5ч. ЭСТ и 0,32 мг/мл глутамина (полная питательная сре- Инкубация клеток линии DU145 с СТ в вы-да) при 37°С и 5 %-ном содержании СО2 в атмосфере. соких концентрациях 100-150 мкМ в течение 2,5 ч Цитотоксическую активность оценивали по выжи- в первый или в первый и второй дни эксперимента ваемости клеток в присутствии одной из тестируемых (2,5 ч х 2) вызывала снижение выживаемости кле-субстанций с помощью стандартного МТТ-теста [8]. ток до 54-60 %. При этом эффект не зависел от
№ 4/том 12/2013 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
концентрации и времени инкубации (табл. 2). Таким образом, СТ проявил цитотоксическую активность на клетках линии Ь8174Т после 2,5 ч инкубации в минимальной концентрации 10 мкМ. В отношении клеток линии БШ45 активность СТ можно оценить как пограничную.
Цитотоксическая активность субстанции ДЭБИ-М в высоких концентрациях - 100 мкМ., 330 мкМ и 1000 мкМ - была тестирована на клетках линий Ь8174Т, БШ45 и А549. В связи с тем, что ДЭБИ-М устойчив в водных растворах в течение нескольких часов (см. выше), р-ры в указанных концентрациях добавляли к клеткам однократно. Как видно из результатов, представленных в табл. 3, цитотоксическая активность ДЭБИ-М на клетках Ь8174Т зависела от концентрации, при этом значение 1С50 = 330 мкМ в 33 раза превышало значение, полученное для СТ в аналогичных экспериментах.
Клетки линий БШ45 и А549 были не чувствительны к действию ДЭБИ-М, т.к. значение 1С50 не было достигнуто в использованном диапазоне концентраций (1С50 > максимальной концентрации 1000 мкМ), при этом наблюдалось незначительное снижение выживаемости клеток линии А549 при отсутствии зависимости эффекта от концентрации.
ПВП в концентрации 1000 мкМ не влиял на выживаемость всех использованных линий клеток.
Обсуждение
Активным веществом препарата СТ является комплексное гетероциклическое йодсодержащее соединение ДЭБИ-Т. В структуре ДЭБИ-Т йод находится отчасти в молекулярном виде, отчасти в ионной форме: молекулярный йод (12) связан с анионом йода (I) и через него координационно с катионом 1,3-диэтилбензимидазолия (см. рис.). Таким образом, в молекуле ДЭБИ-Т присутствует молекулярный йод, который более защищен в организме, чем просто чистый молекулярный йод, и может перемещаться в крови до клеток-мишеней без преждевременного восстановления. В водных белковых растворах происходит быстрый гидролиз ДЭБИ-Т до ДЭБИ-М с отщеплением двух анионов йода. Этот процесс происходит также в крови при применении препарата у животных [2; 4].
В результате исследования установлено, что СТ проявил прямой цитотоксический эффект в отношении клеток линии Ь8174Т (1С50 = 10 мкМ при времени инкубации 2,5 ч) и пограничный - на клетках линии БШ45 (1С50=100-150 мкМ после 2,5 ч инкубации. Умеренно чувствительными к ДЭБИ-М оказались клетки линии Ь8174Т (1С50 = 330 мкМ). Клетки линий БШ45 и А549 были не чувствительны к ДЭБИ-М в данной постановке эксперимента.
Таблица 1
Зависимость выживаемости клеток линии Ь8174Т от времени инкубации со СТ в концентрации 10 мкМ при
№ Дни инкубации Время инкубации, ч, и число добавлений Выживаемость, % 1С50, мкМ
0,5 79,0
1 80,2
1 1 1,5 76,0
2 63,5
2,5 51,0 10
2 1 и 2 5 (2,5 х 2) 29,8
Таблица 2
Зависимость выживаемости клеток линии РЦ145 от времени инкубации с различными концентрациями СТ
№ Дни инкубации Концентрация мкМ и п добавлений Время инкубации, ч Выживаемость клеток, %
1 1 100 2,5 58,7
2 1 и 2 100 х 2 2,5 х 2 (5) 54,2
3 1 150 2,5 60,2
4 1 и 2 150 х 2 2,5 х 2 (5) 57,7
Таблица 3
Зависимость выживаемости клеток 3 линий от инкубации с различными концентрациями ДЭБИ-М_
Линия клеток Выживаемость клеток, % 1С50, мкМ
Концентрация, мкМ
100 330 1000
Ь8174Т 100 49,0 25,5 330
БШ45 100 90,0 81,5 >1000
А549 72,1 74,4 72,1 >1000
СН2СН3
СН2СН3
Рис. Структура
А: 1,3-Диэтилбензимидазолия трийодида; Б: 1,3-Диэтилбензимидазолия монойодида.
54
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯАКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА.
Если антимикробное действие СТ связывают с молекулярным (активным) йодом, медленно высвобождающемся из молекулы ДЭБИ-Т, то механизм его цитотоксического действия пока точно не известен. ДЭБИ-М не обладает антимикробным эффектом, однако проявил умеренную цитотокси-ческую активность в отношении клеток рака толстой кишки.
В работе [6] было исследовано действие трех производных йода (йодида, йодина и Д-йодолактона) на рост и индукцию апоптоза в клетках рака щитовидной железы человека линии В-СРАР и рака молочной железы линии МСР 7. Авторы установили, что скорость роста клеток В-СРАР не изменялась при действии йодида, но уменьшалась при высоких концентрациях молекулярного йода (100 и 500 мкМ) и низких концентрациях р-йодолактона (5 мкМ и 10 мкМ) до 82 % от контроля. Клетки других линий РТС-133 и 8505С были нечувствительны к действию всех трех производных йода. Авторы связали выявленный эффект с высокой активностью пероксидаз в клетках, в результате действия которых из молекулярного йода может образовываться р-йодолактон, который ин-гибирует пролиферацию и индуцирует апоптоз. Авторы полагают, что йодид может способствовать образованию йодолактона только в клетках, экс-прессирующих N18 и пероксидазы, в то время как молекулярный йод может способствовать образованию йодолактона только в присутствии пероксидаз. Таким образом, р-йодолактон является главным компонентом из тестированных соединений йода, способных тормозить рост и индуцировать апоптоз в клетках В-СРАР и МСР 7. Поскольку при системном применении СТ происходит высвобождение как молекулярного йода, так и йода в ионной форме, и эффект более выражен при длительном контакте опухолевых клеток с препаратом, то можно предположить, что цитотоксическое действия СТ в отношении рака толстой кишки также может реали-зовываться через подобный механизм. Однако тот факт, что ДЭБИ-М, из которого не происходит высвобождения молекулярного йода, также проявил избирательное умеренное цитотоксическое действие на клетках рака толстой кишки, может свиде-
тельствовать о более сложном механизме реализации цитотоксического эффекта. Исследования молекулярного механизма действия ДЭБИ-М показали, что он в высоких концентрациях тормозит рост клеток линий НЕр2 и А549, а также вызывает значимое увеличение экспрессии митохондриальной ДНК [1; 2]. В настоящее время доказано, что стимуляция функциональной активности митохондрий, находящихся во многих опухолевых клетках в неактивном состоянии, приводит к апоптозу и гибели опухолевых клеток [5; 7; 9].
Таким образом, одним из компонентов цито-токсического действия СТ в отношении опухолевых клеток является, по-видимому, активация метаболитом этого препарата - ДЭБИ-М митохондрий с последующим запуском апоптоза по митохондриаль-ному пути и гибелью клеток.
В результате проведенного исследования можно полагать, что цитотоксическое действие СТ связано с объединением биологической активности молекулярного йода и его метаболита ДЭБИ-М.
Поскольку обе исследованные субстанции проявили цитотоксическую активность в отношении клеток рака толстой кишки человека, можно прогнозировать чувствительность этого вида опухоли к препарату СТ.
Результаты исследования цитотоксической активности СТ на культурах опухолевых клеток человека дают основание для изучения его противоопухолевой активности на перевиваемых опухолях животных.
Выводы
1. Препарат СТ проявил цитотоксическую активность на клетках РТК человека линии Ь8174Т (1С50 = 10 мкМ, 2,5 ч инкубации)
2. ДЭБИ-М показал умеренную цитотокси-ческую активность на клетках линии Ь8174Т (1С50 = 3 3 0 мкМ).
На основании того, что обе исследованные субстанции проявили цитотоксическую активность в отношении клеток рака толстой кишки человека, можно прогнозировать чувствительность этого типа опухоли к СТ.
Литература
1. Двадненко К.В., Водолажский Д.И., Страдомский Б.В. Влияние 1,3-диэтилбензимидазолия йодида на ультраструктуру митохондрий клеток HEP2 // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины // Материалы IV Международной конференции. Ростов-на-Дону. - 2011. - С. 17-8.
2. Двадненко К.В., Страдомский Б.В., Водолажский Д.И. и др. Исследование механизмов регенеративной активности препарата «Стелланин» (1,3-диэтилбензимидазолия трийодид) // Известия Высших учебных заведений. СевероКавказский регион. Естественные науки. —2012. - №1. - С. 110-4.
3. Золотов Н.Н., Никушкина Н.Е., Колясникова К.Н. и др. Влияние 1,3-диэтилбензимидазолия трийодид (Стелланин) на активность дипептидилпептидазы IV (фактора CD26), фосфолипазы А-2 и экспрессию циклооксигеназы-2 // Материалы 5-ой международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». - 2010. - М. - С. 46.
4. Страдомский Б.В., Солодунов Ю.Ю., Лыкова Е.О. Экспериментальная и клиническая фармакология мазевых форм Стелланина (1,3.-диэтилбензимидазолия трийодида) // Книга. - Изд. НМЦ «Логос». - Ростов-на-Дону. - 2009. - С. 70.
5. Bonnet S., Archer S.L., Allalunis-Turner J. et al. A Mitochondria-K+ Channel Axis Is Suppressed in Cancer and Its Normalization Promotes Apoptosis and Inhibits Cancer Growth // Cancer Cell. —2007. - 11. - P. 37-51.
6. Gartner R., Rank P., Ander B. The role of iodine and S-iodolactone in growth and apoptosis of malignant thyroid epithelial cells and breast cancer cells // Hormones. - 2010. - 9(1). - P. 60-6.
7. Michelakis E.D., Webster L., Mackey J.R. Dichloroacetate (DCA) as a potential metabolic-targeting therapy for cancer // British Journal of Cancer. - 2008. - 99. - P. 989-94.
8. Mosmann T. Rapid Colorimetric assay for cellular growth and survival application proliferation and citotoxicity assay // J. of Immunological methods. - 1983. - 65. - P. 55-63.
9. Wong J.Y., Huggins G.S., Debidda M. et al. Dichloroacetate induces apoptosis in endometrial cancer cells // Gynecologic Oncology. - 2008. - 109(3). - P. 394-402.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
РТК - рак толстой кишки
ЭСТ - эмбриональная сыворотка теленка
